Isolement par cytométrie en flux et évaluation thérapeutique de lymphocytes infiltrant la tumeur dans un modèle murin de cancer du pancréas

Résumé

Nous décrivons une méthode permettant d’utiliser des lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) de souris par cytométrie en flux pour le transfert de cellules adoptives. Ce protocole vise à vérifier la cytotoxicité spécifique des TIL contre les tumeurs dans un modèle murin syngénique de cancer du pancréas, fournissant ainsi des informations sur le développement de thérapies cellulaires adoptives pour le cancer du pancréas.

Résumé

Le cancer du pancréas est une tumeur maligne agressive dont le pronostic est sombre et dont les options thérapeutiques sont limitées. La thérapie cellulaire adoptive, qui consiste à isoler et à activer les propres cellules immunitaires d’un patient, telles que les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL), avant de les réinjecter, représente une approche expérimentale prometteuse. Cependant, les techniques de transfert de cellules adoptives dans les modèles précliniques de cancer du pancréas ne sont pas bien établies. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la thérapie cellulaire adoptive à l’aide de TIL à partir d’un modèle murin de cancer du pancréas syngénique. La procédure consiste à implanter des cellules cancéreuses du pancréas de souris vivantes ou irradiées dans des souris rapporteures marquées par fluorescence pour initier l’afflux de cellules immunitaires, puis à isoler les lymphocytes des tumeurs primaires par tri par cytométrie en flux et/ou à activer et à étendre les lymphocytes T réactifs aux tumeurs ex vivo, et à transférer adoptivement ces lymphocytes T activés par voie intrapéritonéale dans des souris porteuses de tumeurs, suivi d’une administration d’interleukine-2. L’imagerie tumorale bioluminescente permet un suivi longitudinal de la croissance tumorale orthotopique et de la réponse au traitement, en évaluant en particulier les effets cytotoxiques spécifiques à la tumeur. Cette approche récapitule la logistique impliquée dans le développement de thérapies adoptives de transfert de cellules pour les patients atteints de cancer du pancréas. Les résultats démontrent une efficacité antitumorale accrue des lymphocytes T réactifs à la tumeur transférés par adoption par rapport aux témoins lymphocytaires non pertinents. Cette méthodologie polyvalente permet l’étude in vivo de l’immunothérapie adoptive dans le cancer du pancréas ainsi que l’optimisation des paramètres de traitement cellulaire et des schémas thérapeutiques combinés.

Introduction

L’immunothérapie du cancer du pancréas n’en est qu’à ses débuts, avec une exploration préclinique et une validation en cours principalement dans des modèles murins¹. Les traitements actuels du cancer du pancréas comprennent la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et les thérapies ciblées. Malheureusement, ces méthodes ne parviennent souvent pas à éradiquer complètement les lésions tumorales, ce qui entraîne une récidive et une progression. Les traitements traditionnels se concentrent sur les cellules tumorales mais négligent souvent le microenvironnement tumoral (TME), qui comprend à la fois les cellules tumorales et le stroma associé composé de lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL), de fibroblastes et de matrice extracellulaire². Les TIL sont des cellules immunitaires au sein du TME, y compris les lymphocytes T cytotoxiques, les lymphocytes T auxiliaires, les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes B, les lymphocytes NK, les macrophages et les cellules suppressives dérivées de myéloïdes³. Ces cellules participent aux réponses immunitaires qui influencent la croissance tumorale et les résultats thérapeutiques⁴.

La thérapie cellulaire adoptive (ACT) consiste à collecter les cellules immunitaires d’un patient, à les modifier et à les développer in vitro, puis à les réintroduire pour cibler et tuer les cellules tumorales. La thérapie TIL, un type d’ACT, fait l’objet de recherches pour traiter divers cancers, notamment le mélanome, le cancer du poumon et le cancer du col de l’utérus. Ce processus consiste à isoler les lymphocytes de la tumeur, à les cultiver avec de l’IL-2 in vitro et à les réinjecter chez le patient, souvent après une lymphodéplétion par chimiothérapie ou radiothérapie⁵.

Depuis que l’étude de Rosenberg en 1986 a démontré l’efficacité des TIL chez la souris⁶, l’immunothérapie par transfert cellulaire adoptif est devenue un point chaud de la recherche et s’est révélée prometteuse dans le traitement du cancer ^7,8,9,10. Notre objectif est d’extraire des TIL de souris, de les trier pour des lymphocytes T spécifiques via la cytométrie en flux et de valider leurs effets tueurs de tumeurs par transfert adoptif.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode permettant d’utiliser les TIL de souris par cytométrie en flux pour le transfert de cellules adoptives. L’objectif est de vérifier la cytotoxicité spécifique des TIL contre les tumeurs dans un modèle murin syngénique de cancer du pancréas, en fournissant des informations sur le développement de thérapies cellulaires adoptives pour le cancer du pancréas. Cette méthode comprend l’implantation de cellules cancéreuses du pancréas de souris vivantes ou irradiées dans des souris rapporteures marquées par fluorescence pour initier l’afflux de cellules immunitaires, l’isolement des lymphocytes des tumeurs primaires par tri par cytométrie en flux, ou l’activation et l’expansion des lymphocytes T réactifs aux tumeurs ex vivo, et le transfert adoptif de ces lymphocytes T activés dans des souris porteuses de tumeurs. L’administration ultérieure d’interleukine-2 et d’imagerie tumorale bioluminescente permet une surveillance longitudinale de la croissance tumorale orthotopique et de la réponse au traitement, en évaluant en particulier les effets cytotoxiques spécifiques à la tumeur. Cette approche récapitule la logistique impliquée dans le développement de thérapies adoptives de transfert de cellules pour les patients atteints de cancer du pancréas. Les résultats démontrent une efficacité antitumorale accrue des lymphocytes T réactifs à la tumeur transférés par adoption par rapport aux témoins lymphocytaires non pertinents. Cette méthodologie polyvalente permet l’étude in vivo de l’immunothérapie adoptive dans le cancer du pancréas, ainsi que l’optimisation des paramètres de traitement cellulaire et des schémas thérapeutiques combinés.

Protocole

La colonie de souris est hébergée dans une installation accréditée par AAALAC International, qui respecte toutes les réglementations et normes pertinentes de l’USDA, du HHS et du NIH. Le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut de cancérologie de l’Université de médecine de Tianjin a examiné et approuvé toutes les procédures relatives aux animaux, y compris la justification de la sélection des souches, l’affectation des groupes expérimentaux et la justification statistique du nombre d’animaux et de la randomisation.

1. Induction tumorale

1. Utilisez la lignée cellulaire KPC-Luc¹¹ pour induire des tumeurs pancréatiques orthotopiques chez la souris.
2. Préparez une suspension cellulaire en testant les cellules KPC-Luc, en les lavant deux fois avec du PBS et en les remettant en suspension à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL dans du PBS avec une matrice à membrane basale (BMM) à 30 %.
3. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane à une dose d’induction de 4 %, puis passer à une dose d’entretien de 2 %. Fournir un soutien thermique à l’aide d’un coussin chauffant et surveiller si nécessaire. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse.
4. Désinfectez la zone chirurgicale plusieurs fois en mouvements circulaires à l’aide d’un gommage à base d’iode et d’alcool. Administrer une injection sous-cutanée de carprofène 5 mg/kg comme analgésie avant la chirurgie. À l’aide d’une lame de scalpel stérile, effectuez une petite incision abdominale gauche (0,5-1 cm) sous la côte gauche de la souris pour exposer le pancréas.
5. Utilisez des pinces pour tenir la rate de la souris et exposer le pancréas de la souris, mélangez les cellules et injectez-les dans le pancréas de la souris avec 50 000 cellules par souris. Injectez 50 μL de la suspension cellulaire directement dans le pancréas à l’aide d’une aiguille de 29 G.
6. Retournez le pancréas de la souris et suturez séquentiellement le péritoine et la peau avec des sutures.
7. Laissez la souris récupérer sur un coussin chaud jusqu’à ce qu’elle soit complètement réveillée. Administrer 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée comme analgésie après la chirurgie tous les jours pendant 3 jours.
8. Effectuez une imagerie en direct 7 jours après l’injection pour surveiller la croissance tumorale.
   REMARQUE : Des traitements peuvent être administrés à cette étape.
   1. Injecter par voie intrapéritonéale à la souris du sel de potassium D-Luciférin (150 μg/mL dans le PBS, 60 μL par souris).
   2. Après une anesthésie à l’isoflurane, positionnez la souris dans le système d’imagerie in vivo pour la détection de la bioluminescence. Après l’imagerie, retirez la souris du système et laissez-la se remettre naturellement de l’anesthésie.

2. Récolter les tumeurs

1. Euthanasier les souris donneuses à l’aide d’une chambre de CO₂ . Stérilisez tout le corps avec de l’éthanol à 75 %.
2. Placez la souris dans un capot stérile. Utilisez des ciseaux et des pinces stériles pour ouvrir la cavité abdominale.
3. Retirez les tumeurs et placez-les dans du PBS sur de la glace. Mesurez la taille de la tumeur avec un pied à coulisse et calculez le volume de la tumeur à l’aide de la formule (π x longueur × largeur × largeur)/6.

3. Digestion tumorale

1. Préparez la solution de digestion en préparant 0,125 mg/ml de collagénase, 0,125 mg/ml de dispase II et 10 μg/ml de DNase I dans RPMI 1640 à une concentration de 1x. Ajouter 1 à 2 ml de solution de digestion par puits dans une plaque à 12 puits.
2. Coupez les tumeurs en petits morceaux à l’aide de ciseaux stériles. Digérer les morceaux de tumeur à 37°C en secouant à 70 tr/min pendant 30 minutes.

4. Collecte de cellules

1. Terminez la digestion en ajoutant 2 à 4 ml de sérum fœtal bovin à 10 %. Transférez toutes les cellules dans un tube de prélèvement.
2. Lavez les puits avec du PBS deux fois pour recueillir les cellules restantes. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de cellule de 40 μm ou 70 μm.
3. Recueillir les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre les cellules en suspension dans 5 % de BSA pour la coloration par cytométrie en flux.

5. Préparation de la cytométrie en flux

1. Préparez des cellules mononucléées de la rate ou du sang périphérique (PBMC) à partir de souris non porteuses de tumeurs comme témoins.
   REMARQUE : Facultatif : Les PBMC de souris porteuses de tumeurs peuvent également être utilisés comme témoins.
2. Cellules tachatives avec bloqueurs Fc (<1 μg par million de cellules) et anticorps de flux (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 à une dilution de 1:100).
3. Incuber sur glace dans l’obscurité pendant 30 min. Laver deux fois avec du PBS froid et remettre en suspension les cellules dans 1 % de BSA dans du PBS.

6. Tri cellulaire

1. Triez les cellules CD45+CD3+ à l’aide d’un cytomètre en flux. Cellules vivantes de grille basées sur FSC-A et SSC-A (P1). Ensuite, grillez des cellules uniques de P1 basées sur FSC-A et FSC-H (P2).
2. Enfin, triez les CD45+CD3+ de P2 à l’aide des CD45 et CD3 et collectez-les dans les tubes collecteurs. Assurer une remise en suspension correcte et le maintien de la viabilité des cellules pendant le tri.

7. Préparation des cellules pour le transfert

1. La centrifugeuse a trié les cellules à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre les cellules en suspension dans le sérum de souris à une concentration finale de 1 x 10⁶ cellules/mL. Gardez les cellules sur de la glace.
   REMARQUE : Une culture ex vivo ou l’activation des cellules triées peut être effectuée.

8. Transfert adoptif

1. Effectuez l’induction de la tumeur chez la souris receveuse 7 jours avant le jour du transfert.
2. Injecter 2 x 10⁵ cellules par souris par voie intrapéritonéale chez les souris receveuses à l’aide d’une seringue à insuline de 29 G x 1/2 po. Administrer l’IL-2 (50 UI par souris) par voie intrapéritonéale pendant trois jours consécutifs.

9. Surveillance des tumeurs

1. Effectuez une imagerie en direct le jour 4 et le jour 7 après le transfert pour évaluer la croissance tumorale, avec une imagerie en direct supplémentaire chaque semaine avec la même procédure décrite à l’étape 1.8.
2. Faites un suivi de la survie des souris receveuses. À la fin de l’expérience, euthanasiez la souris comme décrit ci-dessus. Utilisez des ciseaux ophtalmiques et des pinces pour retirer les tumeurs, puis placez-les dans du PBS sur de la glace pour une mesure rapide de la taille de la tumeur et pouvez poursuivre les expériences ultérieures si nécessaire.

Résultats

Les souris receveuses sont divisées en sept groupes pour évaluer en profondeur l’efficacité du transfert de TIL : (a) Contrôle salin (contrôle à blanc) : souris recevant des injections de sérum physiologique pour servir de référence. (b) IL-2 uniquement (contrôle à blanc) : Souris recevant des injections d’IL-2 pour tenir compte des effets de la cytokine seule. (c) Le même traitement unique que pour les souris donneuses traitées (contrôl...

Discussion

L’immunothérapie potentielle pour le cancer du pancréas peut renforcer le système immunitaire pour cibler et éliminer les cellules tumorales, impliquant l’immunothérapie adoptive, les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires et les vaccins antitumoraux¹². La thérapie TIL extrait et dilate les lymphocytes des tumeurs, qui sont ensuite réinjectés aux patients. Par rapport à d’autres thérapies cellulaires adoptives, la thérapie TIL présente u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum	For monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin V	Solarbio	A8020	For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)	Jet	CSS013040	For filtering cell suspensions
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For cell collection and preparation
CO2 chamber	Tianjin Liliang	N/A	For euthanizing mice
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5138	For digestion solution
CD3-APC antibody	Biolegend	100236	For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibody	Biolegend	100154	For flow cytometry staining
C57BL/6 albino mice	Jackson Laboratory	58	Donor and recipient mice
Dispase II	Gibco	17105-041	For digestion solution
DNase I	SparkJade	AC1711	For digestion solution
D-Luciferin potassium salt	Beyotime	ST198-10g	For live imaging
Ethanol (75%)		N/A	For sterilization
Fc blockers	BD Biosciences	553142	For flow cytometry staining
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701	For cell culture
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria III	For cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)	PeproTech	200-02	For administration post-transfer
Isoflurane	Shandong Ante	N/A	For narcotism
KPC-Luc cell line	PI lab generated	N/A	For inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel Matrix	Corning	356234	For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Servicebio	G4207-500ML	For washing and resuspending cells
RPMI 1640 medium	Gibco	11875093	For preparing digestion solution
Sterile hood	ESCO	N/A	For sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forceps		N/A	For tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)	Jinhuan Medical	R413	For wound closure
Syringe	Jiangxi Fenglin	1 mL 0.45 × 16RWLB	For injection
Tissue culture plate 12 well	Jet	TCP001012	For tumor digestion