Выделение на основе проточной цитометрии и терапевтическая оценка инфильтрирующих опухоль лимфоцитов на мышиной модели рака поджелудочной железы

Резюме

Мы описываем метод использования инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs) от мышей с помощью проточной цитометрии для адоптивного переноса клеток. Этот протокол направлен на проверку специфической цитотоксичности TILs против опухолей в модели сингенного рака поджелудочной железы у мышей, что дает представление о разработке адоптивной клеточной терапии рака поджелудочной железы.

Аннотация

Рак поджелудочной железы является агрессивным злокачественным новообразованием с мрачным прогнозом и ограниченными терапевтическими возможностями. Адоптивная клеточная терапия, которая включает в себя изоляцию и активацию собственных иммунных клеток пациента, таких как инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TILs), перед их повторной инфузией, представляет собой многообещающий экспериментальный подход. Тем не менее, методы адоптивного переноса клеток в доклинических моделях рака поджелудочной железы недостаточно хорошо изучены. Здесь мы опишем подробный протокол адоптивной клеточной терапии с использованием TILs из модели сингенного рака поджелудочной железы у мыши. Процедура включает в себя имплантацию живых или облученных клеток рака поджелудочной железы мыши мышам-репортерам с флуоресцентной меткой для инициирования притока иммунных клеток, затем выделение лимфоцитов из первичных опухолей с помощью сортировки проточной цитометрии и/или активацию и расширение опухолеактивных Т-клеток ex vivo, а также адоптивный перенос этих активированных Т-клеток внутрибрюшинно мышам-носителям с опухолями с последующим введением интерлейкина-2. Биолюминесцентная визуализация опухолей позволяет проводить лонгитюдный мониторинг роста ортотопической опухоли и ответа на терапию, особенно оценивая опухолеспецифические цитотоксические эффекты. Этот подход обобщает логистику, связанную с разработкой адоптивной терапии переноса клеток для пациентов с раком поджелудочной железы. Результаты демонстрируют повышенную противоопухолевую эффективность адопуально перенесенных опухолевых Т-клеток по сравнению с нерелевантными лимфоцитами контрольной группы. Эта универсальная методология позволяет in vivo изучать адоптивную иммунотерапию при раке поджелудочной железы, а также оптимизировать параметры клеточного процессинга и комбинированные схемы лечения.

Введение

Иммунотерапия рака поджелудочной железы находится на начальной стадии, с продолжающимися доклиническими исследованиями и валидацией, в первую очередь на мышиных моделях¹. Современные методы лечения рака поджелудочной железы включают хирургическое вмешательство, химиотерапию, лучевую терапию и таргетную терапию. К сожалению, эти методы часто не позволяют полностью искоренить опухолевые образования, что приводит к рецидивам и прогрессированию. Традиционные методы лечения сосредоточены на опухолевых клетках, но часто упускают из виду опухолевое микроокружение (TME), которое включает в себя как опухолевые клетки, так и связанную с ними строму, состоящую из инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs), фибробластов и внеклеточного матрикса². TILs — это иммунные клетки в пределах TME, включая цитотоксические Т-клетки, хелперные Т-клетки, регуляторные Т-клетки, В-клетки, NK-клетки, макрофаги и миелоидные супрессорные клетки. Эти клетки участвуют в иммунных реакциях, которые влияют на рост опухоли и результаты лечения⁴.

Адоптивная клеточная терапия (ACT) включает в себя сбор иммунных клеток пациента, их модификацию и расширение in vitro, а затем повторное введение для нацеливания и уничтожения опухолевых клеток. TIL-терапия, разновидность АКТ, исследуется для лечения различных видов рака, включая меланому, рак легких и рак шейки матки. Этот процесс включает в себя выделение лимфоцитов из опухоли, культивирование их с помощью IL-2 in vitro и повторное вливание их пациенту, часто после лимфодеплеции с помощью^{химиотерапии или} лучевой терапии.

С тех пор, как исследование Розенберга 1986 года продемонстрировало эффективность TILs у мышей⁶, иммунотерапия с переносом адоптивных клеток стала горячей точкой исследований и показала многообещающие результаты^{в лечении рака.} Мы стремимся извлечь TILs у мышей, отсортировать их на наличие специфических Т-клеток с помощью проточной цитометрии и подтвердить их эффекты для уничтожения опухолей с помощью адоптивного переноса.

В этом протоколе мы описываем метод использования TILs от мышей с помощью проточной цитометрии для переноса адоптивных клеток. Цель состоит в том, чтобы проверить специфическую цитотоксичность TILs против опухолей на мышиной модели сингенного рака поджелудочной железы, что дает представление о разработке адоптивной клеточной терапии рака поджелудочной железы. Этот метод включает в себя имплантацию живых или облученных раковых клеток поджелудочной железы мышей с флуоресцентной меткой для инициирования притока иммунных клеток, выделение лимфоцитов из первичных опухолей с помощью сортировки проточной цитометрии или активацию и расширение опухолеактивных Т-клеток ex vivo, а также адоптивный перенос этих активированных Т-клеток мышам-носителям опухолей. Последующее введение интерлейкина-2 и биолюминесцентная визуализация опухоли позволяют проводить продольный мониторинг роста ортотопической опухоли и ответа на терапию, в частности, оценивать опухолеспецифичные цитотоксические эффекты. Этот подход обобщает логистику, связанную с разработкой адоптивной терапии переноса клеток для пациентов с раком поджелудочной железы. Результаты демонстрируют повышенную противоопухолевую эффективность адопуально перенесенных опухолевых Т-клеток по сравнению с нерелевантными лимфоцитами контрольной группы. Эта универсальная методология позволяет in vivo изучать адоптивную иммунотерапию при раке поджелудочной железы, а также оптимизировать параметры клеточного процессинга и комбинированные схемы лечения.

протокол

Мышиная колония содержится в учреждении, аккредитованном AAALAC International, в соответствии со всеми соответствующими правилами и стандартами USDA, HHS и NIH. Институт рака Тяньцзиньского медицинского университета и Комитет по уходу за животными и их использованию в больницах рассмотрели и одобрили все процедуры на животных, включая обоснование выбора штамма, распределение экспериментальных групп и статистическое обоснование численности животных и рандомизации.

1. Индукция опухоли

1. Используйте клеточную линию¹¹ KPC-Luc для индуцирования ортотопических опухолей поджелудочной железы у мышей.
2. Приготовьте клеточную суспензию путем трипсинизации клеток KPC-Luc, дважды промыв их PBS и ресуспендируя их в концентрации 1 x 10⁶ клеток/мл в PBS с 30% матрицей базальной мембраны (BMM).
3. Обезболите мышь изофлураном в индукционной дозе 4%, а затем переключитесь на поддерживающую дозу 2%. Обеспечьте тепловую поддержку с помощью грелки и контролируйте по мере необходимости. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
4. Продезинфицируйте операционную область несколько раз круговыми движениями с помощью скраба на основе йода и спирта. Перед операцией введите подкожную инъекцию карпрофена в дозе 5 мг/кг в качестве анальгезии. С помощью стерильного лезвия скальпеля выполните небольшой разрез левой брюшной полости (0,5-1 см) под левым ребром мыши, чтобы обнажить поджелудочную железу.
5. Используйте щипцы для удержания селезенки мыши и обнажения поджелудочной железы мыши, смешайте клетки и введите их в поджелудочную железу мыши из расчета 50 000 клеток на мышь. Введите 50 мкл клеточной суспензии непосредственно в поджелудочную железу с помощью иглы 29 G.
6. Верните поджелудочную железу мыши и последовательно зашите брюшину и кожу нитями.
7. Дайте мыши восстановиться на теплом коврике до полного пробуждения. Вводите 5 мг/кг карпрофена подкожно в качестве обезболивания после операции ежедневно в течение 3 дней.
8. Проведите визуализацию в реальном времени через 7 дней после инъекции для мониторинга роста опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно проводить лечение.
   1. Внутрибрюшинно введите мышке калийную соль D-люциферина (150 мкг/мл в PBS, 60 мкл на мышь).
   2. После анестезии изофлураном поместите мышь в систему визуализации in vivo для обнаружения биолюминесценции. После визуализации извлеките мышь из системы и дайте ей восстановиться после анестезии естественным путем.

2. Забор опухолей

1. Усыпьте мышей-доноров с помощью камеры CO₂ . Простерилизуйте все тело с помощью 75% этанола.
2. Поместите мышь в стерильный капюшон. Используйте стерильные ножницы и щипцы для вскрытия брюшной полости.
3. Удалите опухоли и поместите их в PBS на лед. Измерьте размер опухоли с помощью штангенциркуля и рассчитайте объем опухоли по формуле (π x длина × ширина × ширина)/6.

3. Опухолевое пищеварение

1. Приготовьте раствор для разложения, сделав 0,125 мг/мл коллагеназы, 0,125 мг/мл Dispase II и 10 мкг/мл ДНКазы I в RPMI 1640 в концентрации 1x. Добавьте 1-2 мл раствора для варки на лунку в 12-луночный планшет.
2. Измельчите опухоли на мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц. Расщепляйте кусочки опухоли при температуре 37°C с встряхиванием при 70 об/мин в течение 30 минут.

4. Сбор клеток

1. Прекратите пищеварение, добавив 2-4 мл 10% фетальной бычьей сыворотки. Переложите все клетки в пробирку для сбора.
2. Дважды промойте лунки PBS, чтобы собрать оставшиеся клетки. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр 40 μм или 70 μм.
3. Соберите клетки центрифугированием при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендируйте клетки в 5% BSA для окрашивания проточной цитометрией.

5. Подготовка к проточной цитометрии

1. Подготовьте мононуклеарные клетки селезенки или периферической крови (PBMC) от мышей без опухоли в качестве контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: PBMC от мышей с опухолями также могут быть использованы в качестве контроля.
2. Окрашивание клеток блокаторами Fc (<1 мкг на миллион клеток) и проточными антителами (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 в разведении 1:100).
3. Выдерживать на льду в темноте в течение 30 минут. Дважды промойте холодной PBS и повторно суспендируйте клетки в 1% BSA в PBS.

6. Сортировка клеток

1. Отсортируйте клетки CD45+CD3+ с помощью проточного цитометра. Вентильные живые клетки на основе FSC-A и SSC-A (P1). Затем гейтируют одиночные ячейки из P1 на основе FSC-A и FSC-H (P2).
2. Наконец, отсортируйте CD45+CD3+ из P2 с помощью CD45 и CD3-гейтинга и соберите их в сборные пробирки. Обеспечить надлежащую ресуспендию и поддержание жизнеспособности клеток во время сортировки.

7. Подготовка клеток к переносу

1. Центрифуга отсортировала ячейки при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендирование клеток в сыворотке крови мышей в конечной концентрации 1 x 10⁶ клеток/мл. Держите клетки на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть выполнено культивирование ex vivo или активация отсортированных клеток.

8. Усыновляющий трансфер

1. Выполните индукцию опухоли мыши-реципиенту за 7 дней до дня переноса.
2. Введите 2 x 10⁵ клеток на мышь внутрибрюшинно мышам-реципиентам с помощью инсулинового шприца 29 г x 1/2". Вводите IL-2 (50 МЕ на мышь) внутрибрюшинно в течение трех дней подряд.

9. Мониторинг опухолей

1. Выполняйте визуализацию в реальном времени на 4-й и 7-й день после переноса для оценки роста опухоли, с дополнительной визуализацией в реальном времени еженедельно с той же процедурой, описанной в шаге 1.8.
2. Следите за выживаемостью мышей-реципиентов. В конце эксперимента усыпьте мышь, как описано выше. Используйте офтальмологические ножницы и щипцы для удаления опухолей, а затем поместите их в PBS на лед для быстрого измерения размера опухоли и, возможно, продолжите последующие эксперименты по мере необходимости.

Результаты

Мыши-реципиенты разделены на семь групп для тщательной оценки эффективности переноса TIL: (a) Физиологический контроль (холостой контроль): мыши получают инъекции физиологического раствора в качестве исходного уровня. (b) Только IL-2 (холостой контроль): ?...

Обсуждение

Потенциальная иммунотерапия рака поджелудочной железы может усилить иммунную систему для нацеливания и уничтожения опухолевых клеток, включая адоптивную иммунотерапию, ингибиторы иммунных контрольных точек и противоопухолевые^{вакцины.} Терапия TIL извл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum	For monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin V	Solarbio	A8020	For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)	Jet	CSS013040	For filtering cell suspensions
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For cell collection and preparation
CO2 chamber	Tianjin Liliang	N/A	For euthanizing mice
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5138	For digestion solution
CD3-APC antibody	Biolegend	100236	For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibody	Biolegend	100154	For flow cytometry staining
C57BL/6 albino mice	Jackson Laboratory	58	Donor and recipient mice
Dispase II	Gibco	17105-041	For digestion solution
DNase I	SparkJade	AC1711	For digestion solution
D-Luciferin potassium salt	Beyotime	ST198-10g	For live imaging
Ethanol (75%)		N/A	For sterilization
Fc blockers	BD Biosciences	553142	For flow cytometry staining
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701	For cell culture
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria III	For cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)	PeproTech	200-02	For administration post-transfer
Isoflurane	Shandong Ante	N/A	For narcotism
KPC-Luc cell line	PI lab generated	N/A	For inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel Matrix	Corning	356234	For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Servicebio	G4207-500ML	For washing and resuspending cells
RPMI 1640 medium	Gibco	11875093	For preparing digestion solution
Sterile hood	ESCO	N/A	For sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forceps		N/A	For tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)	Jinhuan Medical	R413	For wound closure
Syringe	Jiangxi Fenglin	1 mL 0.45 × 16RWLB	For injection
Tissue culture plate 12 well	Jet	TCP001012	For tumor digestion