Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يعد التقاطع العصبي العضلي ليرقة الزرد نموذجا جذابا لدراسة فسيولوجيا التشابك. إنه قابل للعديد من التقنيات التجريبية ، بما في ذلك الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير البصري. هنا ، نصف بروتوكولا لتصوير الإرسال المشبكي باستخدام مسبار قائم على pHluorin تحت مجهر التألق المستقيم.

Abstract

يتم التوسط في الاتصال العصبي عن طريق الإرسال المشبكي ، والذي يعتمد بشكل أساسي على إطلاق الناقلات العصبية المخزنة في الحويصلات المشبكية (SVs) استجابة لجهد الفعل (AP). نظرا لأن SVs يتم إعادة تدويرها محليا في الطرف قبل المشبكي ، فإن تنسيق إفراز الخلايا البكتيرية SV والالتقام الخلوي مهم للانتقال المشبكي المستدام. يوفر بروتين الفلورسنت الأخضر الحساس للأس الهيدروجيني ، والذي يسمى pHluorin ، أداة قوية لمراقبة التجرد الخارجي / الالتقام الخلوي من خلال استهدافه إلى تجويف SV. ومع ذلك ، فإن تتبع إعادة تدوير SV المدفوعة ب AP باستخدام المجسات القائمة على pHluorin لا يزال يقتصر إلى حد كبير على مستحضرات الثقافة في المختبر لأن إدخال المجسات المشفرة وراثيا والتصوير البصري اللاحق يمثل تحديا تقنيا بشكل عام للنماذج الحيوانية في الجسم الحي أو مستحضرات الأنسجة. أسماك الزرد هو نظام نموذجي يقدم ميزات قيمة ، بما في ذلك سهولة التلاعب الجيني والوضوح البصري والتطور الخارجي السريع. لقد أنشأنا مؤخرا سمكة زرد معدلة وراثيا تعبر بشكل كبير عن مسبار مسمى pHluorin في أطراف الخلايا العصبية الحركية وطورنا بروتوكولا لمراقبة SV exo / intercytosis المدفوع ب AP عند التقاطع العصبي العضلي (NMJ) ، وهو نموذج مشبك راسخ يتشكل في الجسم الحي. في هذه المقالة ، نوضح كيفية تحضير يرقات الزرد NMJ مناسب لتصوير pHluorin. نظهر أيضا أن المستحضر يسمح بالتصوير بفاصل زمني تحت المجهر الدائري العمودي التقليدي ، مما يوفر منصة فعالة من حيث التكلفة لتحليل وظيفة NMJ.

Introduction

يعد الانتقال المشبكي ، بوساطة إطلاق الناقل العصبي من الحويصلات المشبكية (SVs) في الطرف قبل المشبكي ، عملية أساسية تكمن وراء وظيفة العصب1. في الدراسات المبكرة ، تم قياس الانتقال المشبكي بشكل أساسي عن طريق تقنيات الفيزيولوجيا الكهربية التي تكتشف استجابة ما بعد المشبكي التي تسببها الناقلات العصبية ومستقبلاتها. على مدى العقود القليلة الماضية ، تم تطوير عدة أنواع من تقنيات التصوير التي تصور بشكل مباشر وظيفة ما قبل المشبكي2. أحد المجسات الأكثر استخداما هو بروتين فلوري أخضر حساس للأس الهيدروجيني يسمى pHluorin3،4.

تعد إعادة تدوير الحويصلات المشبكية (SVs) في الطرف قبل المشبكي عملية حاسمة للانتقال المستدام للناقلات العصبية5. بعد إطلاق الناقلات العصبية عن طريق إفراز الخلايا ل SVs ، التي يتم الحفاظ على تجويفها بشكل عام عند درجة الحموضةالحمضية 6،7 ، يتم استرداد بروتينات الغشاء و SV على الفور من غشاء البلازما عن طريق الالتقام الخلوي. ثم يتم إعادة تحمض SVs المشكلة حديثا ، ويتم إعادة تحميل الناقلات العصبية. عندما يتم استهداف pHluorin في تجويف SV عن طريق دمجها في بروتين SV ، فإنه يظهر الحد الأدنى من التألق في حالة الراحة. ومع ذلك ، عند إفراز الخلايا SV ، فإنه يتعرض لدرجة الحموضة المحايدة في الفضاء خارج الخلية ، مما يؤدي إلى تألق ساطع. بعد ذلك ، ينخفض التألق تدريجيا بعد إعادة تحمض SV. لذلك ، يتيح فلورة pHluorin مراقبة عمليات إعادة تدوير SV.

في الدراسات الرائدة ، تم اختيار synaptobrevin / VAMP 2 ، البروتين الحويصلي SNARE (مستقبلات البروتين القابل للذوبان في NSF) المسؤول عن اندماج الحويصلة المشبكية في نقاط الاشتباك الأماميللدماغ الأمامي 8 والأكثر وفرة بين بروتينات SV9 ، كشريك اندماج ل pHluorin ، وتم تعيين بروتين الاندماج الناتج على أنه synaptopHluorin (SpH) 3،4. ومع ذلك ، أظهر SpH نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة (S / N) بسبب التعبير السطحي الكبير للمسبار. لذلك ، تم اختبار بروتينات SV الأخرى كشركاء حاملين10،11،12. حتى الآن ، ثبت أن الناقلات الحويصلية تظهر أدنى تعبير سطحي13،14،15. تم إنشاء استخدام هذه المجسات في البداية في الخلايا العصبية للثدييات المستزرعة لتتبع إعادة تدوير SV المدفوعةب AP 8،9،10،11،12،13 وتم توسيعها لتشمل مستحضرات أخرى ، بما في ذلك الأنسجة المقطوعة في الجسم الحي 16،17،18،19،20 ،21،22.

يرقات الزرد هي نظام نموذجي ذو خصائص قيمة ، بما في ذلك سهولة التلاعب الجيني والوضوح البصري والتطور الخارجي السريع. تم إنشاء أسماك الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن pHluorin المدمجة في synaptophysin ، والتي تسمى SypHy ، وتطبيقها على إعدادات تجريبية متعددة ، على سبيل المثال ، مراقبة الاندماج التلقائي SV للخلايا العصبية الشوكية في الجسم الحي21 ، أو إعادة تدوير SV المستقلة عن AP في نقاط الاشتباك العصبي من نوع الشريط في الجسم الحي20،22 أو في الخلايا المعزولة23،24،25. ومع ذلك ، فإن تطبيق تصوير pHluorin لإعادة تدوير SV المدفوعة ب AP في نموذج أسماك الزرد لا يزال محدودا.

يعمل الوصلة العصبية العضلية (NMJ) كنموذج جذاب لدراسة علم وظائف الأعضاء المشبكي26 ، وقد نجحت العديد من الدراسات في إجراء إعادة تدوير SV المدفوعة ب AP باستخدام SpH في الفأر18،19. كان استخدام NMJs لإعادة تدوير SV في أسماك الزرد رائدا من قبل Wen et al.16. في الآونة الأخيرة ، قمنا بإنشاء سمك الزرد Tg الذي يعبر بدرجة عالية عن pHluorin الموسوم بناقل GABA الحويصلي (VGAT) على وجه التحديد في الخلايا العصبية الحركية27. يحتوي هذا المسبار أيضا على HaloTag جنبا إلى جنب مع pHluorin في الذيل اللمعي ل VGAT ، وبالتالي ، يطلق عليه VpHalo. على الرغم من أن VGAT لا يتم التعبير عنه داخليا في الخلايا العصبية الحركية الكولينية ، فقد أكدنا أن VpHalo يتم توطينه في جميع تجمعات SV ويتم إعادة تدويره بشكل صحيح استجابة ل APs من خلال الجمع بين التسجيل الفيزيولوجي الكهربي ، ووضع العلامات على SV المعتمد على النشاط مع روابط HaloTag ، والتصوير الحي ل pHluorin27. نظرا للمستوى العالي من التعبير والحد الأدنى من الأجزاء السطحية ل VpHalo ، مكن تحضير NMJ من سمكة Tg هذه من مراقبة إعادة تدوير SV المدفوعة ب AP بنسبة S / N جيدة. علاوة على ذلك ، فإن التوزيع المتناثر ل NMJs في الجسم الشفاف يجعل الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر غير ضروري لهذا الغرض. على الرغم من أن مراقبة إعادة تدوير أسماك الزرد السليمة التي تعتمد على AP هي الاتجاه المستقبلي المرغوب فيه ، إلا أنه من الأهمية بمكان إنشاء مستحضر NMJ المناسب للتحقق من صحة استخدام المسبار القائم على pHluorin في ظل ظروف جيدة التحكم ، كما حدث في المستحضرات المستزرعة3 ، 4 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15. هنا ، نصف بروتوكول تشريح لتحضير عينة NMJ من الزرد اليرقي والتي يمكن استخدامها لأنواع متعددة من التجارب ، على سبيل المثال ، تسجيل مشبك التصحيح لتيارات الصفيحة النهائية ، ووضع العلامات على HaloTag ل SVs المعاد تدويرها ، والتصوير الحي pHluorin ، كما تمت مناقشته أعلاه. علاوة على ذلك ، ركزنا على وقدمنا بروتوكولا مفصلا للتصوير الحي للفلورين باستخدام مستحضر NMJ هذا تحت مجهر epifluorescent تقليدي مزود بجهاز تحفيز كهربائي ونظام تروية محلول.

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدامها في جامعة أوساكا الطبية والصيدلانية. تم تربية أسماك الزرد والحفاظ عليها تحت دورة مظلمة من 14 ساعة إلى 10 ساعات. تم الحفاظ على الأجنة واليرقات عند 28-30 درجة مئوية في ماء البيض الذي يحتوي على 0.006٪ ملح البحر و 0.01٪ الميثيلين الأزرق. أجريت التجارب بعد 4-7 أيام من الإخصاب (dpf). يوصى بإطعام الأسماك مرتين يوميا من 5 dpf فصاعدا عند إجراء التجارب بعد 6 dpf. يجب تغيير الوسيط قبل كل رضعة.

1. إعداد الحلول

  1. تحضير 200 مل من المحلول خارج الخلية (112 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي هيبس ، 10 ملي جلوكوز ، 2 ملي كلوريدكاسيمون 2 ، 1 ملي ملي كلوريد2 ، درجة الحموضة 7.3-7.4). امزج 6.4 مل من 3.5 M كلوريد الصوديوم ، و 0.4 مل من 1 M KCl ، و 1 مل من 1 M HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، و 0.4 مل من 1 M CaCl2 ، و 0.2 مل من 1 M MgCl2 ، و 360 مجم من الجلوكوز ، وأضف الماء عالي النقاء إلى 200 مل. إذا كان الرقم الهيدروجيني خارج نطاق 7.3-7.4 ، فاضبطه باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم. استخدم المحلول خارج الخلية المعد حديثا لكل تجربة.
  2. تحضير 100 مل من محلول خارج الخلية يحتوي على 3 ميكرومتر D-tubocurarine (D-TBC). أضف 20 ميكرولتر من محلول مخزون D-TBC سعة 15 ملي متر إلى 100 مل من المحلول خارج الخلية.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول مخزون D-TBC في الماء وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
    تنبيه: ارتد القفازات وقم بالتحضير في غطاء المحرك عند التعامل مع مسحوق D-TBC. يوصى أيضا بالقفازات عند التعامل مع محلول D-TBC.
  3. تحضير 25 مل من المحلول خارج الخلية الذي يحتوي على 0.02٪ ثلاثاء (MS-222). أضف 0.5 مل من محلول مخزون التريكيين 1٪ إلى 25 مل من المحلول خارج الخلية.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول مخزون التريكائين في الماء وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يستخدم التريكايين فقط للتشريح ، وليس أثناء التصوير.

2. تحضير قطب ثنائي القطب من الشعيرات الدموية الزجاجية ثيتا

  1. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية ثيتا باستخدام مجتذب الماصات الدقيقة بحيث يتراوح قطر الطرف بين 3-10 ميكرومتر (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: نوصي ببروتوكول يحتوي على خطوتين أو أكثر لسحب الشعيرات الدموية.
  2. قم بتوصيل ماصة ثيتا الزجاجية (1.17 مم من القطر الداخلي بسمك الحاجز 0.165 مم) بعزل التحفيز. املأ الماصة بالمحلول خارج الخلية. أدخل سلكا بلاتينا رفيعا (قطره 0.1 مم) في كل فتحة من الشعيرات الدموية الزجاجية ثيتا وقم بتوصيل الطرف الخلفي للسلك بعزل التحفيز (الشكل 1 ب). احرص على عدم قصر الدائرة بين السلكين البلاتينيين.

3. تحضير العينة

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع يرقات سمك الزرد Tg (hb9: tTAad ، TRE: TagRFP-P2A-VpHalo)27 ، حيث تم التعبير عن البروتينين التاليين ، المرتبطين بببتيد انقسام P2A ، بشكل ثنائي على وجه التحديد في الخلايا العصبية الحركية: بروتين الفلورسنت الأحمر TagRFP وبروتين المستشعر VpHalo ، وهو بروتين اندماج من pHluorin و HaloTag إلى الجزء اللمعي من VGAT (الشكل 2 أ). يقود محفز hb9 التعبير عن tTAad (منشط منشط يتم التحكم فيه بواسطة التتراسيكلين - متقدم) ، والذي بدوره يحفز على التعبير عن الجينات تحت المحفز المركب لعنصر استجابة التتراسيكلين (TRE). يزيد نظام التعبير المحفز من Tet من مستوى التعبير عن البروتين. يسمح pHluorin بالمراقبة الحية لإعادة تدوير SV المعتمدة على النشاط ، بينما يصور HaloTag SVs المعاد تدويرها خلال فترة معينة عن طريق وضع العلامات التساهمية على البروتين المنصهر (الشكل 2 أ). على الرغم من أن كلتا الطريقتين لهما مزايا فريدة ، إلا أننا نركز في هذه المقالة على تصوير pHluorin.

  1. صب 25 مل من المحلول خارج الخلية الذي يحتوي على 0.02٪ تريكان في طبق بتري الزجاجي.
  2. للتشريح ، انقل اليرقة إلى طبق بتري. قشر جلد اليرقة بملقطين ناعمين. استخدم الملقط الأول لتثبيت اليرقة في مكانها واضغط على الجلد على الجانب الظهري من المثانة باستخدام الملقط الآخر (الشكل 3 أ).
  3. قم بإزالة مثانة السباحة والأعضاء الداخلية والرأس بالمشارط. غالبا ما يمكن إزالة الجلد على جانبي جسم السمكة في وقت واحد ، انظر الفيديو 1.

4. وضع العينة في غرفة التصوير وإدخال القطب المحفز

ملاحظة: نظرا لأن الرقم الهيدروجيني اللمعي للراحة في SV أقل من الرقم الهيدروجيني 6.0 ، فإن مضان pHluorin في NMJs في الأسماك الحية بالكاد يمكن ملاحظته (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، عندما كان تجويف SV قلويا ، لوحظ توطين مقيد ل VpHalo إلى NMJs (الشكل 2 ج). والجدير بالذكر أن صورة z-stack متحدة البؤر ل NMJs أظهرت أنها لم تتداخل مع بعضها البعض في مستوى xy ، باستثناء حواف أجزاء الجسم (الشكل 2C). بناء على هذه الملاحظة ، افترضنا أن المجهر الفائفلوري كان قابلا للتطبيق على التصوير الحي ل VpHalo في يرقات الزرد ، والذي تم التحقق من صحته كما هو مفصل في البروتوكول التالي.

  1. انقل العينة إلى غرفة التصوير (الشكل 3 ب) باستخدام ماصة باستور زجاجية ذات طرف مصقول بالنار. قم بإصلاح العينة ميكانيكيا بخيط من النايلون يتم لصقه بسلك بلاتيني على شكل حرف C بحيث يتم توجيهه بزاوية موازية تقريبا للقطب الكهربائي المحفز. (الشكل 3 ج).
    ملاحظة: تم تصنيع سلك بلاتيني على شكل حرف C بخيط من النايلون في المختبر. تم تشكيل ما يقرب من 1 سم من السلك البلاتيني بقطر 0.5 مم على شكل حرف C وتم النقر عليه بمطرقة لتسطيحه. يمكن الحصول على خيط النايلون من الأدوات المنزلية. قمنا بلصق خيط النايلون ، الذي تم الحصول عليه عن طريق تفكيك مجفف المطبخ المتاح في محل بقالة. يتم استخدام جهاز تثبيت مماثل بشكل روتيني في تجربة شريحة الدماغ28.
  2. قم ببث العينة باستمرار بمحلول خارج الخلية يحتوي على 3 ميكرومتر D-TBC بمعدل 1.0 مل / دقيقة تقريبا باستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية.
    ملاحظة: يوصى بالتحكم في درجة حرارة الغرفة باستخدام سخان محلول مدمج.
  3. أدخل قطب التحفيز في الحبل الشوكي. أمسك القطب الكهربائي المحضر من ماصة ثيتا الزجاجية في الخطوة 2 على حامل الماصة المزود بمعالج دقيق آلي. أدخل القطب الكهربائي في العينة بحيث يكون الطرف بالقرب من الخلايا العصبية الحركية الشوكية ، والتي تقع على الجانب البطني من الحبل الشوكي ويمكن تحديدها على أنها خلايا عصبية إيجابية ل TagRFP في هذه العينة (الشكل 3 د). تقدم القطب بزاوية مائلة من الجزء المجاور إلى الموضع المستهدف.
    ملاحظة: الحدود بين أجزاء الجسم كثيفة ويصعب اختراقها ، لذلك من الضروري الضغط على القطب ببطء. موضع طرف القطب مهم جدا. إذا كان بعيدا عن الحبل الشوكي ، فإنه يحفز العضلات المجاورة مباشرة ، مما يؤدي إلى انجراف صورة كبيرة في التصوير بفاصل زمني لاحق.

5. الحصول على الصور

  1. حدد منطقة التصوير. استنادا إلى الصورة الحية لمضان TagRFP ، حدد منطقة تصوير تتضمن أكثر من بضع عروات وتستبعد تلك الموجودة على حدود جزء الجسم (الشكل 2C والشكل 4 أ). اختر المنطقة داخل نفس الجزء من الجسم من قطب التحفيز لأن تعصيب الخلايا العصبية الحركية محدود داخل جزء واحد من الجسم29،30. قم بتبديل وحدة مرشح التألق ل GFP / pHluorin المضالة.
    ملاحظة: في هذا الإعداد التجريبي ، تم تصوير pHluorin بإثارة 470/40 نانومتر ومرشحات انبعاث 510/20 نانومتر. تم تصوير TagRFP باستخدام إثارة 555/20 نانومتر ومرشحات انبعاث 595/44 نانومتر. يستخدم برنامج Micro-Manager للتحكم في الحصول على الصور في وقت واحد باستخدام كاميرا cMOS علمية ومصراع TTL لمصدر ضوء LED. لمزامنة الحصول على الصور والتحفيز الكهربائي ، يتم استخدام Arduino كجهاز إدخال / إخراج رقمي. خيار آخر لا يتطلب نصا وهو استخدام Digidata وبرامجها من الأجهزة الجزيئية.
  2. تحديد إعداد برنامج الحصول على الصور وجهاز الإدخال / الإخراج الرقمي بحيث تتم مزامنة الحصول على الصور والتحفيز الكهربائي. قم بتحسين التعريض الضوئي وشدة مصدر الضوء للحصول على صورة ساطعة بما فيه الكفاية في وضع اللقطات المتتابعة 1 هرتز دون تشبع وإدخال وقت التعريض الضوئي في حقل التعريض الضوئي [مللي ثانية] في نافذة Micro-Manager الرئيسية.
  3. حدد تردد التحفيز وعدد إمكانات الفعل (APs) والوقت بين بدء الحصول على الصورة وتسليم التحفيز ، وترميزها بنص Arduino. اعتمادا على المعلمات ، حدد عدد الصور المكتسبة المقابلة للطول الإجمالي للحصول على الصور وأدخلها في حقل العد في نافذة الاستحواذ متعدد الأبعاد في Micro-Manager. اضبط 1 ثانية في حقل الفاصل الزمني لتحقيق تصوير بفاصل زمني 1 هرتز. للتحفيز الكهربائي ، قم بتوصيل نبضات جهد ثابت 1 مللي ثانية (70 مللي فولت) من خلال عازل التحفيز.
  4. إجراء الحصول على الصور. قم بتنفيذ أمر التحويل الرقمي وقم بإجراء الحصول على الصور. تحقق من عدم وجود انحراف غير مقبول للصورة وأنه يمكن ملاحظة استجابات pHluorin. خلاف ذلك ، فإن موضع القطب غير صحيح. ارجع إلى الخطوة 4.2.
    ملاحظة: يمكن بسهولة تحديد تلف الأنسجة الذي يمكن أن يؤثر على استجابة pHluorin من خلال صورة DIC للألياف العضلية. إذا لم تلاحظ استجابة pHluorin في حالة عدم وجود مثل هذا الضرر ، فقد يكون وضع القطب غير صحيح. يمكن تحديد ذلك على أنه انجراف كبير للصورة لأن وضع القطب الكهربائي غير الصحيح يسبب تقلص العضلات ، كما هو موضح في الخطوة 4.2. المشكلة الأخرى التي تؤدي أحيانا إلى الفشل في استنباط استجابة pHluorin هي الهواء المحبوس في الشعيرات الدموية الزجاجية ثيتا ، مما يؤدي إلى العزل الكهربائي للقطب. يتسبب تقلص العضلات بسبب وضع القطب الكهربي غير الصحيح في انحراف الصورة في المحور Z ، والذي لا يمكن تصحيحه في تحليلات الصور اللاحقة (انظر الخطوة 6.5). لذلك ، يوصى بتحديد البيانات ذات الانجرافات الكبيرة في الصور أثناء الحصول على الصور واستبعادها.
  5. اعتمادا على الغرض من التجربة ، قم بتغيير شدة التحفيز (أي تردد وعدد النبضات) و / أو درجة الحرارة. احفظ صور اللقطات المتتابعة كمجموعة من صور TIFF. انظر الفيديو 2.

6. تحليل الصور

ملاحظة: استخدم فيجي لإجراء معالجة الصور وتحليلها التاليين. استخدم Microsoft Excel أو برنامج جداول بيانات مشابه لحساب نتائج القياس. استخدم Igor Pro لإجراء تركيب المنحنى على النتيجة التي تم الحصول عليها.

  1. قم بإنشاء صورة فرق تبرز نقاط الاشتباك العصبي النشطة كما هو موضح أدناه.
    1. افتح مجموعة الصور في السلاسل الزمنية في فيجي عن طريق اختيار ملف > فتح. إذا كانت الصور المعروضة باهتة، فاختر Image >Adjust >Brightness/Contrast >Auto. لا تنقر فوق تطبيق ، لأن هذا سيعيد قياس شدة الإشارة ، مما يجعل المزيد من التحليل مستحيلا. اختر تحليل > تعيين المقياس وأدخل عامل المعايرة المحدد في حالة التصوير.
    2. قم بإنشاء مجموعة من خمس صور تم التقاطها خلال فترة ما قبل التحفيز عن طريق تحديد صورة > تكرار وإدخال رقم مناسب يشير إلى نطاق تسلسل الصورة (على سبيل المثال ، 11-15 للتجربة مع فترة ما قبل التحفيز 15 ثانية).
    3. حدد Image > Stacks > Z Project وحدد Average Intensity من القائمة المنسدلة Projection Type. اضغط على موافق لإنشاء صورة تمثيلية لفترة ما قبل التحفيز (الشكل 4 ب). عملية حساب المتوسط مهمة لتقليل تأثير تقلبات الإشارة.
    4. قم بإنشاء صورة متوسطة لفترة ما بعد التحفيز باستخدام معالجة مماثلة (الشكل 4 ب). قم بتكرار كومة من خمس صور مباشرة بعد نهاية التحفيز (على سبيل المثال، الصورة 26-30 لفترة ما قبل التحفيز 15 ثانية وتجربة فترة التحفيز 10 ثوان). حدد عملية > حاسبة الصور وقم بتعيين متوسط صورة ما قبل التحفيز ومتوسط صورة ما بعد التحفيز كصورة 1 وصورة 2 في القوائم المنسدلة، على التوالي.
    5. حدد طرح من القائمة المنسدلة عملية واضغط على موافق لإنشاء صورة فرق تبرز نقاط الاشتباك العصبي النشطة (الشكل 4 ب).
  2. تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) المراد تحليلها.
    1. حدد Edit > Selection > حدد وقم بإنشاء عائد استثمار دائري بقطر 7 ميكرومتر على صورة الفرق التي تم إنشاؤها في الخطوة 6.1. ضع عائد الاستثمار على المشبك النشط المميز واضغط على T لإضافة عائد الاستثمار في مدير العائد على الاستثمار. في النتيجة التمثيلية الموضحة في الشكل 4C-D ، تم وضع 6 عائد استثمار حول العروات.
    2. ضع 5 عائد استثمار آخر من نفس الحجم في المناطق التي لا لوحظت فيها زيادة في الإشارة. استخدم متوسط التألق كإشارة خلفية في الخطوة التالية. احفظ عائد الاستثمار عن طريق تحديد المزيد >حفظ من قائمة مدير العائد على الاستثمار.
  3. قم بقياس شدة الإشارة وحساب التغيير الجوهري في التألق.
    1. حدد مكدس السلاسل الزمنية الأصلي وانقل عائد الاستثمار المحفوظ في الخطوة 6.2 إلى المكدس. حدد تحليل > تعيين القياسات وحدد خانة الاختيار متوسط القيمة الرمادية فقط. قم بقياس متوسط شدة التألق في عائد الاستثمار على جميع النقاط الزمنية عن طريق تحديد المزيد > القياس المتعدد من قائمة مدير عائد الاستثمار.
    2. انسخ جميع القيم في نافذة النتائج والصقها في برنامج جداول بيانات. احسب متوسط إشارة الخلفية من 5 عائد استثمار في الخلفية واطرحها من كل عائد استثمار متشابك ، مما يوفر تغييرا جوهريا في التألق في كل عروة (الشكل 4 د). متوسط جميع البيانات من عرض واحد (في هذه الحالة ، 6 أعروت) ، محسوبة على أنها n = 1 تجربة. في الشكل 4 ه، يتم تمثيل كل تتبع يتم الحصول عليه عن طريق حساب المتوسط على أنه F/F0 بقسمة القيمة في جميع النقاط الزمنية على متوسط القيمة خلال فترة خط الأساس الأولية.
  4. تقدير ثابت وقت اضمحلال التألق (تاو) عن طريق تركيب المنحنى.
    1. افتح جدول بيانات جديد في Igor Pro عن طريق تحديد نافذة > جدول جديد. انسخ بيانات النقطة الزمنية وF / F0 من جدول البيانات والصقها في الجدول في صف مختلف. اختر نافذة > رسم بياني جديد، وحدد بيانات F/F0 كموجة Y وبيانات النقطة الزمنية كموجة X، واضغط على Do It لإنشاء رسم بياني.
    2. اختر نافذة > إظهار المعلومات وحدد نطاق البيانات المراد تحليلها عن طريق وضع مؤشر واحد على ذروة الإشارة والآخر في نهاية التتبع. اختر Analysis > Curve Fitting وحدد exp_XOffset في القائمة المنسدلة Function والموجات X وY المناسبة في القائمة المنسدلة Wave.
    3. انقر فوق خيارات البيانات واضغط على الزر "المؤشرات" لتعيين نطاق ملاءمة المنحنى. انقر فوق المعاملات، وأدخل 1 ل Y0، واضغط على Do It. يوفر تركيب المنحنى من خلال هذا الإجراء قيمة تاو تمثل معدل تسوس التألق ، مما يعكس معدلات الالتقام الخلوي SV وإعادة الحمض.
  5. قم بإجراء تصحيح الانجراف اليدوي (اختياري) كما هو موضح أدناه.
    1. إذا حدث انحراف في الصورة وتحركت البقعة المحددة خارج عائد الاستثمار بقطر 7 ميكرومتر أثناء فترة الحصول على الصورة، فقم بتشغيل المكون الإضافي Manual Drift Correction. افتح مكدس صور السلسلة الزمنية في فيجي عن طريق تحديد ملف > فتح. حدد أداة النقطة بالنقر فوق شريط أدوات النقطة.
    2. ابحث عن ألمع العروة كمعلم وضع نقطة في وسطها. اضغط على T لإضافة النقطة إلى مدير عائد الاستثمار. كرر هذه العملية لتسلسل الصور بالكامل. اعرض الصورة الأولى وحدد المكونات الإضافية > التسجيل > تصحيح الانجراف اليدوي. احفظ مكدس سلسلة الصور المصححة كملف جديد واستخدمه للتحليل.
      ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن تصحيح الانجراف XY ، إلا أن الانجراف Z المفرط غير قابل للتصحيح بهذه الطريقة.

النتائج

إذا تم تحضير العينة المقطعة دون تلف شديد في الأنسجة وتم إدخال قطب التحفيز بشكل صحيح في الحبل الشوكي ، فيمكن استنباط استجابة قوية للفلورين عن طريق التحفيز الكهربائي عالي التردد (الشكل 4D ، E). من المحتمل أن يكون مضان خط الأساس قبل التحفيز بسبب المسب...

Discussion

اليرقات الزرد NMJ هو نظام نموذجي ناشئ لدراسة علم وظائف الأعضاء المشبكي وعلم الأمراض26،31. تم بالفعل إنشاء سمكة الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن SpH بطريقة خاصة بالخلايا العصبية واستخدامها لتحليل طفرة تظهر عيبا حركيا17. أظهر Wen et

Disclosures

لا يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI Grant 18K06882 إلى F. O. ؛ ومنحة الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI 21K06429 و 24K10020 إلى Y.E.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40x water immersion objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion systemALAVCPlus-4G
5x objectiveOlympusNPLN5X
Custum made imaging chamberPhysiotechcustum madeA black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate. 
Digital I/O deviceArduinoUno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrateSigma93750
ExcelMicrosoftMicrosoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJhttps://imagej.net/imageJ 1.54f
Fine forcepsAsOne7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipetteIWAKIIK-PAS-5PThe tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm. 
Glass Petri dishAsOne1-4564-06
Igor ProWaveMetricsVer. 6.37
Inline solution heaterWarner InstrumentsSF-28
LED illumination systemX-cyteXYLIS
Methylen blueWako133-06962
Micro-Managerhttps://micro-manager.org/Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tubeWarner Instruments64-1553
Motorized micromanipulatorScientificaPatchStar
Motorized movable sample plateScientificaMMSP
Pipette holderNarishigeH-13
Pipette pullerNarishigePC-100
Platinum wire (φ0.1mm)NilacoPT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)NiacoPT-351381
ScalpelAsOne8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS cameraThorlabsCC215MU
Sea saltNAPQOInstant Ocean
Stereo microscopeOlympusSZX7
Stimulus isolaterAMPIISO-FLEX
Suction tubeWarner InstrumentsST-3, 64-1406
Temperature controllerWarner InstrumentsTC-324C
Theta glass capillarySutter InstrumentBT-150-10
Tricaine (MS-222)TCIT0941
Upright microscopeOlympusBX51WI

References

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).
  2. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  3. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  4. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  5. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  6. Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles. J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).
  7. Egashira, Y., et al. Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).
  8. Schoch, S., et al. Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice. Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).
  9. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  10. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  11. Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  12. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons. Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).
  13. Voglmaier, S. M., et al. Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling. Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).
  14. Balaji, J., Ryan, T. A. Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).
  15. Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif. J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).
  16. Wen, H., et al. Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources. Elife. 2, e01206 (2013).
  17. Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release. J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).
  18. Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin. J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  19. Tabares, L., et al. Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin. J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).
  20. Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina. Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).
  21. Almeida, R. G., et al. Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth. Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).
  22. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nat Comm. 9 (1), 1388 (2018).
  23. Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone. eLife. 5, e13245 (2016).
  24. Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones. iScience. 17, 10-23 (2019).
  25. Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells. STAR Protoc. 3 (1), 101107 (2022).
  26. Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model. Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).
  27. Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses. J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).
  28. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. J Vis Exp. (131), e55936 (2018).
  29. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).
  30. Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  31. Brehm, P., Wen, H. Zebrafish neuromuscular junction: The power of n. Neurosci Lett. 713, 134503 (2019).
  32. Ben Fredj, N., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Mandal, A., et al. Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons. J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).
  34. Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766 (2022).
  35. Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton. Front Cell Neurosci. 8, 409 (2014).
  36. Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular ph. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PHluorin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved