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要約

マウスの腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をフローサイトメトリーを通じて養子細胞移植に利用する方法について説明します。このプロトコルは、同系膵臓がんマウスモデルにおける腫瘍に対するTILの特異的細胞毒性を検証することを目的としており、膵臓がんの養子細胞療法の開発に関する洞察を提供します。

要約

膵臓がんは、予後が悪く、治療の選択肢が限られている侵攻性の悪性腫瘍です。養子細胞療法は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの患者自身の免疫細胞を再注入する前に分離して活性化することを含み、有望な実験的アプローチを表しています。しかし、前臨床膵臓がんモデルにおける養子細胞移植の技術は十分に確立されていません。ここでは、同系膵臓がんマウスモデル由来のTILを用いた養子細胞療法の詳細なプロトコールについて述べます。この手順では、蛍光標識レポーターマウスに生きたマウスまたは照射したマウスの膵臓がん細胞を移植して免疫細胞の流入を開始し、次にフローサイトメトリーによる選別および/または腫瘍反応性T細胞 をex vivoで活性化および拡大することにより原発腫瘍からリンパ球を単離し、これらの活性化T細胞を腹腔内に養子として腫瘍担持マウスに移し、続いてインターロイキン-2を投与します。生物発光腫瘍イメージングは、同所性腫瘍の成長と治療に対する反応の縦断的モニタリング、特に腫瘍特異的な細胞傷害性効果の評価を可能にします。このアプローチは、膵臓がん患者のための養子細胞移植療法の開発に伴うロジスティクスを要約しています。この結果は、養子移植された腫瘍反応性T細胞の抗腫瘍効果が、無関係なリンパ球対照と比較して向上していることを示しています。この汎用性の高い方法論により、膵臓がんにおける養子免疫療法の in vivo 研究、細胞処理パラメータの最適化、併用治療レジメンの最適化が可能になります。

概要

膵臓がん免疫療法は初期段階にあり、主にマウスモデルで前臨床の探索と検証が進行中です1。膵臓がんの現在の治療法には、手術、化学療法、放射線療法、および標的療法が含まれます。残念ながら、これらの方法では腫瘍病変を完全に根絶できないことが多く、再発や進行につながります。従来の治療法は腫瘍細胞に焦点を当てていますが、腫瘍細胞と腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、線維芽細胞、および細胞外マトリックスで構成される関連間質の両方を含む腫瘍微小環境(TME)を見落としがちです2。TILは、TME内の免疫細胞であり、細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞、制御性T細胞、B細胞、NK細胞、マクロファージ、および骨髄由来サプレッサー細胞3が含まれます。これらの細胞は、腫瘍の成長と治療結果に影響を与える免疫応答に関与しています4。

養子細胞療法(ACT)では、患者の免疫細胞を採取し、 in vitroでそれらを改変および増殖させ、腫瘍細胞を標的にして殺傷するためにそれらを再導入します。ACTの一種であるTIL療法は、メラノーマ、肺がん、子宮頸がんなど、さまざまながんの治療のために研究されています。このプロセスには、腫瘍からリンパ球を単離し、 in vitroでIL-2で培養し、多くの場合、化学療法または放射線療法によるリンパ球除去後に患者に再注入することが含まれます5。

Rosenbergの1986年の研究がマウスにおけるTILの有効性を実証して以来6、養子細胞移植免疫療法は研究のホットスポットとなり、がん治療において有望であることが示されています7,8,9,10。私たちは、マウスからTILを抽出し、フローサイトメトリーを介して特定のT細胞に選別し、養子移入を通じてそれらの腫瘍殺傷効果を検証することを目指しています。

このプロトコルでは、マウスのTILをフローサイトメトリーを通じて養子細胞移植に利用する方法について説明します。目標は、同系膵臓がんマウスモデルにおける腫瘍に対するTILの特異的細胞毒性を検証し、膵臓がんの養子細胞療法の開発に関する洞察を提供することです。この方法には、蛍光標識レポーターマウスに生または照射したマウス膵臓がん細胞を移植して免疫細胞の流入を開始すること、フローサイトメトリーソーティングによる原発腫瘍からのリンパ球の単離、または腫瘍反応性T細胞 をex vivoで活性化および増殖させ、これらの活性化T細胞を担腫瘍マウスに養子として移植することが含まれる。その後のインターロイキン-2の投与と生物発光性腫瘍イメージングにより、同所性腫瘍の成長と治療に対する反応の縦断的モニタリング、特に腫瘍特異的な細胞毒性効果の評価が可能になります。このアプローチは、膵臓がん患者のための養子細胞移植療法の開発に伴うロジスティクスを要約しています。この結果は、養子移植された腫瘍反応性T細胞の抗腫瘍効果が、無関係なリンパ球対照と比較して向上していることを示しています。この汎用性の高い方法論により、膵臓がんにおける養子免疫療法の in vivo 研究、細胞処理パラメータと併用治療レジメンの最適化が可能になります。

プロトコル

マウスコロニーは、AAALACインターナショナル認定施設に収容されており、関連するすべてのUSDA、HHS、およびNIHの規制と基準に準拠しています。天津医科大学がん研究所と病院動物管理・使用委員会は、系統選択の理論的根拠、実験グループの割り当て、動物数と無作為化の統計的正当性など、すべての動物手順を審査し、承認しました。

1.腫瘍導入

  1. KPC-Luc細胞株11 を使用して、マウスに同所性膵臓腫瘍を誘導します。
  2. KPC-Luc細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗浄し、30%基底膜マトリックス(BMM)を使用してPBSで1 x 106 細胞/mLの濃度で再懸濁することにより、細胞懸濁液を調製します。
  3. マウスにイソフルランで麻酔を4%の誘導用量で投与し、その後、維持用量を2%に切り替えます。必要に応じて、加熱パッドとモニターを使用して熱サポートを提供します。両眼に眼軟膏を塗布し、乾燥を防ぎます。
  4. ヨウ素ベースのスクラブとアルコールの両方を使用して、手術部位を円を描くように複数回消毒します。手術前に鎮痛剤としてカルプロフェン5 mg / kgの皮下注射を投与します。.滅菌メスの刃を使用して、マウスの左肋骨の下に小さな左腹部切開(0.5〜1 cm)を行い、膵臓を露出させます。
  5. 鉗子を使用してマウスの脾臓を保持し、マウスの膵臓を露出させ、細胞を混合してマウスの膵臓にマウスあたり50,000個の細胞を注入します。29 Gの針を使用して、50 μLの細胞懸濁液を膵臓に直接注入します。
  6. マウスの膵臓を戻し、腹膜と皮膚を縫合糸で順次縫合します。
  7. マウスが完全に起動するまで、暖かいパッドで回復させます。手術後、鎮痛剤として5 mg / kgのカルプロフェンを毎日3日間皮下投与します。.
  8. 注射後7日でライブイメージングを行い、腫瘍の成長をモニタリングします。
    注:このステップで治療を行うことができます。.
    1. マウスにD-ルシフェリンカリウム塩(PBSで150μg / mL、マウスあたり60μL)を腹腔内注射します。.
    2. イソフルラン麻酔後、マウスを 生体 内イメージングシステムに配置して生物発光を検出します。イメージング後、マウスをシステムから取り外し、麻酔から自然に回復させます。

2.腫瘍を採取します

  1. CO2 チャンバーを使用してドナーマウスを安楽死させます。全身を75%エタノールで滅菌します。
  2. マウスを滅菌フードに入れます。滅菌ハサミと鉗子を使用して腹腔を開きます。
  3. 腫瘍を切除し、氷上のPBSに入れます。ノギスで腫瘍の大きさを測定し、式(π×長さ×幅×幅)/6で腫瘍体積を計算します。

3. 腫瘍の消化

  1. 0.125 mg/mL コラゲナーゼ、0.125 mg/mL ディスパーゼ II、および 10 ug/ml DNase I を RPMI 1640 中で 1x 濃度として調製し、消化液を調製します。1ウェルあたり1〜2 mLの消化溶液を12ウェルプレートに添加します。
  2. 滅菌ハサミを使用して腫瘍を細かく刻みます。腫瘍片を37°Cで70rpmで30分間振とうしながら消化します。

4. 細胞採取

  1. 2〜4mLの10%ウシ胎児血清を加えて消化を終了します。.すべての細胞をコレクションチューブに移します。
  2. ウェルをPBSで2回洗浄して、残っている細胞を収集します。細胞懸濁液を40 μmまたは70 μmのセルストレーナーでろ過します。
  3. 細胞を400 x g で4°C、5分間遠心分離して回収します。 細胞を5% BSAに再懸濁して、フローサイトメトリー染色を行います。

5. フローサイトメトリーの調製

  1. 対照として、非腫瘍担持マウスから脾臓または末梢血単核細胞(PBMC)を調製します。
    注:オプション:担腫瘍マウス由来のPBMCもコントロールとして使用できます。
  2. Fcブロッカー(細胞100万個あたり< μg)およびフロー抗体(CD3-APC、CD45-APC/Fire750、希釈率1:100)で細胞を染色します。
  3. 暗闇の中で氷上で30分間インキュベートします。冷たくしたPBSで2回洗浄し、PBS中の1%BSAに細胞を再懸濁します。

6. 細胞選別

  1. フローサイトメーターを使用してCD45+CD3+細胞を選別します。FSC-AおよびSSC-A(P1)に基づく生細胞のゲート。次に、FSC-AおよびFSC-H(P2)に基づいてP1からシングルセルをゲートします。
  2. 最後に、CD45およびCD3ゲーティングを使用してP2からCD45 + CD3+を選別し、それらを収集チューブに収集します。ソーティング中の細胞生存率の適切な再懸濁と維持を確保します。

7. 移管用細胞調製

  1. 選別した細胞を400 x g で4°C、5分間遠心分離します。 マウス血清中の細胞を最終濃度1 x 106 細胞/mLに再懸濁します。細胞を氷の上に保ちます。
    注:選別された細胞の ex vivo 培養または活性化を行い得る。

8. 養子縁組の譲渡

  1. 移植日の7日前にレシピエントマウスの腫瘍導入を行います。
  2. 29 G x 1/2インチインスリン注射器を使用して、マウスあたり2 x 105 細胞をレシピエントマウスに腹腔内に注入します。IL-2(マウスあたり50IU)を3日間連続して腹腔内投与します。

9. 腫瘍モニタリング

  1. 移植後 4 日目と 7 日目にライブ イメージングを実施して腫瘍の成長を評価し、ステップ 1.8 で説明したのと同じ手順で毎週追加のライブ イメージングを行います。
  2. レシピエントマウスの生存をフォローアップします。実験の最後に、上記のようにマウスを安楽死させます。眼科用ハサミと鉗子を使用して腫瘍を切除し、氷上のPBSに腫瘍のサイズをすばやく測定し、必要に応じてその後の実験を続けることができます。

結果

レシピエントマウスは、TIL転写の有効性を徹底的に評価するために7つのグループに分けられます:(a)生理食塩水コントロール(ブランクコントロール):ベースラインとして機能する生理食塩水注射を受けているマウス。(b)IL-2のみ(ブランクコントロール):サイトカイン単独の影響を説明するためにIL-2注射を受けたマウス。(c)治療を受けたドナー?...

ディスカッション

膵臓がんに対する潜在的な免疫療法は、養子免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍ワクチン12を含む、腫瘍細胞を標的にして排除するための免疫系を強化する可能性があります。TIL療法は、腫瘍からリンパ球を抽出して拡大し、その後、患者に再注入します。TIL療法は、他の養子細胞療法と比較して、TCRクローナリティが多様で、腫?...

開示事項

著者は、利益相反がないと宣言しています。ChatGPTとClaude-3を言語編集に使用しながら、著者はChatGPTまたはClaude-3によって生成された単語と文章を慎重にレビューし、検証してから記事に掲載しました。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(NSFC)の助成金、助成金番号82272767およびY.M.への82072691によって資金提供されました。著者は、チームメンバーの議論と協力に感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioluminescent imaging systemPerkinElmerIVIS SpectrumFor monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin VSolarbioA8020For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)JetCSS013040For filtering cell suspensions
CentrifugeEppendorf5810RFor cell collection and preparation
CO2 chamberTianjin LiliangN/AFor euthanizing mice
CollagenaseSigma-AldrichC5138For digestion solution
CD3-APC antibodyBiolegend100236For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibodyBiolegend100154For flow cytometry staining
C57BL/6 albino miceJackson Laboratory58Donor and recipient mice
Dispase IIGibco17105-041For digestion solution
DNase ISparkJadeAC1711For digestion solution
D-Luciferin potassium saltBeyotimeST198-10gFor live imaging
Ethanol (75%)N/AFor sterilization
Fc blockersBD Biosciences553142For flow cytometry staining
Fetal Bovine SerumGibcoA5669701For cell culture
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAria IIIFor cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)PeproTech200-02For administration post-transfer
IsofluraneShandong AnteN/AFor narcotism
KPC-Luc cell linePI lab generatedN/AFor inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel MatrixCorning356234For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)ServicebioG4207-500MLFor washing and resuspending cells
RPMI 1640 mediumGibco11875093For preparing digestion solution
Sterile hoodESCON/AFor sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forcepsN/AFor tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)Jinhuan MedicalR413For wound closure
SyringeJiangxi Fenglin1 mL 0.45 × 16RWLBFor injection
Tissue culture plate 12 wellJetTCP001012For tumor digestion

参考文献

  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al. Targeting the tumor microenvironment: Removing obstruction to anticancer immune responses and immunotherapy. Ann Oncol. 27 (8), 1482-1492 (2016).
  3. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: Understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 17 (8), 807-821 (2020).
  4. Tay, C., Tanaka, A., Sakaguchi, S. Tumor-infiltrating regulatory t cells as targets of cancer immunotherapy. Cancer Cell. 41 (3), 450-465 (2023).
  5. Betof Warner, A., et al. Expert consensus guidelines on management and best practices for tumor-infiltrating lymphocyte cell therapy. J Immunother Cancer. 2 (2), e008735 (2024).
  6. Rosenberg, S. A., Spiess, P., Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science. 233 (4770), 1318-1321 (1986).
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