Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה לניצול לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) מעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה להעברת תאים מאמצים. פרוטוקול זה נועד לאמת את הציטוטוקסיות הספציפית של TIL כנגד גידולים במודל עכברי סרטן הלבלב סינגני, ולספק תובנות לגבי התפתחות טיפולים תאיים מאמצים לסרטן הלבלב.

Abstract

סרטן הלבלב הוא ממאירות אגרסיבית עם פרוגנוזה עגומה ואפשרויות טיפוליות מוגבלות. טיפול בתאים מאמצים, הכולל בידוד והפעלה של תאי החיסון של המטופל עצמו, כגון לימפוציטים חודרים לגידול (TILs), לפני החדרתם מחדש, מייצג גישה ניסיונית מבטיחה. עם זאת, טכניקות להעברת תאים מאמצים במודלים פרה-קליניים של סרטן הלבלב אינן מבוססות היטב. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לטיפול תאי מאמץ באמצעות TIL ממודל עכבר סרטן הלבלב סינגני. ההליך כולל השתלת תאי סרטן לבלב של עכברים חיים או מוקרנים בעכברים מדווחים המסומנים בפלואורסצנטיות כדי ליזום זרם של תאי חיסון, ולאחר מכן בידוד לימפוציטים מגידולים ראשוניים באמצעות מיון ציטומטריית זרימה ו/או הפעלה והרחבה של תאי T תגובתיים-גידול ex vivo, והעברה אימוץ של תאי T מופעלים אלה תוך צפקית לעכברים נושאי גידול, ולאחר מכן מתן אינטרלוקין-2. הדמיית גידול ביולומינסנט מאפשרת ניטור אורך של צמיחת הגידול האורתוטופי והתגובה לטיפול, במיוחד הערכת ההשפעות הציטוטוקסיות הספציפיות לגידול. גישה זו מסכמת את הלוגיסטיקה הכרוכה בפיתוח טיפולי העברת תאים מאמצים לחולי סרטן הלבלב. התוצאות מדגימות יעילות אנטי-גידולית משופרת של תאי T מגיבים לגידול שהועברו באימוץ בהשוואה לבקרות לימפוציטים לא רלוונטיות. מתודולוגיה רב-תכליתית זו מאפשרת מחקר in vivo של אימונותרפיה מאמצת בסרטן הלבלב וכן אופטימיזציה של פרמטרים של עיבוד תאים ומשטרי טיפול משולבים.

Introduction

אימונותרפיה של סרטן הלבלב נמצאת בשלבי ההתחלה שלה, עם חקירה ואימות פרה-קליניים מתמשכים בעיקר במודלים של עכברים1. הטיפולים הנוכחיים בסרטן הלבלב כוללים ניתוח, כימותרפיה, הקרנות וטיפולים ממוקדים. למרבה הצער, שיטות אלו לרוב אינן מצליחות למגר לחלוטין את נגעי הגידול, מה שמוביל להישנות והתקדמות. טיפולים מסורתיים מתמקדים בתאי גידול אך לעתים קרובות מתעלמים מהמיקרו-סביבה של הגידול (TME), הכוללת גם תאי גידול וגם סטרומה קשורה המורכבת מלימפוציטים חודרים לגידול (TILs), פיברובלסטים ומטריצה חוץ-תאית2. TIL הם תאים חיסוניים בתוך ה-TME, כולל תאי T ציטוטוקסיים, תאי T מסייעים, תאי T רגולטוריים, תאי B, תאי NK, מקרופאגים ותאים מדכאים שמקורם במיאלואיד3. תאים אלה משתתפים בתגובות חיסוניות המשפיעות על צמיחת הגידול ועל התוצאות הטיפוליות4.

טיפול בתאים מאמצים (ACT) כולל איסוף תאי החיסון של המטופל, שינוי והרחבתם במבחנה, ולאחר מכן החדרתם מחדש כדי למקד ולהרוג תאי גידול. טיפול TIL, סוג של ACT, נחקר לטיפול בסוגי סרטן שונים, כולל מלנומה, סרטן ריאות וסרטן צוואר הרחם. תהליך זה כולל בידוד לימפוציטים מהגידול, תרביתם עם IL-2 במבחנה והחדרתם מחדש למטופל, לעתים קרובות לאחר דלדול הלימפה עם כימותרפיה או רדיותרפיה5.

מאז שהמחקר של רוזנברג משנת 1986 הוכיח את היעילות של TIL בעכברים6, אימונותרפיה להעברת תאים מאמצת הפכה למוקד מחקר והוכיחה הבטחה בטיפול בסרטן 7,8,9,10. אנו שואפים לחלץ TIL מעכברים, למיין אותם עבור תאי T ספציפיים באמצעות ציטומטריית זרימה, ולאמת את ההשפעות שלהם על הרג הגידול באמצעות העברה מאמצת.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לניצול TIL מעכברים באמצעות זרימה ציטומטרית להעברת תאים מאמצים. המטרה היא לאמת את הציטוטוקסיות הספציפית של TIL כנגד גידולים במודל עכבר סרטן הלבלב סינגני, ולספק תובנות לגבי התפתחות טיפולים תאיים מאמצים לסרטן הלבלב. שיטה זו כוללת השתלת תאי סרטן לבלב של עכברים חיים או מוקרנים בעכברים מדווחים בעלי תווית פלואורסצנטית כדי ליזום זרם תאי חיסון, בידוד לימפוציטים מגידולים ראשוניים באמצעות מיון ציטומטריית זרימה, או הפעלה והרחבה של תאי T מגיבים לגידול ex vivo, והעברה אימוץ של תאי T מופעלים אלה לעכברים נושאי גידול. מתן מאוחר יותר של אינטרלוקין-2 והדמיית גידול ביולומינסנט מאפשר ניטור אורך של צמיחת הגידול האורתוטופי והתגובה לטיפול, במיוחד הערכת השפעות ציטוטוקסיות ספציפיות לגידול. גישה זו מסכמת את הלוגיסטיקה הכרוכה בפיתוח טיפולי העברת תאים מאמצים לחולי סרטן הלבלב. התוצאות מדגימות יעילות אנטי-גידולית משופרת של תאי T מגיבים לגידול שהועברו באימוץ בהשוואה לבקרות לימפוציטים לא רלוונטיות. מתודולוגיה רב-תכליתית זו מאפשרת מחקר in vivo של אימונותרפיה מאמצת בסרטן הלבלב, כמו גם אופטימיזציה של פרמטרים של עיבוד תאים ומשטרי טיפול משולבים.

Protocol

מושבת העכברים שוכנת במתקן מוסמך AAALAC International, תוך עמידה בכל התקנות והתקנים הרלוונטיים של USDA, HHS ו-NIH. מכון הסרטן של האוניברסיטה הרפואית טיאנג'ין והוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים בחנו ואישרו את כל ההליכים בבעלי חיים, כולל הרציונל לבחירת הזנים, הקצאות קבוצות הניסוי וההצדקה הסטטיסטית למספר בעלי חיים ואקראיות.

1. אינדוקציה של גידול

  1. השתמש בקו התאים KPC-Luc11 כדי לגרום לגידולי לבלב אורתוטופיים בעכברים.
  2. הכן תרחיף תאים על ידי טריפסיניזציה של תאי KPC-Luc, שטיפתם פעמיים עם PBS והשעייתם מחדש בריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל ב-PBS עם מטריצת ממברנת בסיס (BMM) של 30%.
  3. להרדים את העכבר עם איזופלורן במינון אינדוקציה של 4% ולאחר מכן לעבור למינון תחזוקה של 2%. ספק תמיכה תרמית באמצעות כרית חימום וצג לפי הצורך. יש למרוח משחה עיניים על שתי העיניים למניעת יובש.
  4. חיטוי אזור הניתוח מספר פעמים בתנועה סיבובית באמצעות קרצוף על בסיס יוד ואלכוהול. יש לתת זריקה תת עורית של קרפרופן 5 מ"ג/ק"ג כמשכך כאבים לפני הניתוח. בעזרת להב אזמל סטרילי, בצע חתך קטן בבטן שמאל (0.5-1 ס"מ) מתחת לצלע השמאלית של העכבר כדי לחשוף את הלבלב.
  5. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את הטחול של העכבר ולחשוף את לבלב העכבר, לערבב תאים ולהזריק אותם ללבלב העכבר עם 50,000 תאים לעכבר. הזרקו 50 מיקרוליטר מתרחיף התאים ישירות לתוך הלבלב באמצעות מחט 29 גרם.
  6. החזר את לבלב העכבר ותפר ברצף את הצפק והעור בעזרת תפרים.
  7. אפשר לעכבר להתאושש על משטח חם עד שהוא ער לחלוטין. יש לתת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן תת עורי כמשכך כאבים לאחר הניתוח מדי יום למשך 3 ימים.
  8. בצע הדמיה חיה 7 ימים לאחר ההזרקה כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול.
    הערה: ניתן לתת טיפולים בשלב זה.
    1. הזרקה תוך-צפקית לעכבר מלח אשלגן D-Luciferin (150 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS, 60 מיקרוליטר לעכבר).
    2. לאחר הרדמת איזופלורן, מקם את העכבר במערכת ההדמיה in vivo לזיהוי ביולומינסנציה. לאחר ההדמיה, הסר את העכבר מהמערכת ואפשר לו להתאושש מההרדמה באופן טבעי.

2. קציר גידולים

  1. המתת חסד של העכברים התורמים באמצעות תא CO2 . עקר את כל הגוף עם 75% אתנול.
  2. הנח את העכבר במכסה מנוע סטרילי. השתמש במספריים ובמלקחיים סטריליים כדי לפתוח את חלל הבטן.
  3. הסר את הגידולים והניח אותם ב-PBS על קרח. מדוד את גודל הגידול בעזרת קליפר ורניר וחשב את נפח הגידול באמצעות הנוסחה (π x אורך × רוחב × רוחב)/6.

3. עיכול גידול

  1. הכן את תמיסת העיכול על ידי הכנת 0.125 מ"ג/מ"ל קולגנאז, 0.125 מ"ג/מ"ל Dispase II ו-10 ug/ml DNase I ב-RPMI 1640 כריכוז 1x. הוסף 1-2 מ"ל תמיסת עיכול לבאר בצלחת של 12 בארות.
  2. טוחנים את הגידולים לחתיכות קטנות בעזרת מספריים סטריליים. עכל את חלקי הגידול ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-70 סל"ד למשך 30 דקות.

4. איסוף תאים

  1. הפסק את העיכול על ידי הוספת 2-4 מ"ל של סרום בקר עוברי 10%. העבירו את כל התאים לצינור איסוף.
  2. שטפו את הבארות עם PBS פעמיים כדי לאסוף את התאים שנותרו. סנן את מתלה התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר או 70 מיקרומטר.
  3. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את התאים ב-5% BSA לצביעה ציטומטרית זרימה.

5. הכנת ציטומטריית זרימה

  1. הכן תאים חד-גרעיניים של טחול או דם היקפי (PBMCs) מעכברים שאינם נושאי גידול כבקרות.
    הערה: אופציונלי: PBMCs מעכברים נושאי גידול יכולים לשמש גם כבקרות.
  2. תאי כתמים עם חוסמי Fc (<1 מיקרוגרם למיליון תאים) ונוגדני זרימה (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 בדילול של 1:100).
  3. דגירה על קרח בחושך למשך 30 דקות. שטפו פעמיים עם PBS קר והשעו מחדש את התאים ב-1% BSA ב-PBS.

6. מיון תאים

  1. מיין תאי CD45+CD3+ באמצעות ציטומטר זרימה. שער תאים חיים המבוססים על FSC-A ו-SSC-A (P1). לאחר מכן, שער תאים בודדים מ-P1 בהתבסס על FSC-A ו-FSC-H (P2).
  2. לבסוף, מיין CD45+CD3+ מ-P2 באמצעות שער CD45 ו-CD3 ואסוף אותם לתוך צינורות האיסוף. הקפידו על השעיה מחדש ותחזוקה נכונה של כדאיות התאים במהלך המיון.

7. הכנת תאים להעברה

  1. תאים ממוינים בצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את התאים בסרום העכבר בריכוז סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל. שמור את התאים על קרח.
    הערה: ניתן לבצע תרבית ex vivo או הפעלה של התאים הממוינים.

8. העברה לאימוץ

  1. בצע השראת גידול לעכבר המקבל 7 ימים לפני יום ההעברה.
  2. הזרקו 2 x 105 תאים לכל עכבר תוך צפקי לעכברים נמענים באמצעות מזרק אינסולין בגודל 29 G x 1/2 אינץ'. יש לתת IL-2 (50 יחב"ל לעכבר) תוך צפקית במשך שלושה ימים רצופים.

9. ניטור גידול

  1. בצע הדמיה חיה ביום הרביעי וביום השביעי לאחר ההעברה כדי להעריך את צמיחת הגידול, עם הדמיה חיה נוספת מדי שבוע עם אותו הליך המתואר בשלב 1.8.
  2. מעקב אחר הישרדות העכברים המקבלים. בסוף הניסוי, המתת חסד של העכבר כמתואר לעיל. השתמש במספריים ובמלקחיים עיניים כדי להסיר את הגידולים, ולאחר מכן הנח אותם ב-PBS על קרח למדידה מהירה של גודל הגידול ועשוי להמשיך בניסויים הבאים לפי הצורך.

תוצאות

העכברים המקבלים מחולקים לשבע קבוצות כדי להעריך ביסודיות את יעילות העברת ה-TIL: (א) בקרת מי מלח (בקרה ריקה): עכברים המקבלים זריקות מי מלח כדי לשמש כקו בסיס. (ב) IL-2 בלבד (בקרה ריקה): עכברים המקבלים זריקות IL-2 כדי להסביר את כל ההשפעות של הציטוקין בלבד. (ג) אותו טיפו...

Discussion

אימונותרפיה פוטנציאלית לסרטן הלבלב עשויה לחזק את מערכת החיסון כדי למקד ולחסל תאי גידול, הכוללת אימונותרפיה מאמצת, מעכבי מחסום חיסוני וחיסוני גידול12. טיפול TIL מחלץ ומרחיב לימפוציטים מגידולים, אשר לאחר מכן מוזרקים מחדש לחולים. בהשוואה לטיפולים תאיים מאמצים א...

Disclosures

המחברים הצהירו שאין להם ניגודי אינטרסים. תוך שימוש ב-ChatGPT וב-Claude-3 לעריכת שפה, המחברים בדקו בקפידה ואימתו את המילים והמשפטים שנוצרו על ידי ChatGPT או Claude-3 לפני שכללו אותם במאמר.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענקי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC), מענק מספר 82272767 ו-82072691 ל-Y.M. המחברים מודים לחברי הצוות שלהם על הדיון ושיתוף הפעולה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioluminescent imaging systemPerkinElmerIVIS SpectrumFor monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin VSolarbioA8020For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)JetCSS013040For filtering cell suspensions
CentrifugeEppendorf5810RFor cell collection and preparation
CO2 chamberTianjin LiliangN/AFor euthanizing mice
CollagenaseSigma-AldrichC5138For digestion solution
CD3-APC antibodyBiolegend100236For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibodyBiolegend100154For flow cytometry staining
C57BL/6 albino miceJackson Laboratory58Donor and recipient mice
Dispase IIGibco17105-041For digestion solution
DNase ISparkJadeAC1711For digestion solution
D-Luciferin potassium saltBeyotimeST198-10gFor live imaging
Ethanol (75%)N/AFor sterilization
Fc blockersBD Biosciences553142For flow cytometry staining
Fetal Bovine SerumGibcoA5669701For cell culture
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAria IIIFor cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)PeproTech200-02For administration post-transfer
IsofluraneShandong AnteN/AFor narcotism
KPC-Luc cell linePI lab generatedN/AFor inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel MatrixCorning356234For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)ServicebioG4207-500MLFor washing and resuspending cells
RPMI 1640 mediumGibco11875093For preparing digestion solution
Sterile hoodESCON/AFor sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forcepsN/AFor tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)Jinhuan MedicalR413For wound closure
SyringeJiangxi Fenglin1 mL 0.45 × 16RWLBFor injection
Tissue culture plate 12 wellJetTCP001012For tumor digestion

References

  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al. Targeting the tumor microenvironment: Removing obstruction to anticancer immune responses and immunotherapy. Ann Oncol. 27 (8), 1482-1492 (2016).
  3. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: Understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 17 (8), 807-821 (2020).
  4. Tay, C., Tanaka, A., Sakaguchi, S. Tumor-infiltrating regulatory t cells as targets of cancer immunotherapy. Cancer Cell. 41 (3), 450-465 (2023).
  5. Betof Warner, A., et al. Expert consensus guidelines on management and best practices for tumor-infiltrating lymphocyte cell therapy. J Immunother Cancer. 2 (2), e008735 (2024).
  6. Rosenberg, S. A., Spiess, P., Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science. 233 (4770), 1318-1321 (1986).
  7. Leidner, R., et al. Neoantigen t-cell receptor gene therapy in pancreatic cancer. N Engl J Med. 386 (22), 2112-2119 (2022).
  8. Lowery, F. J., et al. Molecular signatures of antitumor neoantigen-reactive t cells from metastatic human cancers. Science (New York, N.Y.). 375 (6583), 877-884 (2022).
  9. Rosenberg, S. A., Parkhurst, M. R., Robbins, P. F. Adoptive cell transfer immunotherapy for patients with solid epithelial cancers. Cancer Cell. 41 (4), 646-648 (2023).
  10. Yossef, R., et al. Phenotypic signatures of circulating neoantigen-reactive cd8+ t cells in patients with metastatic cancers. Cancer Cell. 41 (12), 2154-2165.e5 (2023).
  11. Ma, Y., Hwang, R. F., Logsdon, C. D., Ullrich, S. E. Dynamic mast cell-stromal cell interactions promote growth of pancreatic cancer. Cancer Res. 73 (13), 3927-3937 (2013).
  12. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567 (2024).
  13. Mullard, A. FDA approves first tumour-infiltrating lymphocyte (til) therapy, bolstering hopes for cell therapies in solid cancers. Nat Rev Drug Discov. 23 (4), 238 (2024).
  14. Morotti, M., et al. PGE2 inhibits til expansion by disrupting IL-2 signalling and mitochondrial function. Nature. 629 (8011), 426-434 (2024).
  15. Chupp, D. P., et al. A humanized mouse that mounts mature class-switched, hypermutated and neutralizing antibody responses. Nat Immunol. 25 (8), 1489-1506 (2024).
  16. . Stress response in tumor-infiltrating T cells is linked to immunotherapy resistance. Nat Med. 29 (6), 1336-1337 (2023).
  17. Wang, A. Z., et al. Glioblastoma-infiltrating CD8+ T cells are predominantly a clonally expanded GZMK+ effector population. Cancer Discov. 14 (6), 1106-1131 (2024).
  18. Chen, Y., et al. A transformable supramolecular bispecific cell engager for augmenting natural killer and t cell-based cancer immunotherapy. Adv Mater. 36 (3), e2306736 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Tex vivo2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved