解剖斑马鱼幼鱼神经肌肉接头突触囊泡循环的实时成像

摘要

斑马鱼幼虫神经肌肉接头是研究突触生理学的有吸引力的模型。它适用于许多实验技术，包括电生理学和光学成像。在这里，我们描述了一种在正置落射荧光显微镜下使用基于 pHluorin 的探针对突触传递进行成像的方案。

摘要

神经元通讯是由突触传递介导的，突触传递主要取决于响应动作电位 （AP） 而释放储存在突触囊泡 （SV） 中的神经递质。由于 SV 在突触前末梢局部循环，因此 SV 胞吐作用和内吞作用的协调对于持续的突触传递很重要。一种 pH 敏感的绿色荧光蛋白，称为 pHluorin，通过靶向 SV 腔，为 SV 胞外吞/内吞作用提供了强大的工具。然而，使用基于 pHluorin 的探针跟踪 AP 驱动的 SV 回收仍然在很大程度上局限于 体外 培养制备，因为引入基因编码探针和随后的光学成像对于 体内 动物模型或组织制备来说通常是技术上的挑战。斑马鱼是一个模型系统，具有有价值的功能，包括易于遗传作、光学清晰度和快速外部发育。我们最近生成了一种转基因斑马鱼，它在运动神经元末梢高度表达 pHluorin 标记的探针，并开发了一种方案来监测神经肌肉接头 （NMJ） 处 AP 驱动的 SV 胞吐/内吞作用，这是一种 在体内形成的成熟突触模型。在本文中，我们展示了如何制备适用于 pHluorin 成像的斑马鱼幼体 NMJ 制剂。我们还表明，该制剂允许在传统的正置落射荧光显微镜下进行延时成像，为分析 NMJ 功能提供了一个经济高效的平台。

引言

突触传递由突触前末梢突触小泡 （SV） 释放的神经递质介导，是神经功能的基本过程¹。在早期研究中，突触传递主要通过电生理技术来测量，这些技术检测神经递质及其受体引起的突触后反应。然而，在过去的几十年里，已经开发了几种类型的成像技术，可以直接可视化突触前功能²。使用最广泛的探针之一是一种名为 pHluorin ^3,4 的 pH 敏感绿色荧光蛋白。

突触前末梢突触小泡 （SV） 的再循环是神经递质持续传递的关键过程⁵。SV 胞吐作用释放神经递质后，其管腔通常维持在酸性 pH^{值 6,7}，膜和 SV 蛋白立即通过内吞作用从质膜中回收。然后对新形成的 SV 进行再酸化，并重新加载神经递质。当 pHluorin 通过与 SV 蛋白融合而被靶向到 SV 腔中时，它在静息状态下表现出最小的荧光。然而，在 SV 胞吐作用后，它暴露于细胞外间隙的中性 pH 值，产生明亮的荧光。随后，SV 再酸化后荧光逐渐减弱。因此，pHluorin 荧光能够监测 SV 回收过程。

在开创性研究中，突触蛋白/VAMP 2 是负责前脑突触⁸ 中突触小泡融合的囊泡 SNARE（可溶性 NSF 附着蛋白受体）蛋白，也是 SV 蛋白⁹ 中含量最高的蛋白，被选为 pHluorin 的融合伴侣，所得融合蛋白被命名为突触 Hluorin （SpH）^3,4.然而，由于探针的大量表面表达，SpH 表现出低信噪比 （S/N）。因此，其他 SV 蛋白已被测试为载体伴侣 10,11,12。迄今为止，囊泡转运蛋白已被证明表现出最低的表面表达 13,14,15。这些探针的使用最初是在培养的哺乳动物神经元中建立的，用于追踪 AP 驱动的 SV 循环 8,9,10,11,12,13，并已扩展到其他制剂，包括解剖组织和体内动物 16,17,18,19,20，^21,22.

斑马鱼幼鱼是一种具有宝贵特性的模型系统，包括易于遗传作、光学清晰度和快速外部发育。产生表达与突触素融合的 pHluorin 的转基因斑马鱼，称为 SypHy，并将其应用于多种实验设置，例如，监测体内脊髓神经元的自发 SV 融合 ²¹，体内丝带型突触处的 AP 非依赖性 SV 再循环 ^20,22 或分离细胞 23,24,25.然而，AP 驱动的 SV 回收的 pHluorin 成像在斑马鱼模型中的应用仍然有限。

神经肌肉接头 （NMJ） 是研究突触生理学的有吸引力的模型²⁶，几项研究成功地在小鼠中用 SpH 进行了 AP 驱动的 SV 再循环^{成像 18,19}。使用 NMJ 在斑马鱼中回收 SV 是由 温 et ^al.16 开创的。最近，我们生成了 Tg 斑马鱼，它高度表达用囊泡 GABA 转运蛋白 （VGAT） 标记的 pHluorin，特别是在运动神经元中²⁷。该探针还包含一个 HaloTag 与 VGAT 管腔尾部的 pHluorin 串联，因此被命名为 VpHalo。尽管 VGAT 在胆碱能运动神经元中不内源性表达，但我们证实 VpHalo 定位于所有 SV 池，并通过结合电生理记录、活性依赖性 SV 标记与 HaloTag 配体和 pHluorin²⁷ 的实时成像来响应 AP 而正确回收。由于 VpHalo 的高表达水平和最低的表面分数，从这种 Tg 鱼中制备的 NMJ 能够监测 AP 驱动的 SV 回收，具有良好的 S/N 比。此外，NMJ 在透明体中的稀疏分布使得共聚焦激光扫描显微镜为此目的变得没有必要。尽管监测完整斑马鱼中 AP 驱动的 SV 循环是理想的未来方向，但最重要的是建立适合在良好控制的条件下验证基于 pHluorin 的探针的使用的 NMJ 制剂，就像在培养制剂 3,4,10,11,12,13,14,15 中所做的那样.在这里，我们描述了一种解剖方案，用于制备可用于多种类型实验的斑马鱼幼虫 NMJ 样品，例如，膜片钳记录终板电流、回收 SV 的 HaloTag 标记和 pHluorin 实时成像，如上所述。此外，我们关注并提供了在配备电刺激装置和溶液灌注系统的常规落射荧光显微镜下使用这种 NMJ 制剂对 pHluorin 进行实时成像的详细方案。

研究方案

所有动物程序均按照大阪医科药科大学的动物护理和使用指南进行。斑马鱼在 14 h 光照至 10 h 黑暗循环下饲养和维持。将胚胎和幼虫在 28-30 °C 的卵水中保存在含有 0.006% 海盐和 0.01% 亚甲蓝的卵水中。实验在受精后 4-7 天 （dpf） 进行。建议从 5 dpf 开始每天喂鱼两次，当在 6 dpf 之后进行实验时。每次补料前必须更换培养基。

1. 溶液的制备

1. 准备 200 mL 细胞外溶液（112 mM NaCl、2 mM KCl、10 mM HEPES、10 mM 葡萄糖、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl_2，pH 7.3-7.4）。混合 6.4 mL 3.5 M NaCl、0.4 mL 1 M KCl、1 mL 1 M HEPES （pH 7.5）、0.4 mL 1 M CaCl₂、0.2 mL 1 M MgCl₂ 和 360 mg 葡萄糖，加入超纯水至 200 mL。如果 pH 值超出 7.3-7.4 范围，则用 1 M NaOH 调节。每个实验使用新鲜制备的细胞外溶液。
2. 准备 100 mL 含有 3 μM D-tubocurarine （D-TBC） 的细胞外溶液。将 20 μL 的 15 mM D-TBC 储备液添加到 100 mL 细胞外溶液中。
   注意：D-TBC储备溶液在水中制备并储存在-20°C。
   注意： 处理 D-TBC 粉末时，请戴上手套并在通风橱中做好准备。处理 D-TBC 溶液时，也建议戴手套。
3. 准备 25 mL 含有 0.02% 三卡因 （MS-222） 的细胞外溶液。将 0.5 mL 1% 三卡因原液添加到 25 mL 细胞外溶液中。
   注：Tricaine 储备溶液在水中制备并储存在 4 °C。 三卡因仅用于解剖，不用于成像。

2. 从 θ 玻璃毛细管制备双极电极

1. 使用微量移液器拉拔器拉动 θ 玻璃毛细管，使尖端直径在 3-10 μm 范围内（图 1A）。
   注：我们建议采用包含两个或多个步骤来拉动毛细管的方案。
2. 将 θ 玻璃移液器（内径 1.17 mm，隔膜厚度 0.165 mm）连接到 Stimulus Isolator。用细胞外溶液填充移液器。将一根细铂丝（直径 0.1 mm）插入 θ 玻璃毛细管的每个开口中，并将导线的后端连接到刺激隔离器（图 1B）。小心不要使两根铂线短路。

3. 样品制备

注意：该方案已针对 Tg（hb9：tTAad，TRE：TagRFP-P2A-VpHalo）斑马鱼幼虫²⁷ 进行了优化，其中以下两种蛋白质，通过 P2A 切割肽连接，在运动神经元中双向共电子特异性表达：报告红色荧光蛋白 TagRFP 和传感器蛋白 VpHalo，它是 pHluorin 和 HaloTag 与 VGAT 管腔部分的融合蛋白（图 2A).hb9 启动子驱动 tTAad （四环素控制的反式激活因子-高级） 的表达，进而诱导四环素反应元件 （TRE） 复合启动子下的基因表达。Tet 诱导型表达系统可提高蛋白表达水平。pHluorin 允许实时监测活性依赖性 SV 回收，而 HaloTag 通过共价标记融合蛋白来可视化给定期间回收的 SV（图 2A）。尽管这两种方法都有独特的优势，但在本文中，我们重点介绍 pHluorin 成像。

1. 将 25 mL 含有 0.02% tricane 的细胞外溶液倒入玻璃培养皿中。
2. 为了解剖，将幼虫转移到培养皿中。用两个细镊子剥下幼虫的皮肤。使用第一个镊子将幼虫固定到位，并用其他镊子捏住鱼鳔背侧的皮肤（图 3A）。
3. 用手术刀去除鱼鳔、内脏和头部。鱼身体两侧的皮肤通常可以同时去除，见 视频 1。

4. 将样品放入成像室并插入刺激电极

注意：由于 SV 的静止管腔 pH 值低于 pH 6.0，因此几乎无法观察到活鱼中 NMJ 的 pHluorin 荧光（图 2B）。然而，当 SV 腔被碱化时，观察到 VpHalo 对 NMJ 的定位受到限制（图 2C）。值得注意的是，NMJ 的共聚焦 z 堆栈图像显示，除了体段的边缘外，它们在 xy 平面上没有相互重叠（图 2C）。基于这一观察，我们假设落射荧光显微镜适用于斑马鱼幼虫中 VpHalo 的实时成像，这在以下协议中得到了验证。

1. 使用带有火焰抛光尖端的玻璃巴斯德移液器将样品转移到成像室（图 3B）。用粘在 C 形铂丝上的尼龙线机械固定样品，使其方向与刺激电极大致平行。（图 3C）。
   注意：在实验室中制造了一根带有尼龙线的 C 形铂丝。将大约 1 厘米直径为 0.5 毫米的铂丝制成 C 形，并用锤子敲击以将其压平。尼龙线可以从家居用品中获得。我们用胶水粘住了尼龙线，这是通过拆卸杂货店提供的厨房沥水器获得的。类似的固定装置通常用于脑切片实验²⁸。
2. 使用重力流灌注系统，以约 1.0 mL/min 的速率，用含有 3 μM D-TBC 的细胞外溶液连续灌注样品。
   注意：建议使用在线溶液加热器控制腔室温度。
3. 将刺激电极插入脊髓。将步骤 2 中由 theta 玻璃移液器制备的电极放在配备电动显微作器的移液器支架上。将电极插入样品中，使尖端靠近脊髓运动神经元，脊髓运动神经元位于脊髓腹侧，可以在该样本中被识别为 TagRFP 阳性神经元（图 3D）。将电极从相邻段以倾斜角度推进到目标位置。
   注意：身体部分之间的边界很密集，很难穿透，因此需要慢慢按压电极。电极尖端的位置非常重要。如果它远离脊髓，它会直接刺激相邻的肌肉，导致在随后的延时成像中出现大图像漂移。

5. 图像采集

1. 选择成像区域。根据 TagRFP 荧光的实时图像，选择一个成像区域，该区域包括多个钮扣，并不包括体段边界处的钮扣（图 2C 和图 4A）。选择刺激电极同一身体部分内的区域，因为运动神经元神经支配仅限于单个身体部分^29,30。切换 GFP/pHluorin 荧光的荧光滤光片单元。
   注：在此实验设置中，使用 470/40 nm 激发和 510/20 nm 发射滤光片对 pHluorin 进行成像。TagRFP 使用 555/20 nm 激发和 595/44 nm 发射滤光片成像。Micro-Manager 软件用于同时控制科学 cMOS 相机和 LED 光源的 TTL 快门的图像采集。为了同步图像采集和电刺激，Arduino 用作数字 I/O 设备。另一个不需要脚本的选项是使用 Molecular Devices 的 Digidata 及其软件。
2. 确定图像采集软件和数字 I/O 设备的设置，以便图像采集和电刺激同步。优化光源的曝光和强度，以 1 Hz 延时模式获得足够亮的图像，而不会饱和，并在 Micro-Manager 主窗口的曝光 [ms] 字段中输入曝光时间。
3. 确定刺激频率、动作电位 （AP） 数量以及图像采集开始和刺激传递之间的时间，并在 Arduino 脚本中对其进行编码。根据参数，确定与图像采集总长度相对应的采集图像数量，并将其输入到微管理器的 Multi-Dimensional Acquisition 窗口的 Count 字段中。在 Interval 字段中设置 1 s 以实现 1 Hz 延时成像。对于电刺激，通过刺激隔离器提供 1 ms 恒压脉冲 （70 mV）。
4. 执行图像采集。执行 digitizer 命令并执行图像采集。验证没有不可接受的图像漂移，并且可以观察到 pHluorin 响应。否则，电极位置不正确。返回步骤 4.2。
   注意：可能影响 pHluorin 反应的组织损伤可以通过肌肉纤维的 DIC 图像轻松识别。如果在没有此类损伤的情况下没有观察到 pHluorin 响应，则电极位置可能不正确。这可以识别为大图像漂移，因为电极定位不当会导致肌肉收缩，如步骤 4.2 所述。有时导致 pHluorin 反应失败的另一个问题是空气滞留在 θ 玻璃毛细管中，这会导致电极的电气隔离。由于电极位置不正确而导致的肌肉收缩会导致 Z 轴上的图像漂移，这在后续的图像分析中无法校正（参见步骤 6.5）。因此，建议在图像采集过程中识别并排除具有较大图像漂移的数据。
5. 根据实验的目的，改变刺激强度（即频率和脉冲数）和/或温度。将延时图像另存为 TIFF 图像的时间序列堆栈。见 视频 2。

6. 图像分析

注意：使用 Fiji 执行以下图像处理和分析。使用 Microsoft Excel 或类似的电子表格软件计算测量结果。使用 Igor Pro 对获得的结果执行曲线拟合。

1. 创建突出显示活动突触的差异图像，如下所述。
   1. 通过选择 File （文件） > Open （打开） 打开斐济图像的时间序列堆栈。如果显示的图像较暗，请选择 图像 >调整 >亮度/对比度 >自动。不要单击 Apply，因为这将重新调整信号强度，从而无法进行进一步分析。选择 Analyze > Set Scale （设置比例）， 然后输入成像条件中定义的校准因子。
   2. 通过选择 Image > Duplicate 并输入一个适当的数字来指示图像序列的范围（例如，对于具有 15 秒刺激前周期的实验，11-15），创建在预刺激期间拍摄的五张图像的堆栈。
   3. 选择 Image > Stacks > Z Project ，然后从 Projection Type 下拉菜单中选择 Average Intensity 。按 OK 创建刺激前期的代表性图像（图 4B）。平均过程对于减少信号波动的影响非常重要。
   4. 使用类似的处理创建刺激后时期的平均图像（图 4B）。刺激结束后立即复制一堆五张图像（例如，第 26-30^{张图像用于} 15 秒刺激前和 10 秒刺激期实验）。选择 Process > Image Calculator 并在下拉菜单中将平均刺激前图像和平均刺激后图像分别设置为 Image 1 和 Image 2。
   5. 从“作”下拉菜单中选择“ 减去 ”，然后按 “确定” 以创建突出显示活动突触的差异图像（图 4B）。
2. 定义要分析的感兴趣区域 （ROI）。
   1. 选择“编辑>选择>指定并在步骤 6.1 中创建的差异图像上创建一个直径为 7 μm 的圆形 ROI。将 ROI 放在突出显示的活动突触上，然后按 T 在 ROI 管理器中添加 ROI。在图 4C-D 所示的代表性结果中，6 个 ROI 位于钮扣周围。
   2. 将另外 5 个相同大小的 ROI 放置在未观察到信号增加的区域。在下一步中，使用它们的平均荧光作为背景信号。通过选择 More （更多 ） 来保存 ROI >Save （从 ROI Manager 菜单中）。
3. 测量信号强度并计算荧光的实质性变化。
   1. 选择原始时序堆栈，并将步骤 6.2 中保存的 ROI 传输到堆栈中。选择 Analyze > Set Measurements 并仅选中 Mean gray value 复选框。通过从 ROI Manager 菜单中选择 More > Multi Measure 来测量所有时间点 ROI 中的平均荧光强度。
   2. 复制 Results （结果） 窗口中的所有值，并将其粘贴到电子表格程序中。从 5 个背景 ROI 中计算平均背景信号，并从每个突触 ROI 中减去它，这在每个钮扣中提供了荧光的显着变化（图 4D）。对单个数据视图中的所有数据进行平均（在本例中为 6 个钮扣），计为 n = 1 次实验。在 图 4E 中，通过将所有时间点的值除以初始基线期间的平均值，通过平均获得的每个轨迹表示为 F/F₀ 。
4. 通过曲线拟合估计荧光衰减时间常数 （tau）。
   1. 在 Igor Pro 中，通过选择 Window > New Table 打开新的数据表。从电子表格中复制时间点和 F/F₀ 数据，并将它们粘贴到表中的其他行中。选择 Window > New Graph（窗口新建图形），选择 F/F 0 数据作为 Y Wave（Y/F 0 数据），选择 Time point data（F/F₀ 数据）作为 X Wave（X 波形），然后按 Do It （执行） 创建一个图形。
   2. 选择 Window > Show Info（显示信息 窗口），通过将一个光标放在信号峰上，将另一个光标放在迹线末端来定义要分析的数据范围。选择 Analysis > Curve Fitting ，然后在 Function 下拉菜单中选择 exp_XOffset ，然后在 Wave 下拉菜单中选择相应的 X 和 Y Wave。
   3. 单击 Data Options 并按 Cursors 按钮设置曲线拟合范围。单击 Coefficients（系数），为 Y0 输入 1，然后按 Do It（执行）。通过该程序进行曲线拟合提供了一个 tau 值，该值代表荧光衰减的速率，它反映了 SV 内吞和再酸化的速率。
5. 如下所述执行手动漂移校正 （Optional）。
   1. 如果在图像采集期间发生图像漂移并且所选点移动到 7 μm 直径 ROI 之外，请运行手动漂移校正插件。通过选择 File （文件） > Open （打开） 在斐济打开时间序列图像堆栈。通过单击 Point 工具栏选择 Point 工具 。
   2. 找到最亮的钮扣作为地标，并在其中心放置一个点。按 T 将点添加到 ROI 管理器。对整个图像序列重复此过程。显示第一张图像，然后选择 Plugins > Registration > Manual Drift Correction。将校正后的图像序列堆栈保存为新文件，并将其用于分析。
      注意：虽然可以校正 X-Y 漂移，但此方法无法校正过大的 Z 漂移。

结果

如果制备的解剖样本没有严重的组织损伤，并且刺激电极正确插入脊髓，则高频电刺激可以引起强烈的 pHluorin 反应（图 4D，E）。刺激前基线荧光可能是由于突触前表面存在的探针。刺激过程中荧光的增加反映了探针向表面的胞吐释放。随后的衰变反映了含探针的 SV 的内吞作用和再酸化。基于 pHluorin 的探针的这些特性与之前在各种实验...

讨论

斑马鱼幼虫 NMJ 是研究突触生理学和病理学的新兴模型系统^26,31。已经产生了一种以神经元特异性方式表达 SpH 的转基因斑马鱼，并用于分析表现出运动缺陷的突变体¹⁷。温 et ^al.17 证明，在 WT 对照 NMJ 中以 100 Hz 刺激 1000 个 AP 期间，pHluorin 荧光增加了约 2 倍。相比之下，我们最近使用 VpHalo 的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion system	ALA	VCPlus-4G
5x objective	Olympus	NPLN5X
Custum made imaging chamber	Physiotech	custum made	A black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate.
Digital I/O device	Arduino	Uno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrate	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJ	https://imagej.net/	imageJ 1.54f
Fine forceps	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipette	IWAKI	IK-PAS-5P	The tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm.
Glass Petri dish	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
Inline solution heater	Warner Instruments	SF-28
LED illumination system	X-cyte	XYLIS
Methylen blue	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tube	Warner Instruments	64-1553
Motorized micromanipulator	Scientifica	PatchStar
Motorized movable sample plate	Scientifica	MMSP
Pipette holder	Narishige	H-13
Pipette puller	Narishige	PC-100
Platinum wire (φ0.1mm)	Nilaco	PT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)	Niaco	PT-351381
Scalpel	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS camera	Thorlabs	CC215MU
Sea salt	NAPQO	Instant Ocean
Stereo microscope	Olympus	SZX7
Stimulus isolater	AMPI	ISO-FLEX
Suction tube	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Theta glass capillary	Sutter Instrument	BT-150-10
Tricaine (MS-222)	TCI	T0941
Upright microscope	Olympus	BX51WI