基于流式细胞术的胰腺癌小鼠模型中肿瘤浸润淋巴细胞的分离和治疗评估

摘要

我们描述了一种通过流式细胞术利用小鼠肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 进行过继细胞转移的方法。该方案旨在验证 TILs 在同基因胰腺癌小鼠模型中对肿瘤的特异性细胞毒性，为胰腺癌过继细胞疗法的开发提供见解。

摘要

胰腺癌是一种侵袭性恶性肿瘤，预后不佳且治疗选择有限。过继细胞疗法涉及在重新输注之前分离和激活患者自身的免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL），代表了一种很有前途的实验方法。然而，临床前胰腺癌模型中的过继细胞转移技术尚未完全确立。在这里，我们描述了使用来自同基因胰腺癌小鼠模型的 TIL 进行过继细胞治疗的详细方案。该程序包括将活的或辐照的小鼠胰腺癌细胞植入荧光标记的报告小鼠中以启动免疫细胞内流，然后通过流式细胞术分选和/或体外激活和扩增肿瘤反应性 T 细胞从原发性肿瘤中分离淋巴细胞，并将这些活化的 T 细胞过继地腹膜内转移到荷瘤小鼠中，然后进行白细胞介素 2 给药。生物发光肿瘤成像可以纵向监测原位肿瘤的生长和对治疗的反应，特别是评估肿瘤特异性细胞毒作用。这种方法概括了为胰腺癌患者开发过继细胞转移疗法所涉及的后勤工作。结果表明，与无关淋巴细胞对照相比，过继转移的肿瘤反应性 T 细胞的抗肿瘤疗效增强。这种多功能方法使胰腺癌过继免疫治疗的 体内 研究以及细胞加工参数和联合治疗方案的优化成为可能。

引言

胰腺癌免疫疗法处于起步阶段，主要在小鼠模型中进行临床前探索和验证¹。目前胰腺癌的治疗方法包括手术、化疗、放疗和靶向治疗。不幸的是，这些方法往往无法完全根除肿瘤病灶，导致复发和进展。传统治疗侧重于肿瘤细胞，但往往忽视肿瘤微环境 （TME），其中包括肿瘤细胞和由肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL）、成纤维细胞和细胞外基质组成的相关基质²。TIL 是 TME 中的免疫细胞，包括细胞毒性 T 细胞、辅助性 T 细胞、调节性 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、巨噬细胞和髓源性抑制细胞³。这些细胞参与影响肿瘤生长和治疗结果的免疫反应⁴。

过继细胞疗法 （ACT） 涉及收集患者的免疫细胞， 在体外对其进行修饰和扩增，然后重新引入它们以靶向和杀死肿瘤细胞。TIL 疗法是 ACT 的一种，正在研究用于治疗各种癌症，包括黑色素瘤、肺癌和宫颈癌。这个过程包括从肿瘤中分离淋巴细胞， 在体外用 IL-2 培养它们，然后将它们重新输注到患者体内，通常在淋巴细胞耗竭后进行化疗或放疗⁵。

自从 Rosenberg 1986 年的研究证明了 TILs 在小鼠中的疗效⁶ 以来，过继细胞转移免疫疗法已成为研究热点，并在癌症治疗中显示出前景 ^7,8,9,10。我们的目标是从小鼠中提取 TIL，通过流式细胞术对它们进行特定 T 细胞分类，并通过过继转移验证它们的肿瘤杀伤作用。

在该协议中，我们描述了一种通过流式细胞术利用小鼠的 TIL 进行过继细胞转移的方法。目标是在同基因胰腺癌小鼠模型中验证 TILs 对肿瘤的特异性细胞毒性，为胰腺癌过继细胞疗法的开发提供见解。该方法包括将活的或辐照的小鼠胰腺癌细胞植入荧光标记的报告小鼠中以启动免疫细胞内流，通过流式细胞术分选从原发性肿瘤中分离淋巴细胞，或在 体外激活和扩增肿瘤反应性 T 细胞，并将这些活化的 T 细胞过继转移到荷瘤小鼠中。随后的白细胞介素 2 和生物发光肿瘤成像允许纵向监测原位肿瘤的生长和对治疗的反应，特别是评估肿瘤特异性细胞毒作用。这种方法概括了为胰腺癌患者开发过继细胞转移疗法所涉及的后勤工作。结果表明，与无关淋巴细胞对照相比，过继转移的肿瘤反应性 T 细胞的抗肿瘤疗效增强。这种多功能方法可用于胰腺癌过继免疫治疗的 体内 研究，以及细胞加工参数和联合治疗方案的优化。

研究方案

鼠群饲养在 AAALAC International 认可的设施中，符合所有相关的 USDA、HHS 和 NIH 法规和标准。天津医科大学肿瘤研究所和医院动物护理与使用委员会审查并批准了所有动物程序，包括菌株选择的基本原理、实验组分配以及动物数量和随机化的统计理由。

1. 肿瘤诱导

1. 使用 KPC-Luc 细胞系¹¹ 诱导小鼠原位胰腺肿瘤。
2. 通过胰蛋白酶消化 KPC-Luc 细胞，用 PBS 洗涤它们两次，然后以 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度在含有 30% 基底膜基质 （BMM） 的 PBS 中重悬它们来制备细胞悬液。
3. 用 4% 的诱导剂量的异氟醚麻醉小鼠，然后改用 2% 的维持剂量。根据需要使用加热垫和监视器提供热支持。将眼药膏涂抹在双眼上以防止干燥。
4. 使用碘基磨砂膏和酒精以圆周运动对手术区域进行多次消毒。手术前皮下注射卡洛芬 5 mg/kg 作为镇痛剂。使用无菌手术刀刀片，在小鼠左肋骨下方做一个小左腹切口 （0.5-1 cm） 以暴露胰腺。
5. 用镊子夹住小鼠脾脏，露出小鼠胰腺，混合细胞后以每只小鼠 50,000 个细胞注入小鼠胰腺。使用 29 G 针头将 50 μL 细胞悬液直接注入胰腺。
6. 返回小鼠胰腺并依次用缝合线缝合腹膜和皮肤。
7. 让鼠标在温暖的垫子上恢复，直到完全唤醒。手术后每天皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬作为镇痛剂，持续 3 天。
8. 注射后 7 天进行实时成像以监测肿瘤生长。
   注意：可以在此步骤进行治疗。
   1. 腹膜内注射小鼠 D-荧光素钾盐（PBS 中 150 μg/mL，每只小鼠 60 μL）。
   2. 异氟醚麻醉后，将鼠标置于 体内 成像系统中进行生物发光检测。成像后，将鼠标从系统中取出，让它自然地从麻醉中恢复。

2. 收获肿瘤

1. 使用 CO₂ 室对供体小鼠实施安乐死。用 75% 乙醇对全身消毒。
2. 将鼠标放在无菌罩中。使用无菌剪刀和镊子打开腹腔。
3. 取出肿瘤并将它们置于冰上的 PBS 中。用游标卡尺测量肿瘤大小，并使用公式 （π x 长度 × 宽度 × 宽度）/6 计算肿瘤体积。

3. 肿瘤消化

1. 通过在 RPMI 1640 中制备 0.125 mg/ml 胶原酶、0.125 mg/ml 分散酶 II 和 10 ug/ml DNase I 作为 1x 浓度来制备消化溶液。在 12 孔板中每孔加入 1-2 mL 消化液。
2. 用无菌剪刀将肿瘤切成小块。在 37°C 下消化肿瘤块，以 70 rpm 振荡 30 分钟。

4. 细胞采集

1. 通过添加 2-4 mL 10% 胎牛血清终止消化。将所有细胞转移到收集管中。
2. 用 PBS 洗涤孔两次以收集任何剩余的细胞。通过 40 μm 或 70 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液。
3. 通过在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟来收集细胞。 将细胞重悬于 5% BSA 中用于流式细胞术染色。

5. 流式细胞术制备

1. 从非荷瘤小鼠制备脾脏或外周血单核细胞 （PBMC） 作为对照。
   注：可选：来自荷瘤小鼠的 PBMC 也可用作对照。
2. 用 Fc 阻滞剂（每百万个细胞 <1 μg）和流式抗体（CD3-APC、CD45-APC/Fire750，稀释度为 1：100）对细胞进行染色。
3. 在黑暗中在冰上孵育 30 分钟。用冷 PBS 洗涤两次，并将细胞重悬于 PBS 中的 1% BSA 中。

6. 细胞分选

1. 使用流式细胞仪对 CD45 + CD3 + 细胞进行分选。基于 FSC-A 和 SSC-A （P1） 的设门活细胞。然后，基于 FSC-A 和 FSC-H （P2） 从 P1 中设门单细胞。
2. 最后，使用 CD45 和 CD3 门控从 P2 中分选 CD45+CD3+，并将它们收集到收集管中。确保在分选过程中正确重悬和维持细胞活力。

7. 用于转移的细胞制备

1. 将分选的细胞在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟。 将细胞重悬于小鼠血清中，终浓度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL。将细胞放在冰上。
   注：可以进行分选细胞的 离体 培养或活化。

8. 收养转移

1. 在转移日前 7 天对受体小鼠进行肿瘤诱导。
2. 使用 29 G x 1/2“ 胰岛素注射器将每只小鼠腹膜内注射 2 x 10⁵ 个细胞到受体小鼠中。连续三天腹膜内给药 IL-2 （每只小鼠 50 IU）。

9. 肿瘤监测

1. 在转移后第 4 天和第 7 天进行实时成像以评估肿瘤生长，并按照步骤 1.8 中描述的相同程序每周进行额外的实时成像。
2. 跟进受体小鼠的存活情况。在实验结束时，如上所述对小鼠实施安乐死。使用眼用剪刀和镊子去除肿瘤，然后将它们放在冰上的 PBS 中以快速测量肿瘤大小，并可以根据需要继续后续实验。

结果

将受体小鼠分为七组以彻底评估TIL转移的功效：（a）盐水对照（空白对照）：接受盐水注射的小鼠作为基线。（b） 仅 IL-2（空白对照）：接受 IL-2 注射以解释单独细胞因子的任何影响的小鼠。（c） 与治疗过的供体小鼠相同的单一处理（阳性对照）：接受与供体小鼠相同的治疗的小鼠，以比较直接治疗与 TIL 转移。（d） 来自 IL-2 对照供体的 TIL（...

讨论

胰腺癌的潜在免疫疗法可以增强免疫系统以靶向和消除肿瘤细胞，包括过继免疫疗法、免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗¹²。TIL 疗法从肿瘤中提取和扩增淋巴细胞，然后将其重新输注到患者体内。与其他过继细胞疗法相比，TIL 疗法具有多样化的 TCR 克隆性、卓越的肿瘤归巢能力和低脱靶毒性，使其有利于治疗实体瘤¹³。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum	For monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin V	Solarbio	A8020	For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)	Jet	CSS013040	For filtering cell suspensions
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For cell collection and preparation
CO2 chamber	Tianjin Liliang	N/A	For euthanizing mice
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5138	For digestion solution
CD3-APC antibody	Biolegend	100236	For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibody	Biolegend	100154	For flow cytometry staining
C57BL/6 albino mice	Jackson Laboratory	58	Donor and recipient mice
Dispase II	Gibco	17105-041	For digestion solution
DNase I	SparkJade	AC1711	For digestion solution
D-Luciferin potassium salt	Beyotime	ST198-10g	For live imaging
Ethanol (75%)		N/A	For sterilization
Fc blockers	BD Biosciences	553142	For flow cytometry staining
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701	For cell culture
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria III	For cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)	PeproTech	200-02	For administration post-transfer
Isoflurane	Shandong Ante	N/A	For narcotism
KPC-Luc cell line	PI lab generated	N/A	For inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel Matrix	Corning	356234	For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Servicebio	G4207-500ML	For washing and resuspending cells
RPMI 1640 medium	Gibco	11875093	For preparing digestion solution
Sterile hood	ESCO	N/A	For sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forceps		N/A	For tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)	Jinhuan Medical	R413	For wound closure
Syringe	Jiangxi Fenglin	1 mL 0.45 × 16RWLB	For injection
Tissue culture plate 12 well	Jet	TCP001012	For tumor digestion