Imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato

Riepilogo

La giunzione neuromuscolare larvale di pesce zebra è un modello interessante per lo studio della fisiologia sinaptica. È suscettibile di molte tecniche sperimentali, tra cui l'elettrofisiologia e l'imaging ottico. Qui, descriviamo un protocollo per l'imaging della trasmissione sinaptica utilizzando una sonda basata su pHluorin, sotto un microscopio a epifluorescenza verticale.

Abstract

La comunicazione neuronale è mediata dalla trasmissione sinaptica, che dipende principalmente dal rilascio di neurotrasmettitori immagazzinati nelle vescicole sinaptiche (SV) in risposta a un potenziale d'azione (AP). Poiché le SV vengono riciclate localmente al terminale presinaptico, il coordinamento dell'esocitosi SV e dell'endocitosi è importante per una trasmissione sinaptica sostenuta. Una proteina fluorescente verde sensibile al pH, chiamata pHluorin, fornisce un potente strumento per monitorare l'eso/endocitosi delle SV indirizzandola al lume delle SV. Tuttavia, il monitoraggio del riciclo delle SV guidato da AP con le sonde a base di pHluorin è ancora in gran parte limitato alle preparazioni di coltura in vitro , perché l'introduzione di sonde geneticamente codificate e la successiva imaging ottico sono tecnicamente impegnative in generale per i modelli animali in vivo o le preparazioni tissutali. Zebrafish è un sistema modello che offre caratteristiche preziose, tra cui la facilità di manipolazione genetica, la chiarezza ottica e il rapido sviluppo esterno. Recentemente abbiamo generato un pesce zebra transgenico che esprime altamente una sonda marcata con pHluorin ai terminali dei motoneuroni e abbiamo sviluppato un protocollo per monitorare l'eso/endocitosi SV guidata da AP alla giunzione neuromuscolare (NMJ), un modello di sinapsi ben consolidato che si forma in vivo. In questo articolo, mostriamo come preparare il preparato NMJ larvale di zebrafish adatto per l'imaging pHluorin. Dimostriamo anche che la preparazione consente l'imaging time-lapse con il microscopio a epifluorescenza verticale convenzionale, fornendo una piattaforma economica per l'analisi della funzione NMJ.

Introduzione

La trasmissione sinaptica, mediata dal rilascio di neurotrasmettitori dalle vescicole sinaptiche (SV) al terminale presinaptico, è un processo fondamentale alla base della funzione nervosa¹. Nei primi studi, la trasmissione sinaptica è stata misurata principalmente con tecniche elettrofisiologiche che rilevano la risposta postsinaptica suscitata dai neurotrasmettitori e dai loro recettori. Negli ultimi decenni, tuttavia, sono stati sviluppati diversi tipi di tecniche di imaging che visualizzano direttamente la funzione presinaptica². Una delle sonde più utilizzate è una proteina fluorescente verde sensibile al pH chiamata pHluorin ^3,4.

Il riciclaggio delle vescicole sinaptiche (SV) al terminale presinaptico è un processo cruciale per la trasmissione sostenuta dei neurotrasmettitori⁵. A seguito del rilascio di neurotrasmettitori per esocitosi delle SV, il cui lume è generalmente mantenuto a pH acido ^6,7, la membrana e le proteine SV vengono immediatamente recuperate dalla membrana plasmatica mediante endocitosi. Le SV di nuova formazione vengono quindi riacidificate e i neurotrasmettitori vengono ricaricati. Quando la pHluorin viene indirizzata nel lume SV fondendola con la proteina SV, mostra una fluorescenza minima allo stato di riposo. Tuttavia, dopo l'esocitosi SV, viene esposta al pH neutro nello spazio extracellulare, con conseguente fluorescenza brillante. Successivamente, la fluorescenza diminuisce gradualmente in seguito alla riacidificazione delle SV. Pertanto, la fluorescenza di pHluorin consente il monitoraggio dei processi di riciclo delle SV.

In studi pionieristici, la sinaptobrevina/VAMP 2, la proteina vescicolare SNARE (recettore solubile della proteina di attaccamento NSF) responsabile della fusione delle vescicole sinaptiche nelle sinapsi del proencefalo⁸ e la più abbondante tra le proteine SV⁹, è stata selezionata come partner di fusione per pHluorin, e la proteina di fusione risultante è stata designata come sinaptopHluorin (SpH)^3,4. Tuttavia, SpH ha mostrato un basso rapporto segnale/rumore (S/N) a causa della sostanziale espressione superficiale della sonda. Pertanto, altre proteine SV sono state testate come partner trasportatrici 10,11,12. Ad oggi, è stato dimostrato che i trasportatori vescicolari mostrano la più bassa espressione superficiale^di 13,14,15. L'uso di queste sonde è stato inizialmente stabilito in neuroni di mammiferi in coltura per tracciare^{il riciclo} di SV 8,9,10,11,12,13 guidato da AP ed è stato esteso ad altre preparazioni, inclusi tessuti sezionati e animali in vivo 16,17,18,19,20^,21,22.

Il pesce zebra larvale è un sistema modello con caratteristiche preziose, tra cui la facilità di manipolazione genetica, la chiarezza ottica e il rapido sviluppo esterno. Il pesce zebra transgenico che esprime pHluorin fusa con sinaptofisina, chiamato SypHy, è stato generato e applicato a molteplici configurazioni sperimentali, ad esempio, il monitoraggio della fusione SV spontanea dei neuroni spinali in vivo²¹, il riciclo SV AP-indipendente in sinapsi a nastro in vivo^20,22 o in cellule isolate 23,24,25. Tuttavia, l'applicazione dell'imaging pHluorin del riciclo SV guidato da AP nel modello zebrafish è ancora limitata.

La giunzione neuromuscolare (NMJ) funge da modello interessante per studiare la fisiologia sinaptica²⁶ e diversi studi hanno eseguito con successo l'imaging del riciclo SV guidato da AP con SpH nel topo ^18,19. L'uso di NMJ per il riciclaggio delle SV nel pesce zebra è stato sperimentato da Wen et ^al.16. Recentemente, abbiamo generato un pesce zebra Tg che esprime altamente la pHluorin marcata con un trasportatore vescicolare GABA (VGAT) specificamente nei motoneuroni²⁷. Questa sonda contiene anche un HaloTag in tandem con pHluorin alla coda luminale di VGAT ed è, quindi, chiamata VpHalo. Sebbene VGAT non sia espresso endogenamente nei motoneuroni colinergici, abbiamo confermato che VpHalo si localizza in tutti i pool di SV ed è correttamente riciclato in risposta agli AP combinando la registrazione elettrofisiologica, la marcatura SV dipendente dall'attività con i ligandi HaloTag e l'imaging dal vivo di pHluorin²⁷. A causa dell'alto livello di espressione e di una frazione superficiale minima di VpHalo, la preparazione di NMJ da questo pesce Tg ha permesso il monitoraggio del riciclo SV guidato da AP con un buon rapporto S/N. Inoltre, la scarsa distribuzione di NMJ nel corpo trasparente rende superflua la microscopia a scansione laser confocale per questo scopo. Sebbene il monitoraggio del riciclo delle SV guidato da AP nel pesce zebra intatto sia la direzione auspicabile per il futuro, è di primaria importanza stabilire la preparazione NMJ adatta a convalidare l'uso della sonda a base di pHluorin in condizioni ben controllate, come è stato fatto nelle preparazioni coltivate 3,4,10,11,12,13,14,15 . Qui, descriviamo un protocollo di dissezione per preparare un campione NMJ di pesce zebra larvale che può essere utilizzato per diversi tipi di esperimenti, ad esempio, la registrazione con patch clamp delle correnti della piastra terminale, l'etichettatura HaloTag delle SV riciclate e l'imaging dal vivo con pHluorin, come discusso sopra. Inoltre, ci siamo concentrati e abbiamo fornito un protocollo dettagliato per l'imaging dal vivo di pHluorin utilizzando questa preparazione NMJ sotto un microscopio epifluorescente convenzionale dotato di un dispositivo di stimolazione elettrica e di un sistema di perfusione in soluzione.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali presso l'Università medica e farmaceutica di Osaka. I pesci zebra sono stati allevati e mantenuti in un ciclo di 14 ore di luce a 10 ore di buio. Gli embrioni e le larve sono stati mantenuti a 28-30 °C in acqua d'uovo contenente lo 0,006% di sale marino e lo 0,01% di blu di metilene. Gli esperimenti sono stati condotti a 4-7 giorni dopo la fecondazione (dpf). Si raccomanda di nutrire i pesci due volte al giorno a partire da 5 dpf quando gli esperimenti vengono eseguiti dopo 6 dpf. Il substrato deve essere cambiato prima di ogni poppata.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare 200 mL di soluzione extracellulare (112 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glucosio, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7,3-7,4). Miscelare 6,4 mL di NaCl 3,5 M, 0,4 mL di 1 M KCl, 1 mL di HEPES 1 M (pH 7,5), 0,4 mL di 1 M CaCl₂, 0,2 mL di 1 M MgCl₂ e 360 mg di glucosio e aggiungere acqua ultrapura a 200 mL. Se il pH è al di fuori dell'intervallo 7,3-7,4, regolarlo con 1 M NaOH. Utilizzare la soluzione extracellulare appena preparata per ogni esperimento.
2. Preparare 100 mL di soluzione extracellulare contenente 3 μM di D-tubocurarina (D-TBC). Aggiungere 20 μL di soluzione madre D-TBC da 15 mM a 100 mL di soluzione extracellulare.
   NOTA: La soluzione madre D-TBC viene preparata in acqua e conservata a -20 °C.
   ATTENZIONE: Indossare guanti e fare i preparativi nel cappuccio quando si maneggia la polvere D-TBC. Si consiglia inoltre l'uso di guanti quando si maneggia la soluzione D-TBC.
3. Preparare 25 mL di soluzione extracellulare contenente lo 0,02% di tricaina (MS-222). Aggiungere 0,5 mL di soluzione madre di tricaina all'1% a 25 mL di soluzione extracellulare.
   NOTA: La soluzione madre di tricaina viene preparata in acqua e conservata a 4 °C. La tricaina viene utilizzata solo per la dissezione, non durante l'imaging.

2. Preparazione dell'elettrodo bipolare dal capillare in vetro theta

1. Tirare i capillari in vetro theta utilizzando l'estrattore per micropipette in modo che il diametro della punta sia compreso tra 3 e 10 μm (Figura 1A).
   NOTA: Si consiglia un protocollo con due o più passaggi per estrarre il capillare.
2. Collegare la pipetta in vetro theta (1,17 mm di diametro interno con 0,165 mm di spessore del setto) all'isolatore di stimolo. Riempire la pipetta con la soluzione extracellulare. Inserire un sottile filo di platino (0,1 mm di diametro) in ciascuna apertura del capillare in vetro theta e collegare l'estremità posteriore del filo all'isolatore di stimolo (Figura 1B). Fare attenzione a non cortocircuitare i due fili di platino.

3. Preparazione del campione

NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso con le larve di pesce zebra Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo)²⁷, in cui le seguenti due proteine, legate da un peptide di scissione P2A, sono state espresse bicistronicamente specificamente nei motoneuroni: una proteina fluorescente rossa reporter TagRFP e una proteina sensore VpHalo, che è una proteina di fusione di pHluorin e HaloTag nella parte luminale di VGAT (Figura 2A). Il promotore hb9 guida l'espressione del tTAad (tetracycline-controlled transactivator-advanced), che a sua volta induce l'espressione dei geni sotto il promotore composito dell'elemento di risposta alla tetraciclina (TRE). Il sistema di espressione inducibile da Tet aumenta il livello di espressione proteica. pHluorin consente il monitoraggio in tempo reale del riciclo delle SV dipendente dall'attività, mentre HaloTag visualizza le SV riciclate durante un determinato periodo etichettando in modo covalente la proteina fusa (Figura 2A). Sebbene entrambi i metodi abbiano vantaggi unici, in questo articolo ci concentriamo sull'imaging pHluorin.

1. Versare 25 ml di soluzione extracellulare contenente lo 0,02% di tricane nella capsula di Petri di vetro.
2. Per la dissezione, trasferire una larva nella capsula di Petri. Sbucciare la pelle della larva con due pinze sottili. Utilizzare la prima pinza per tenere la larva in posizione e pizzicare la pelle sul lato dorsale della vescica natatoria con le altre pinze (Figura 3A).
3. Rimuovere la vescica natatoria, gli organi interni e la testa con i bisturi. La pelle su entrambi i lati del corpo del pesce può spesso essere rimossa contemporaneamente, vedi Video 1.

4. Posizionamento del campione nella camera di imaging e inserimento dell'elettrodo stimolante

NOTA: Poiché il pH luminale a riposo della SV è inferiore a pH 6,0, la fluorescenza della pHluorin agli NMJ nei pesci vivi è appena osservabile (Figura 2B). Tuttavia, quando il lume SV era alcalinizzato, è stata osservata una localizzazione limitata di VpHalo agli NMJ (Figura 2C). In particolare, l'immagine confocale z-stack degli NMJ ha mostrato che non si sovrapponevano l'uno all'altro nel piano xy, ad eccezione dei bordi dei segmenti del corpo (Figura 2C). Sulla base di questa osservazione, abbiamo ipotizzato che il microscopio a epifluorescenza fosse applicabile per l'imaging dal vivo di VpHalo nelle larve di zebrafish, che è stato convalidato come dettagliato nel seguente protocollo.

1. Trasferire il campione nella camera di imaging (Figura 3B) utilizzando una pipetta Pasteur in vetro con punta lucidata a fuoco. Fissare meccanicamente il campione con un filo di nylon incollato a un filo di platino a forma di C in modo che sia orientato ad un angolo approssimativamente parallelo all'elettrodo stimolante. (Figura 3C).
   NOTA: In laboratorio è stato fabbricato un filo di platino a forma di C con un filo di nylon. Circa 1 cm di filo di platino di 0,5 mm di diametro è stato formato a forma di C e picchiettato con un martello per appiattirlo. Il filo di nylon può essere ottenuto da articoli per la casa. Abbiamo incollato il filo di nylon, che è stato ottenuto smontando uno scolapiatti da cucina disponibile in un negozio di alimentari. Un dispositivo di fissazione simile viene utilizzato di routine nell'esperimento della fetta di cervello²⁸.
2. Perfondere continuamente il campione con una soluzione extracellulare contenente 3 μM DI D-TBC a una velocità di circa 1,0 mL/min utilizzando un sistema di perfusione a flusso per gravità.
   NOTA: Si consiglia di controllare la temperatura della camera utilizzando un riscaldatore di soluzione in linea.
3. Inserire l'elettrodo di stimolazione nel midollo spinale. Tenere l'elettrodo preparato dalla pipetta di vetro theta al punto 2 sul supporto della pipetta dotato di micromanipolatore motorizzato. Inserire l'elettrodo nel campione in modo che la punta sia vicina ai motoneuroni spinali, che si trovano sul lato ventrale del midollo spinale e possono essere identificati come neuroni positivi per TagRFP in questo campione (Figura 3D). Far avanzare l'elettrodo con un angolo obliquo dal segmento adiacente alla posizione target.
   NOTA: Il confine tra i segmenti del corpo è denso e difficile da penetrare, quindi è necessario premere lentamente l'elettrodo. La posizione della punta dell'elettrodo è molto importante. Se è distante dal midollo spinale, stimola direttamente i muscoli adiacenti, provocando una grande immagine alla deriva nella successiva imaging time-lapse.

5. Acquisizione delle immagini

1. Selezionare la regione di imaging. Sulla base dell'immagine dal vivo della fluorescenza TagRFP, selezionare una regione di imaging che includa più di qualche bottone ed escluda quelli al confine del segmento corporeo (Figura 2C e Figura 4A). Scegliere la regione all'interno dello stesso segmento corporeo dell'elettrodo di stimolazione perché l'innervazione del motoneurone è limitata all'interno di un singolo segmento corporeo^29,30. Commutare l'unità del filtro a fluorescenza per la fluorescenza GFP/pHluorin.
   NOTA: In questa configurazione sperimentale, pHluorin è stato ripreso con filtri di eccitazione a 470/40 nm e di emissione a 510/20 nm. TagRFP è stato ripreso con filtri di eccitazione a 555/20 nm e filtri di emissione a 595/44 nm. Il software Micro-Manager viene utilizzato per controllare contemporaneamente l'acquisizione delle immagini con una fotocamera cMOS scientifica e l'otturatore TTL della sorgente luminosa a LED. Per sincronizzare l'acquisizione delle immagini e la stimolazione elettrica, Arduino viene utilizzato come dispositivo I/O digitale. Un'altra opzione che non richiede uno script è quella di utilizzare Digidata e il suo software di Molecular Devices.
2. Determinare l'impostazione del software di acquisizione delle immagini e del dispositivo I/O digitale in modo che l'acquisizione delle immagini e la stimolazione elettrica siano sincronizzate. Ottimizza l'esposizione e l'intensità della sorgente luminosa per acquisire un'immagine sufficientemente luminosa in modalità time-lapse a 1 Hz senza saturazione e inserisci il tempo di esposizione nel campo Esposizione [ms] della finestra principale di Micro-Manager.
3. Determina la frequenza di stimolazione, il numero di potenziali d'azione (AP) e il tempo tra l'inizio dell'acquisizione dell'immagine e l'erogazione della stimolazione, codificandoli nello script Arduino. A seconda dei parametri, determinare il numero di immagini acquisite corrispondente alla lunghezza totale di acquisizione dell'immagine e inserirlo nel campo Conteggio della finestra Acquisizione Multidimensionale del Micro-Manager. Impostare 1 s nel campo Intervallo per ottenere un'imaging time-lapse a 1 Hz. Per la stimolazione elettrica, erogare impulsi a tensione costante di 1 ms (70 mV) attraverso l'isolatore di stimolo.
4. Eseguire l'acquisizione delle immagini. Eseguire il comando digitalizzatore ed eseguire l'acquisizione dell'immagine. Verificare che non vi sia una deriva dell'immagine inaccettabile e che si possano osservare risposte di pHluorin. In caso contrario, la posizione dell'elettrodo non è corretta. Tornare al passaggio 4.2.
   NOTA: Il danno tissutale che può potenzialmente influenzare la risposta della pHluorin può essere facilmente identificato dall'immagine DIC delle fibre muscolari. Se non si osserva alcuna risposta della pHluorin in assenza di tale danno, il posizionamento degli elettrodi potrebbe non essere corretto. Questo può essere identificato come una grande deriva dell'immagine perché il posizionamento errato dell'elettrodo provoca la contrazione muscolare, come descritto nel passaggio 4.2. L'altro problema che a volte si traduce nell'incapacità di suscitare la risposta della pHluorin è l'aria intrappolata nel capillare di vetro theta, che porta all'isolamento elettrico dell'elettrodo. La contrazione muscolare dovuta a un posizionamento errato degli elettrodi provoca una deriva dell'immagine sull'asse Z, che non può essere corretta nelle successive analisi dell'immagine (vedere il passaggio 6.5). Pertanto, si consiglia di identificare ed escludere i dati con deviazioni dell'immagine di grandi dimensioni durante l'acquisizione dell'immagine.
5. A seconda dello scopo dell'esperimento, modificare l'intensità della stimolazione (cioè la frequenza e il numero di impulsi) e/o la temperatura. Salva le immagini time-lapse come una pila di serie temporali di immagini TIFF. Vedi il video 2.

6. Analisi delle immagini

NOTA: Utilizzare Fiji per eseguire le seguenti operazioni di elaborazione e analisi delle immagini. Utilizzare Microsoft Excel o un software per fogli di calcolo simile per calcolare i risultati della misurazione. Utilizzare Igor Pro per eseguire l'adattamento della curva sul risultato ottenuto.

1. Crea un'immagine di differenza che evidenzi le sinapsi attive come descritto di seguito.
   1. Apri la pila di immagini delle serie temporali nelle Figi scegliendo File > Apri. Se le immagini visualizzate sono scure, scegliere Immagine >Regola >Luminosità/Contrasto >Auto. Non fare clic su Applica, poiché ciò ridimensionerà l'intensità del segnale, rendendo impossibile un'ulteriore analisi. Scegliere Analizza > Imposta scala e immettere il fattore di calibrazione definito nella condizione di imaging.
   2. Crea una pila di cinque immagini scattate durante il periodo di pre-stimolo selezionando Immagine > Duplica e inserendo un numero appropriato che indichi l'intervallo della sequenza di immagini (ad esempio, 11-15 per l'esperimento con un periodo di pre-stimolo di 15 secondi).
   3. Selezionate Pile di immagini > > Progetto Z e selezionate Intensità media dal menu a discesa Tipo di proiezione. Premere OK per creare un'immagine rappresentativa del periodo pre-stimolo (Figura 4B). Il processo di media è importante per ridurre l'effetto delle fluttuazioni del segnale.
   4. Creare un'immagine media del periodo post-stimolo utilizzando un'elaborazione simile (Figura 4B). Duplicare una pila di cinque immagini subito dopo la fine della stimolazione (ad esempio, la 26-30a^{immagine per} il periodo di pre-stimolo di 15 s e l'esperimento del periodo di stimolo di 10 s). Seleziona Elabora > Calcolatore immagini e imposta l'immagine media pre-stimolo e l'immagine media post-stimolo rispettivamente come Immagine 1 e Immagine 2 nei menu a discesa.
   5. Selezionare Sottrai dal menu a discesa Operazione e premere OK per creare un'immagine di differenza che evidenzi le sinapsi attive (Figura 4B).
2. Definire le regioni di interesse (ROI) da analizzare.
   1. Seleziona Modifica > selezione > Specifica e crea un ROI circolare di 7 μm di diametro sull'immagine di differenza creata nel passaggio 6.1. Posiziona la ROI sulla sinapsi attiva evidenziata e premi T per aggiungere la ROI nel ROI Manager. Nel risultato rappresentativo mostrato nella Figura 4C-D, 6 ROI sono stati posizionati intorno ai botoni.
   2. Posizionare altre 5 ROI della stessa dimensione nelle regioni in cui non si osserva alcun aumento del segnale. Usa la loro fluorescenza media come segnale di fondo nel passaggio successivo. Salva le ROI selezionando Altro >Salva dal menu ROI Manager.
3. Misurare l'intensità del segnale e calcolare la variazione sostanziale della fluorescenza.
   1. Seleziona lo stack di serie temporali originale e trasferisci le ROI salvate nel passaggio 6.2 nello stack. Selezionare Analizza > Imposta misure e selezionare solo la casella di controllo Valore medio di grigio. Misura l'intensità media della fluorescenza nelle ROI in tutti i punti temporali selezionando Altro > Multi Misura dal menu ROI Manager.
   2. Copia tutti i valori nella finestra Risultati e incollali in un foglio di calcolo. Calcolare il segnale di fondo medio dalle 5 ROI di fondo e sottrarlo da ciascuna ROI sinaptica, che fornisce una variazione sostanziale della fluorescenza in ogni bouton (Figura 4D). Calcola la media di tutti i dati di una singola vista (in questo caso, 6 boton), conteggiati come n = 1 esperimento. Nella Figura 4E, ogni traccia ottenuta facendo la media è rappresentata come F/F₀ dividendo il valore in tutti i punti temporali per il valore medio durante il periodo di riferimento iniziale.
4. Stimare la costante di tempo di decadimento della fluorescenza (tau) mediante l'adattamento della curva.
   1. Apri una nuova tabella di dati in Igor Pro selezionando Finestra > Nuova tabella. Copia il punto temporale e i dati F/F₀ dal foglio di calcolo e incollali nella tabella in una riga diversa. Scegli Finestra > nuovo grafico, seleziona i dati F/F₀ come Onda Y e i dati del punto temporale come Onda X, quindi premi Fallo per creare un grafico.
   2. Scegliere Finestra > Mostra informazioni e definire l'intervallo di dati da analizzare posizionando un cursore sul picco del segnale e l'altro sulla fine della traccia. Selezionate Analisi > Adattamento curva (Curve Fitting ) e selezionate exp_XOffset nel menu a discesa Funzione (Function) e le onde X e Y appropriate nel menu a discesa Onda (Wave).
   3. Fare clic su Opzioni dati e premere il pulsante Cursori per impostare l'intervallo di adattamento della curva. Fare clic su Codici, immettere 1 per Y0 e premere Fallo. L'adattamento della curva con questa procedura fornisce un valore tau che rappresenta il tasso di decadimento della fluorescenza, che riflette i tassi di endocitosi e riacidificazione delle SV.
5. Eseguire la correzione manuale della deriva (opzionale) come descritto di seguito.
   1. Se si verifica una deriva dell'immagine e il punto selezionato si sposta al di fuori della ROI di 7 μm di diametro durante il periodo di acquisizione dell'immagine, eseguire il plug-in Manual Drift Correction. Aprire la pila di immagini delle serie temporali nelle Figi selezionando File > Apri. Seleziona lo strumento Punto facendo clic sulla barra degli strumenti Punto.
   2. Trova il bouton più luminoso come punto di riferimento e posiziona un punto al centro di esso. Premere T per aggiungere il punto al gestore ROI. Ripetere questo processo per l'intera sequenza di immagini. Visualizza la prima immagine e seleziona Plug-in > Registrazione > Correzione manuale della deriva. Salva la serie di immagini corretta come nuovo file e utilizzala per l'analisi.
      NOTA: Sebbene la deriva X-Y possa essere corretta, un'eccessiva deriva Z non è correggibile con questo metodo.

Risultati

Se il campione sezionato viene preparato senza gravi danni tissutali e l'elettrodo di stimolazione viene inserito correttamente nel midollo spinale, è possibile ottenere una robusta risposta della pHluorin mediante stimolazione elettrica ad alta frequenza (Figura 4D, E). La fluorescenza basale pre-stimolo era probabilmente dovuta alla sonda presente sulla superficie della presinapsi. L'aumento della fluorescenza durante la stimolazione rifl...

Discussione

La larva di zebrafish NMJ è un sistema modello emergente per lo studio della fisiologia e della patologia sinaptica^26,31. Un pesce zebra transgenico che esprime SpH in modo neurone-specifico è già stato generato e impiegato per l'analisi di un mutante che presenta un difetto locomotore¹⁷. Wen et ^al.17 hanno dimostrato un aumento di circa 2 volte della fluorescenza della pHluorin ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion system	ALA	VCPlus-4G
5x objective	Olympus	NPLN5X
Custum made imaging chamber	Physiotech	custum made	A black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate.
Digital I/O device	Arduino	Uno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrate	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJ	https://imagej.net/	imageJ 1.54f
Fine forceps	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipette	IWAKI	IK-PAS-5P	The tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm.
Glass Petri dish	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
Inline solution heater	Warner Instruments	SF-28
LED illumination system	X-cyte	XYLIS
Methylen blue	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tube	Warner Instruments	64-1553
Motorized micromanipulator	Scientifica	PatchStar
Motorized movable sample plate	Scientifica	MMSP
Pipette holder	Narishige	H-13
Pipette puller	Narishige	PC-100
Platinum wire (φ0.1mm)	Nilaco	PT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)	Niaco	PT-351381
Scalpel	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS camera	Thorlabs	CC215MU
Sea salt	NAPQO	Instant Ocean
Stereo microscope	Olympus	SZX7
Stimulus isolater	AMPI	ISO-FLEX
Suction tube	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Theta glass capillary	Sutter Instrument	BT-150-10
Tricaine (MS-222)	TCI	T0941
Upright microscope	Olympus	BX51WI