Isolamento basato sulla citometria a flusso e valutazione terapeutica dei linfociti infiltranti il tumore in un modello murino di carcinoma pancreatico

Riepilogo

Descriviamo un metodo per utilizzare i linfociti infiltranti il tumore (TIL) dai topi attraverso la citometria a flusso per il trasferimento di cellule adottive. Questo protocollo mira a verificare la citotossicità specifica dei TIL contro i tumori in un modello murino di carcinoma pancreatico singenico, fornendo informazioni sullo sviluppo di terapie cellulari adottive per il cancro del pancreas.

Abstract

Il cancro del pancreas è un tumore maligno aggressivo con una prognosi infausta e opzioni terapeutiche limitate. La terapia cellulare adottiva, che consiste nell'isolare e attivare le cellule immunitarie del paziente, come i linfociti infiltranti il tumore (TIL), prima di reinfrangerle, rappresenta un approccio sperimentale promettente. Tuttavia, le tecniche per il trasferimento di cellule adottive in modelli preclinici di cancro del pancreas non sono ben consolidate. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la terapia cellulare adottiva utilizzando TIL da un modello murino di cancro pancreatico singenico. La procedura prevede l'impianto di cellule tumorali pancreatiche di topo vive o irradiate in topi reporter marcati con fluorescenza per avviare l'afflusso di cellule immunitarie, quindi l'isolamento dei linfociti dai tumori primari tramite citometria a flusso e/o l'attivazione e l'espansione delle cellule T reattive al tumore ex vivo e il trasferimento adottivo di queste cellule T attivate per via intraperitoneale in topi portatori di tumore, seguito dalla somministrazione di interleuchina-2. L'imaging bioluminescente dei tumori consente il monitoraggio longitudinale della crescita del tumore ortotopico e della risposta alla terapia, in particolare valutando gli effetti citotossici specifici del tumore. Questo approccio ricapitola la logistica coinvolta nello sviluppo di terapie di trasferimento cellulare adottivo per i pazienti con cancro al pancreas. I risultati dimostrano una maggiore efficacia antitumorale delle cellule T reattive al tumore trasferite in modo adottivo rispetto ai controlli linfocitari irrilevanti. Questa metodologia versatile consente lo studio in vivo dell'immunoterapia adottiva nel cancro del pancreas, nonché l'ottimizzazione dei parametri di elaborazione cellulare e dei regimi di trattamento combinati.

Introduzione

L'immunoterapia del cancro al pancreas è nelle sue fasi iniziali, con un'esplorazione e una convalida precliniche in corso principalmente in modelli murini¹. Gli attuali trattamenti per il cancro del pancreas includono chirurgia, chemioterapia, radioterapia e terapie mirate. Sfortunatamente, questi metodi spesso non riescono a sradicare completamente le lesioni tumorali, portando a recidive e progressioni. I trattamenti tradizionali si concentrano sulle cellule tumorali, ma spesso trascurano il microambiente tumorale (TME), che comprende sia le cellule tumorali che lo stroma associato composto da linfociti infiltranti il tumore (TIL), fibroblasti e matrice extracellulare². I TIL sono cellule immunitarie all'interno della TME, tra cui le cellule T citotossiche, le cellule T helper, le cellule T regolatorie, le cellule B, le cellule NK, i macrofagi e le cellule soppressori di derivazione mieloide³. Queste cellule partecipano alle risposte immunitarie che influenzano la crescita del tumore e i risultati terapeutici⁴.

La terapia cellulare adottiva (ACT) prevede la raccolta delle cellule immunitarie di un paziente, la loro modifica ed espansione in vitro e quindi la loro reintroduzione per colpire e uccidere le cellule tumorali. La terapia TIL, un tipo di ACT, è oggetto di ricerca per il trattamento di vari tipi di cancro, tra cui il melanoma, il cancro ai polmoni e il cancro cervicale. Questo processo prevede l'isolamento dei linfociti dal tumore, la loro coltura con IL-2 in vitro e la loro reinfusione nel paziente, spesso dopo la linfodeplezione con chemioterapia o radioterapia⁵.

Da quando lo studio di Rosenberg del 1986 ha dimostrato l'efficacia dei TIL nei topi⁶, l'immunoterapia adottiva a trasferimento cellulare è diventata un punto caldo della ricerca e si è dimostrata promettente nel trattamento del cancro 7,8,9,10. Il nostro obiettivo è estrarre TIL dai topi, selezionarli per specifiche cellule T tramite citometria a flusso e convalidare i loro effetti di uccisione del tumore attraverso il trasferimento adottivo.

In questo protocollo, descriviamo un metodo per utilizzare i TIL dai topi attraverso la citometria a flusso per il trasferimento di cellule adottive. L'obiettivo è quello di verificare la citotossicità specifica dei TIL contro i tumori in un modello murino di carcinoma pancreatico singenico, fornendo informazioni sullo sviluppo di terapie cellulari adottive per il cancro del pancreas. Questo metodo include l'impianto di cellule tumorali pancreatiche di topo vive o irradiate in topi reporter marcati con fluorescenza per avviare l'afflusso di cellule immunitarie, l'isolamento dei linfociti dai tumori primari tramite smistamento con citometria a flusso o l'attivazione e l'espansione delle cellule T reattive al tumore ex vivo e il trasferimento adottivo di queste cellule T attivate in topi portatori di tumore. La successiva somministrazione di interleuchina-2 e imaging tumorale bioluminescente consente il monitoraggio longitudinale della crescita tumorale ortotopica e della risposta alla terapia, valutando in particolare gli effetti citotossici specifici del tumore. Questo approccio ricapitola la logistica coinvolta nello sviluppo di terapie di trasferimento cellulare adottivo per i pazienti con cancro al pancreas. I risultati dimostrano una maggiore efficacia antitumorale delle cellule T reattive al tumore trasferite in modo adottivo rispetto ai controlli linfocitari irrilevanti. Questa metodologia versatile consente lo studio in vivo dell'immunoterapia adottiva nel cancro del pancreas, nonché l'ottimizzazione dei parametri di elaborazione cellulare e dei regimi di trattamento combinati.

Protocollo

La colonia di topi è ospitata in una struttura accreditata AAALAC International, che aderisce a tutte le normative e gli standard USDA, HHS e NIH pertinenti. Il Tianjin Medical University Cancer Institute e il Comitato per la cura e l'uso degli animali ospedalieri hanno esaminato e approvato tutte le procedure sugli animali, comprese le motivazioni per la selezione dei ceppi, le assegnazioni dei gruppi sperimentali e la giustificazione statistica per il numero di animali e la randomizzazione.

1. Induzione tumorale

1. Utilizzare la linea cellulare KPC-Luc¹¹ per indurre tumori pancreatici ortotopici nei topi.
2. Preparare una sospensione cellulare tripsinizzando le cellule KPC-Luc, lavandole due volte con PBS e risospendendole a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL in PBS con una matrice di membrana basale (BMM) al 30%.
3. Anestetizzare il topo con isoflurano a una dose di induzione del 4% e poi passare a una dose di mantenimento del 2%. Fornire supporto termico utilizzando un termoforo e monitorare se necessario. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
4. Disinfettare l'area chirurgica più volte con un movimento circolare utilizzando sia uno scrub a base di iodio che alcol. Somministrare un'iniezione sottocutanea di carprofene 5 mg/kg come analgesia prima dell'intervento chirurgico. Utilizzando una lama di bisturi sterile, eseguire una piccola incisione addominale sinistra (0,5-1 cm) sotto la costola sinistra del topo per esporre il pancreas.
5. Usa una pinza per tenere la milza del topo ed esporre il pancreas del topo, mescola le cellule e iniettale nel pancreas del topo con 50.000 cellule per topo. Iniettare 50 μl di sospensione cellulare direttamente nel pancreas utilizzando un ago da 29 G.
6. Riportare il pancreas del topo e suturare in sequenza il peritoneo e la pelle con punti di sutura.
7. Lasciare che il mouse si riprenda su un pad caldo fino a quando non è completamente sveglio. Somministrare 5 mg/kg di carprofene per via sottocutanea come analgesia dopo l'intervento chirurgico ogni giorno per 3 giorni.
8. Eseguire l'imaging dal vivo 7 giorni dopo l'iniezione per monitorare la crescita del tumore.
   NOTA: I trattamenti possono essere somministrati in questa fase.
   1. Iniettare intraperitonealmente nel topo il sale di potassio D-Luciferina (150 μg/mL in PBS, 60 μL per topo).
   2. Dopo l'anestesia con isoflurano, posizionare il topo nel sistema di imaging in vivo per il rilevamento della bioluminescenza. Dopo l'imaging, rimuovere il mouse dal sistema e consentirgli di riprendersi dall'anestesia in modo naturale.

2. Raccogliere tumori

1. Eutanasia dei topi donatori utilizzando una camera di CO₂ . Sterilizzare tutto il corpo con etanolo al 75%.
2. Metti il mouse in una cappa sterile. Usa forbici e pinze sterili per aprire la cavità addominale.
3. Rimuovere i tumori e metterli in PBS su ghiaccio. Misurare le dimensioni del tumore con un calibro a corsoio e calcolare il volume del tumore utilizzando la formula (π x lunghezza × larghezza × larghezza)/6.

3. Digestione del tumore

1. Preparare la soluzione digestiva producendo 0,125 mg/ml di collagenasi, 0,125 mg/ml di dispasi II e 10 ug/ml di DNasi I in RPMI 1640 come concentrazione 1x. Aggiungere 1-2 ml di soluzione digestiva per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti.
2. Tritare i tumori in piccoli pezzi usando le forbici sterili. Digerire i pezzi tumorali a 37°C agitando a 70 giri/min per 30 minuti.

4. Raccolta di cellule

1. Terminare la digestione aggiungendo 2-4 ml di siero fetale bovino al 10%. Trasferire tutte le cellule in una provetta di raccolta.
2. Lavare i pozzetti con PBS due volte per raccogliere le cellule rimanenti. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm o 70 μm.
3. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule in BSA al 5% per la colorazione con citometria a flusso.

5. Preparazione della citometria a flusso

1. Preparare la milza o le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da topi non portatori di tumore come controlli.
   NOTA: Opzionale: le PBMC di topi portatori di tumore possono essere utilizzate anche come controlli.
2. Colorare le cellule con bloccanti Fc (<1 μg per milione di cellule) e anticorpi di flusso (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 a una diluizione 1:100).
3. Incubare su ghiaccio al buio per 30 min. Lavare due volte con PBS freddo e risospendere le cellule in 1% BSA in PBS.

6. Smistamento cellulare

1. Ordinare le cellule CD45+CD3+ utilizzando un citometro a flusso. Cellule vive gate basate su FSC-A e SSC-A (P1). Quindi, gate singole celle da P1 in base a FSC-A e FSC-H (P2).
2. Infine, separare CD45+CD3+ da P2 utilizzando il gating CD45 e CD3 e raccoglierli nelle provette di raccolta. Garantire una corretta risospensione e il mantenimento della vitalità cellulare durante la selezione.

7. Preparazione delle cellule per il trasferimento

1. Centrifugare le celle selezionate a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule nel siero di topo a una concentrazione finale di 1 x 10⁶ cellule/mL. Mantieni le celle sul ghiaccio.
   NOTA: Può essere eseguita una coltura ex vivo o l'attivazione delle cellule selezionate.

8. Trasferimento adottivo

1. Eseguire l'induzione del tumore per il topo ricevente 7 giorni prima del giorno del trasferimento.
2. Iniettare 2 x 10⁵ cellule per topo per via intraperitoneale nei topi riceventi utilizzando una siringa da insulina da 29 G x 1/2". Somministrare IL-2 (50 UI per topo) per via intraperitoneale per tre giorni consecutivi.

9. Monitoraggio dei tumori

1. Eseguire l'imaging dal vivo il giorno 4 e il giorno 7 dopo il trasferimento per valutare la crescita del tumore, con ulteriori immagini dal vivo settimanali con la stessa procedura descritta al passaggio 1.8.
2. Follow-up della sopravvivenza dei topi riceventi. Al termine dell'esperimento, sopprimere il topo come descritto sopra. Utilizzare forbici oftalmiche e pinze per rimuovere i tumori, quindi posizionarli in PBS su ghiaccio per una rapida misurazione delle dimensioni del tumore e continuare gli esperimenti successivi secondo necessità.

Risultati

I topi riceventi sono divisi in sette gruppi per valutare a fondo l'efficacia del trasferimento TIL: (a) Controllo salino (controllo in bianco): topi che ricevono iniezioni di soluzione salina come linea di base. (b) Solo IL-2 (controllo in bianco): Topi che ricevono iniezioni di IL-2 per tenere conto di eventuali effetti della sola citochina. (c) Lo stesso trattamento singolo dei topi donatori trattati (controllo positivo): topi che ricevono lo stesso tr...

Discussione

L'immunoterapia per il cancro del pancreas può migliorare il sistema immunitario per colpire ed eliminare le cellule tumorali, coinvolgendo l'immunoterapia adottiva, gli inibitori del checkpoint immunitario e i vaccini antitumorali¹². La terapia TIL estrae ed espande i linfociti dai tumori, che vengono poi reinfusi nei pazienti. Rispetto ad altre terapie cellulari adottive, la terapia TIL ha una diversa clonalità TCR, una capacità di homing tumorale superiore e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum	For monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin V	Solarbio	A8020	For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)	Jet	CSS013040	For filtering cell suspensions
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For cell collection and preparation
CO2 chamber	Tianjin Liliang	N/A	For euthanizing mice
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5138	For digestion solution
CD3-APC antibody	Biolegend	100236	For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibody	Biolegend	100154	For flow cytometry staining
C57BL/6 albino mice	Jackson Laboratory	58	Donor and recipient mice
Dispase II	Gibco	17105-041	For digestion solution
DNase I	SparkJade	AC1711	For digestion solution
D-Luciferin potassium salt	Beyotime	ST198-10g	For live imaging
Ethanol (75%)		N/A	For sterilization
Fc blockers	BD Biosciences	553142	For flow cytometry staining
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701	For cell culture
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria III	For cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)	PeproTech	200-02	For administration post-transfer
Isoflurane	Shandong Ante	N/A	For narcotism
KPC-Luc cell line	PI lab generated	N/A	For inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel Matrix	Corning	356234	For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Servicebio	G4207-500ML	For washing and resuspending cells
RPMI 1640 medium	Gibco	11875093	For preparing digestion solution
Sterile hood	ESCO	N/A	For sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forceps		N/A	For tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)	Jinhuan Medical	R413	For wound closure
Syringe	Jiangxi Fenglin	1 mL 0.45 × 16RWLB	For injection
Tissue culture plate 12 well	Jet	TCP001012	For tumor digestion