Isolamento baseado em citometria de fluxo e avaliação terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor em um modelo de câncer de pâncreas em camundongo

Resumo

Descrevemos um método para utilizar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de camundongos por meio de citometria de fluxo para transferência de células adotivas. Este protocolo tem como objetivo verificar a citotoxicidade específica de TILs contra tumores em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico, fornecendo informações sobre o desenvolvimento de terapias celulares adotivas para câncer de pâncreas.

Resumo

O câncer de pâncreas é uma malignidade agressiva com um prognóstico sombrio e opções terapêuticas limitadas. A terapia celular adotiva, que envolve isolar e ativar as células imunológicas do próprio paciente, como linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), antes de reinfundi-los, representa uma abordagem experimental promissora. No entanto, as técnicas de transferência de células adotivas em modelos pré-clínicos de câncer de pâncreas não estão bem estabelecidas. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para terapia celular adotiva usando TILs de um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico. O procedimento envolve a implantação de células cancerígenas pancreáticas de camundongo vivas ou irradiadas em camundongos repórteres marcados com fluorescência para iniciar o influxo de células imunes, isolando os linfócitos de tumores primários por meio de classificação por citometria de fluxo e/ou ativando e expandindo células T reativas ao tumor ex vivo e transferindo adotivamente essas células T ativadas por via intraperitoneal em camundongos portadores de tumor, seguido pela administração de interleucina-2. A imagem bioluminescente do tumor permite o monitoramento longitudinal do crescimento do tumor ortotópico e da resposta à terapia, especialmente avaliando os efeitos citotóxicos específicos do tumor. Essa abordagem recapitula a logística envolvida no desenvolvimento de terapias adotivas de transferência de células para pacientes com câncer de pâncreas. Os resultados demonstram maior eficácia antitumoral de células T reativas a tumores transferidas adotivamente em comparação com controles de linfócitos irrelevantes. Essa metodologia versátil permite o estudo in vivo da imunoterapia adotiva no câncer de pâncreas, bem como a otimização dos parâmetros de processamento celular e regimes de tratamento combinados.

Introdução

A imunoterapia contra o câncer de pâncreas está em seus estágios iniciais, com exploração e validação pré-clínica contínuas principalmente em modelos de camundongos¹. Os tratamentos atuais para o câncer de pâncreas incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia e terapias direcionadas. Infelizmente, esses métodos geralmente falham em erradicar completamente as lesões tumorais, levando à recorrência e progressão. Os tratamentos tradicionais se concentram nas células tumorais, mas muitas vezes ignoram o microambiente tumoral (TME), que inclui células tumorais e estroma associado composto de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), fibroblastos e matriz extracelular². Os TILs são células imunes dentro do TME, incluindo células T citotóxicas, células T auxiliares, células T reguladoras, células B, células NK, macrófagos e células supressoras derivadas de mielóides³. Essas células participam de respostas imunes que influenciam o crescimento do tumor e os resultados terapêuticos⁴.

A terapia celular adotiva (ACT) envolve a coleta de células imunológicas de um paciente, modificando-as e expandindo-as in vitro e, em seguida, reintroduzindo-as para atingir e matar células tumorais. A terapia TIL, um tipo de ACT, está sendo pesquisada para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo melanoma, câncer de pulmão e câncer cervical. Esse processo envolve isolar linfócitos do tumor, cultivá-los com IL-2 in vitro e reinfundi-los no paciente, muitas vezes após linfodepleção com quimioterapia ou radioterapia⁵.

Desde que o estudo de Rosenberg de 1986 demonstrou a eficácia dos TILs em camundongos⁶, a imunoterapia de transferência celular adotiva tornou-se um ponto de pesquisa e mostrou-se promissora no tratamento do câncer 7,8,9,10. Nosso objetivo é extrair TILs de camundongos, classificá-los para células T específicas por meio de citometria de fluxo e validar seus efeitos de eliminação de tumores por meio de transferência adotiva.

Neste protocolo, descrevemos um método para utilizar TILs de camundongos por meio de citometria de fluxo para transferência de células adotivas. O objetivo é verificar a citotoxicidade específica de TILs contra tumores em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico, fornecendo informações sobre o desenvolvimento de terapias celulares adotivas para câncer de pâncreas. Este método inclui a implantação de células cancerígenas pancreáticas de camundongo vivas ou irradiadas em camundongos repórteres marcados com fluorescência para iniciar o influxo de células imunes, isolando linfócitos de tumores primários por meio de classificação por citometria de fluxo ou ativando e expandindo células T reativas ao tumor ex vivo e transferindo adotivamente essas células T ativadas para camundongos portadores de tumor. A administração subsequente de interleucina-2 e imagens tumorais bioluminescentes permite o monitoramento longitudinal do crescimento tumoral ortotópico e da resposta à terapia, avaliando particularmente os efeitos citotóxicos específicos do tumor. Essa abordagem recapitula a logística envolvida no desenvolvimento de terapias adotivas de transferência de células para pacientes com câncer de pâncreas. Os resultados demonstram maior eficácia antitumoral de células T reativas a tumores transferidas adotivamente em comparação com controles de linfócitos irrelevantes. Essa metodologia versátil permite o estudo in vivo da imunoterapia adotiva no câncer de pâncreas, bem como a otimização dos parâmetros de processamento celular e regimes de tratamento combinado.

Protocolo

A colônia de camundongos está alojada em uma instalação credenciada pela AAALAC International, aderindo a todos os regulamentos e padrões relevantes do USDA, HHS e NIH. O Instituto do Câncer da Universidade Médica de Tianjin e o Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital revisaram e aprovaram todos os procedimentos com animais, incluindo a justificativa para a seleção de cepas, atribuições de grupos experimentais e a justificativa estatística para o número de animais e randomização.

1. Indução de Tumor

1. Use a linha celular KPC-Luc¹¹ para induzir tumores pancreáticos ortotópicos em camundongos.
2. Prepare uma suspensão celular tripsinizando as células KPC-Luc, lavando-as duas vezes com PBS e ressuspendendo-as a uma concentração de 1 x 10⁶ células / mL em PBS com uma matriz de membrana basal (BMM) de 30%.
3. Anestesiar o camundongo com isoflurano em uma dose de indução de 4% e, em seguida, mudar para uma dose de manutenção de 2%. Forneça suporte térmico usando uma almofada de aquecimento e monitor, conforme necessário. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
4. Desinfete a área cirúrgica várias vezes em movimentos circulares usando um esfoliante à base de iodo e álcool. Administre uma injeção subcutânea de carprofeno 5 mg/kg como analgesia antes da cirurgia. Usando uma lâmina de bisturi estéril, faça uma pequena incisão abdominal esquerda (0,5-1 cm) sob a costela esquerda do camundongo para expor o pâncreas.
5. Use uma pinça para segurar o baço do camundongo e expor o pâncreas do camundongo, misture as células e injete-as no pâncreas do camundongo com 50.000 células por camundongo. Injetar 50 μL da suspensão celular diretamente no pâncreas usando uma agulha de 29 G.
6. Retorne o pâncreas do camundongo e suture sequencialmente o peritônio e a pele com suturas.
7. Deixe o mouse se recuperar em uma almofada quente até que esteja totalmente acordado. Administre 5 mg / kg de carprofeno por via subcutânea como analgesia após a cirurgia diariamente por 3 dias.
8. Realize imagens ao vivo 7 dias após a injeção para monitorar o crescimento do tumor.
   NOTA: Os tratamentos podem ser administrados nesta etapa.
   1. Injete intraperitonealmente no camundongo sal de D-luciferina potássica (150 μg / mL em PBS, 60 μL por camundongo).
   2. Após a anestesia com isoflurano, posicione o mouse no sistema de imagem in vivo para detecção de bioluminescência. Após a imagem, remova o mouse do sistema e deixe-o se recuperar da anestesia naturalmente.

2. Colha tumores

1. Eutanasiar os camundongos doadores usando uma câmara de CO₂ . Esterilize todo o corpo com etanol a 75%.
2. Coloque o mouse em um capuz estéril. Use tesouras e fórceps estéreis para abrir a cavidade abdominal.
3. Remova os tumores e coloque-os em PBS no gelo. Meça o tamanho do tumor com um paquímetro e calcule o volume do tumor usando a fórmula (π x comprimento × largura × largura)/6.

3. Digestão do tumor

1. Prepare a solução de digestão fazendo 0,125 mg / ml de colagenase, 0,125 mg / ml de Dispase II e 10 ug / ml de DNase I em RPMI 1640 na concentração de 1x. Adicione 1-2 mL de solução de digestão por poço em uma placa de 12 poços.
2. Pique os tumores em pequenos pedaços usando uma tesoura estéril. Digerir os pedaços tumorais a 37°C com agitação a 70 rpm durante 30 minutos.

4. Coleta de células

1. Termine a digestão adicionando 2-4 mL de soro bovino fetal a 10%. Transfira todas as células para um tubo de coleta.
2. Lave os poços com PBS duas vezes para coletar as células restantes. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm ou 70 μm.
3. Coletar as células por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C. Ressuspenda as células em BSA a 5% para coloração por citometria de fluxo.

5. Preparação da citometria de fluxo

1. Prepare células mononucleares do baço ou do sangue periférico (PBMCs) de camundongos não portadores de tumor como controle.
   NOTA: Opcional: PBMCs de camundongos portadores de tumor também podem ser usados como controles.
2. Corar as células com bloqueadores Fc (<1 μg por milhão de células) e anticorpos de fluxo (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 numa diluição de 1:100).
3. Incube no gelo no escuro por 30 min. Lave duas vezes com PBS frio e ressuspenda as células em 1% BSA em PBS.

6. Classificação de células

1. Classificar as células CD45+CD3+ utilizando um citómetro de fluxo. Células vivas de porta baseadas em FSC-A e SSC-A (P1). Em seguida, faça o gate de células únicas de P1 com base em FSC-A e FSC-H (P2).
2. Finalmente, separe CD45 + CD3 + de P2 usando CD45 e CD3 e colete-os nos tubos coletores. Garantir a ressuspensão adequada e a manutenção da viabilidade celular durante a triagem.

7. Preparação da célula para transferência

1. Centrifugar células classificadas a 400 x g por 5 min a 4 °C. Ressuspenda as células no soro do camundongo a uma concentração final de 1 x 10⁶ células / mL. Mantenha as células no gelo.
   NOTA: Pode ser realizada cultura ex vivo ou ativação das células classificadas.

8. Transferência adotiva

1. Realize a indução do tumor para o camundongo receptor 7 dias antes do dia da transferência.
2. Injetar 2 x 10⁵ células por camundongo por via intraperitoneal em camundongos receptores usando seringa de insulina 29 G x 1/2 ". Administre IL-2 (50 UI por camundongo) por via intraperitoneal por três dias consecutivos.

9. Monitoramento de tumores

1. Realize imagens ao vivo no dia 4 e no dia 7 após a transferência para avaliar o crescimento do tumor, com imagens ao vivo adicionais semanalmente com o mesmo procedimento descrito na etapa 1.8.
2. Acompanhe a sobrevivência dos camundongos receptores. No final do experimento, eutanasiar o camundongo conforme descrito acima. Use tesouras oftálmicas e fórceps para remover os tumores e, em seguida, coloque-os em PBS no gelo para uma medição rápida do tamanho do tumor e pode continuar os experimentos subsequentes conforme necessário.

Resultados

Os camundongos receptores são divididos em sete grupos para avaliar minuciosamente a eficácia da transferência de TIL: (a) Controle de solução salina (controle em branco): Camundongos que recebem injeções de solução salina para servir como linha de base. (b) Apenas IL-2 (controle em branco): Camundongos que recebem injeções de IL-2 para explicar quaisquer efeitos da citocina isoladamente. c) O mesmo tratamento único que para os ratinhos dadore...

Discussão

Potencial A imunoterapia para câncer de pâncreas pode melhorar o sistema imunológico para atingir e eliminar células tumorais, envolvendo imunoterapia adotiva, inibidores de checkpoint imunológico e vacinas tumorais¹². A terapia TIL extrai e expande os linfócitos dos tumores, que são então reinfundidos nos pacientes. Em comparação com outras terapias celulares adotivas, a terapia TIL tem clonalidade TCR diversa, capacidade superior de homing tumoral e ba...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum	For monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin V	Solarbio	A8020	For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)	Jet	CSS013040	For filtering cell suspensions
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For cell collection and preparation
CO2 chamber	Tianjin Liliang	N/A	For euthanizing mice
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5138	For digestion solution
CD3-APC antibody	Biolegend	100236	For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibody	Biolegend	100154	For flow cytometry staining
C57BL/6 albino mice	Jackson Laboratory	58	Donor and recipient mice
Dispase II	Gibco	17105-041	For digestion solution
DNase I	SparkJade	AC1711	For digestion solution
D-Luciferin potassium salt	Beyotime	ST198-10g	For live imaging
Ethanol (75%)		N/A	For sterilization
Fc blockers	BD Biosciences	553142	For flow cytometry staining
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701	For cell culture
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria III	For cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)	PeproTech	200-02	For administration post-transfer
Isoflurane	Shandong Ante	N/A	For narcotism
KPC-Luc cell line	PI lab generated	N/A	For inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel Matrix	Corning	356234	For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Servicebio	G4207-500ML	For washing and resuspending cells
RPMI 1640 medium	Gibco	11875093	For preparing digestion solution
Sterile hood	ESCO	N/A	For sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forceps		N/A	For tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)	Jinhuan Medical	R413	For wound closure
Syringe	Jiangxi Fenglin	1 mL 0.45 × 16RWLB	For injection
Tissue culture plate 12 well	Jet	TCP001012	For tumor digestion