절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

요약

제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

뉴런 커뮤니케이션은 시냅스 전달에 의해 매개되며, 이는 주로 활동 전위(AP)에 대한 반응으로 시냅스 소포(SV)에 저장된 신경 전달 물질의 방출에 의존합니다. SV는 시냅스전 말단에서 국소적으로 재활용되기 때문에 SV 외포작용과 세포내이입의 조정은 지속적인 시냅스 전달에 중요합니다. pHluorin이라고 하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질은 SV 내강을 표적으로 삼아 SV 엑소/세포내이입(SV exo/endocytosis)을 모니터링할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 그러나 pHluorin 기반 프로브를 사용한 AP 기반 SV 재활용을 추적하는 것은 유전적으로 암호화된 프로브와 후속 광학 이미징의 도입이 일반적으로 in vivo 동물 모델 또는 조직 제제에 대해 기술적으로 어렵기 때문에 여전히 in vitro 배양 준비로 제한됩니다. 제브라피시(Zebrafish)는 유전자 조작의 용이성, 광학적 선명도, 빠른 외부 개발 등 유용한 기능을 제공하는 모델 시스템입니다. 최근에는 운동 뉴런 말단에서 pHluorin 표지 프로브를 고도로 발현하는 형질전환 제브라피시를 생성하고, 생체 내에서 형성되는 잘 정립된 시냅스 모델인 신경근 접합부(NMJ)에서 AP 기반 SV 엑소/내포작용(endocytosis)을 모니터링하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 기사에서는 pHluorin 이미징에 적합한 유충 제브라피시 NMJ 제제를 준비하는 방법을 보여줍니다. 또한 이 준비물을 통해 기존의 정립 형광 현미경에서 타임 랩스 이미징이 가능하여 NMJ 기능을 분석하기 위한 비용 효율적인 플랫폼을 제공한다는 것을 보여줍니다.

서문

시냅스전 말단의 시냅스 소포(SV)에서 신경전달물질 방출에 의해 매개되는 시냅스 전달은 신경 기능¹의 기저에 있는 기본 과정입니다. 초기 연구에서 시냅스 전달은 주로 신경전달물질과 그 수용체에 의해 유발되는 시냅스후 반응을 감지하는 전기생리학적 기술에 의해 측정되었습니다. 그러나 지난 수십 년 동안 시냅스전 기능²을 직접 시각화하는 여러 유형의 이미징 기술이 개발되었습니다. 가장 널리 사용되는 프로브 중 하나는 pHluorin ^3,4라고 하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질입니다.

시냅스전 말단에서 시냅스 소포(SV)를 재활용하는 것은 신경전달물질의 지속적인 전달을 위한 중요한 과정이다⁵. 내강이 일반적으로 산성 pH ^6,7로 유지되는 SV의 외세포작용(exocytosis)에 의한 신경전달물질의 방출 후, 세포내이입(endocytosis)에 의해 원형질막(plasma membrane)에서 세포막(membrane)과 SV 단백질이 즉시 회수됩니다. 그런 다음 새로 형성된 SV는 재산성화되고 신경전달물질은 재장전됩니다. pHluorin을 SV 단백질에 융합하여 SV 내강을 표적으로 삼으면 휴지 상태에서 최소한의 형광을 나타냅니다. 그러나 SV 엑소사이토시스 시에는 세포 외 공간에서 중성 pH에 노출되어 밝은 형광을 일으킵니다. 그 후, SV 재산성화 이후 형광이 점차 감소합니다. 따라서 pHluorin 형광을 통해 SV 재활용 프로세스를 모니터링할 수 있습니다.

선구적인 연구에서, 전뇌 시냅스⁸에서 시냅스 소포 융합을 담당하는 소포 SNARE(용해성 NSF 부착 단백질 수용체) 단백질이자 SV 단백질⁹ 중 가장 풍부한 시냅토브레빈/뱀프 2(synaptobrevin/VAMP 2)가 플루오린(pHluorin)의 융합 파트너로 선정되었으며, 그 결과로 생성된 융합 단백질은 시냅토플루오린(synaptopHluorin)^3,4으로 지정되었습니다. 그러나 SpH는 프로브의 상당한 표면 표현으로 인해 낮은 신호 대 잡음비(S/N) 비율을 나타냈습니다. 따라서 다른 SV 단백질은 운반체 파트너로 테스트되었습니다 10,11,12. 현재까지, 소포 수송체는 가장 낮은 표면 발현 ^13,14,15를 나타내는 것으로 입증되었습니다. 이러한 프로브의 사용은 처음에 AP 기반 SV 재활용 ^{8,9,10,11,12,13}을 추적하기 위해 배양된 포유류 뉴런에서 확립되었으며 해부된 조직 및 생체 내 동물 16,17,18,19,20을 포함한 다른 제제로 확장되었습니다.^21,22.

유충 제브라피쉬는 유전자 조작의 용이성, 광학적 선명도, 빠른 외부 발달 등 중요한 특성을 가진 모델 시스템입니다. SypHy라고 불리는 시냅토피신에 융합된 pHluorin을 발현하는 형질전환 제브라피시를 생성하여 여러 실험 설정, 예를 들어 생체 내 척추 뉴런의 자발적 SV 융합 모니터링 ²¹, 리본 유형 시냅스에서 AP 독립적 SV 재활용 in vivo^20,22 또는 고립된 세포 23,24,25 에 적용했습니다.. 그러나 제브라피시 모델에서 AP 기반 SV 재활용의 pHluorin 이미징 적용은 여전히 제한적입니다.

신경근 접합부(neuromuscular junction, NMJ)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델이며,²⁶ , 여러 연구에서 마우스^18,19에서 SpH를 이용한 AP 기반 SV 재활용 이미징을 성공적으로 수행했습니다. 제브라피시에서 SV 재활용을 위한 NMJ의 사용은 Wen et ^al.16에 의해 개척되었습니다. 최근에는 운동 뉴런에서 특히 수포형 GABA 수송체(VGAT)로 태그된 pHluorin을 고도로 발현하는 Tg 제브라피시를 생성했습니다²⁷. 이 프로브는 또한 VGAT의 내강 꼬리에 pHluorin과 함께 HaloTag를 포함하므로 VpHalo라고 명명됩니다. VGAT는 콜린성 운동 뉴런에서 내인성으로 발현되지 않지만, 전기생리학적 기록, HaloTag 리간드를 사용한 활성 의존적 SV 라벨링 및 pHluorin²⁷의 실시간 이미징을 결합하여 VpHalo가 모든 SV 풀에 국한되고 AP에 대한 반응으로 적절하게 재활용되는 것을 확인했습니다. 높은 수준의 발현과 VpHalo의 최소 표면 분율로 인해 이 Tg 물고기의 NMJ 제제는 우수한 S/N 비율로 AP 기반 SV 재활용을 모니터링할 수 있었습니다. 더욱이, 투명 물체에 NMJ가 희박하게 분포되어 있기 때문에 이러한 목적을 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 검사가 불필요합니다. 온전한 제브라피시에서 AP 기반 SV 재활용을 모니터링하는 것이 바람직한 미래 방향이지만, 배양 제제에서 수행된 것처럼 잘 통제된 조건에서 pHluorin 기반 프로브의 사용을 검증하기에 적합한 NMJ 제제를 확립하는 것이 가장 중요합니다 3,4,10,11,12,13,14,15 . 여기에서는 위에서 논의한 바와 같이 종판 전류의 패치 클램프 기록, 재활용 SV의 HaloTag 라벨링 및 pHluorin 라이브 이미징과 같은 여러 유형의 실험에 사용할 수 있는 유충 제브라피시 NMJ 샘플을 준비하기 위한 해부 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한, 전기 자극 장치와 용액 관류 시스템이 장착된 기존의 상피 형광 현미경에서 이 NMJ 제제를 사용하여 pHluorin의 실시간 이미징을 위한 자세한 프로토콜에 초점을 맞추고 제공했습니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 오사카 의과 약학 대학의 동물 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었습니다. 제브라피쉬는 14시간의 빛에서 10시간의 어두운 주기로 사육되고 유지되었습니다. 배아와 유충은 0.006%의 천일염과 0.01%의 메틸렌 블루를 함유하는 난수에서 28-30°C로 유지하였다. 실험은 수정 후 4-7일(dpf)에 수행되었습니다. 6 dpf 이후 실험을 수행할 때 5 dpf 이후부터 하루에 두 번 물고기에게 먹이를 주는 것이 좋습니다. 각 수유 전에 배지를 교체해야 합니다.

1. 솔루션 준비

1. 200mL의 세포외 용액(112mM NaCl, 2mM KCl, 10mM HEPES, 10mM 포도당, 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, pH 7.3-7.4)을 준비합니다. 3.5 M NaCl 6.4 mL, 1 M KCl 0.4 mL, 1 M HEPES (pH 7.5) 1 mL, 1 M CaCl₂ 0.4 mL, 1 M MgCl₂ 0.2 mL 및 포도당 360 mg을 혼합하고 200 mL에 초순수를 첨가한다. pH가 7.3-7.4 범위를 벗어나면 1M NaOH로 조정하십시오. 각 실험에 대해 갓 준비된 세포외 용액을 사용하십시오.
2. 3μM D-튜보쿠라린(D-TBC)을 함유한 세포 외 용액 100mL를 준비합니다. 100mL의 세포외 용액에 20μL의 15mM D-TBC 원액을 추가합니다.
   참고: D-TBC 원액은 물에 준비하여 -20°C에서 보관합니다.
   주의 : D-TBC 분말을 다룰 때는 장갑을 착용하고 후드에서 준비하십시오. D-TBC 용액을 취급할 때도 장갑을 착용하는 것이 좋습니다.
3. 0.02% 트리카인(MS-222)을 함유한 세포외 용액 25mL를 준비합니다. 1% 트리카인 원액 0.5mL를 세포외 용액 25mL에 첨가합니다.
   참고: 트리카인 원액은 물에 준비하여 4°C에서 보관합니다. 트리카인은 이미징 중이 아닌 해부에만 사용됩니다.

2. theta glass capillary로부터 양극성 전극의 제조

1. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 팁 직경이 3-10μm 범위가 되도록 세타 유리 모세관을 당깁니다(그림 1A).
   참고: 모세관을 당기기 위해 두 단계 이상의 프로토콜이 있는 프로토콜을 권장합니다.
2. theta 유리 피펫(내경 1.17mm, 셉텀 두께 0.165mm)을 Stimulus Isolator에 연결합니다. 피펫에 세포외 용액을 채웁니다. 세타 유리 모세관의 각 개구부에 얇은 백금 와이어(직경 0.1mm)를 삽입하고 와이어의 뒤쪽 끝을 Stimulus Isolator에 연결합니다(그림 1B). 두 개의 백금 와이어를 단락시키지 않도록 주의하십시오.

3. 시료 준비

참고: 이 프로토콜은 Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo) 얼룩물고기 유충²⁷과 함께 사용하도록 최적화되었으며, P2A 절단 펩타이드로 연결된 다음 두 단백질이 운동 뉴런에서 이중으로 발현되었습니다: 리포터 적색 형광 단백질 TagRFP와 센서 단백질 VpHalo는 pHluorin과 HaloTag의 융합 단백질인 VGAT의 내강 부분에 대한 융합 단백질입니다(그림 2A). hb9 promoter는 tTAad(tetracycline controlled transactivator-advanced)의 발현을 유도하고, 이는 다시 tetracycline response element (TRE) 복합 promoter 아래에서 유전자의 발현을 유도합니다. Tet-inducible 발현 시스템은 단백질 발현 수준을 증가시킵니다. pHluorin은 활성 의존적 SV 재활용을 실시간으로 모니터링할 수 있는 반면, HaloTag는 융합된 단백질을 공유 라벨링하여 주어진 기간 동안 재활용된 SV를 시각화합니다(그림 2A). 두 방법 모두 고유한 장점이 있지만 이 기사에서는 pHluorin 이미징에 중점을 둡니다.

1. 0.02% 트리칸이 함유된 세포외 용액 25mL를 유리 페트리 접시에 붓습니다.
2. 해부를 위해 유충을 페트리 접시로 옮깁니다. 두 개의 가는 집게로 유충의 피부를 벗겨냅니다. 첫 번째 집게를 사용하여 유충을 제자리에 고정하고 다른 집게로 부레의 등쪽 피부를 꼬집습니다(그림 3A).
3. 메스로 부레, 내부 장기, 머리를 제거합니다. 물고기 몸의 양쪽 피부는 종종 동시에 제거 할 수 있습니다 ( 비디오 1 참조).

4. 이미징 챔버에 시료 배치 및 자극 전극 삽입

참고: SV의 휴지 내강 pH가 pH 6.0 미만이기 때문에 살아있는 물고기의 NMJ에서 pHluorin 형광은 거의 관찰되지 않습니다(그림 2B). 그러나 SV 루멘이 알칼리화되었을 때 NMJ에 대한 VpHalo의 제한된 국소화가 관찰되었습니다(그림 2C). 특히, NMJ의 컨포칼 z-스택 이미지는 몸체 세그먼트의 가장자리를 제외하고는 xy 평면에서 서로 겹치지 않음을 보여주었습니다(그림 2C). 이 관찰을 바탕으로 우리는 epifluorescence microscope가 제브라피시 유충에서 VpHalo의 실시간 이미징에 적용 가능하다고 가정했으며, 이는 다음 프로토콜에 자세히 설명된 대로 검증되었습니다.

1. 파이어폴리싱 처리된 팁이 있는 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플을 이미징 챔버(그림 3B)로 옮깁니다. C자형 백금 와이어에 접착된 나일론 실로 샘플을 기계적으로 고정하여 자극 전극과 거의 평행한 각도로 향하도록 합니다. (그림 3C).
   참고: 나일론 실이 있는 C자형 백금 와이어가 실험실에서 제작되었습니다. 직경 0.5mm의 백금선 약 1cm를 C자 모양으로 만들고 망치로 두드려 평평하게 만들었습니다. 나일론 실은 가정 용품에서 얻을 수 있습니다. 우리는 식료품점에서 구할 수 있는 주방 배수구를 분해하여 얻은 나일론 실을 붙였습니다. 유사한 고정 장치가 뇌 절편 실험(²⁸)에서 일상적으로 사용된다.
2. 중력 흐름 관류 시스템을 사용하여 약 1.0mL/분의 속도로 3μM D-TBC를 함유한 세포 외 용액으로 샘플을 지속적으로 관류합니다.
   알림: 챔버 온도는 인라인 용액 히터를 사용하여 제어하는 것이 좋습니다.
3. 자극 전극을 척수에 삽입합니다. 2단계에서 theta glass 피펫으로 준비한 전극을 전동 micromanipulator가 장착된 피펫 홀더에 고정합니다. 전극을 샘플에 삽입하여 팁이 척수의 복부 쪽에 위치하며 이 샘플에서 TagRFP 양성 뉴런으로 식별할 수 있는 척추 운동 뉴런 근처에 있도록 합니다(그림 3D). 전극을 인접한 세그먼트에서 목표 위치로 비스듬한 각도로 전진시킵니다.
   알림: 신체 세그먼트 사이의 경계는 조밀하고 관통하기 어렵기 때문에 전극을 천천히 눌러야 합니다. 전극 팁의 위치는 매우 중요합니다. 척수에서 멀리 떨어져 있으면 인접한 근육을 직접 자극하여 후속 타임 랩스 이미징에서 큰 이미지가 드리프트됩니다.

5. 이미지 획득

1. 이미징 영역을 선택합니다. TagRFP 형광의 실시간 이미지를 기반으로 몇 개 이상의 부톤을 포함하고 신체 분절 경계에 있는 것을 제외한 이미징 영역을 선택합니다(그림 2C 및 그림 4A). 자극 전극의 동일한 신체 분절 내의 영역을 선택하는데, 그 이유는 운동 뉴런 신경 분포가 단일 신체 분절 내에서 제한되기 때문입니다^29,30. 형광 필터 장치를 GFP/pHluorin 형광으로 전환합니다.
   참고: 이 실험 설정에서 pHluorin은 470/40nm 여기 및 510/20nm 방출 필터로 이미지화되었습니다. TagRFP는 555/20nm 여기 및 595/44nm 방출 필터로 이미지화되었습니다. Micro-Manager 소프트웨어는 과학용 cMOS 카메라와 LED 광원의 TTL 셔터로 이미지 획득을 동시에 제어하는 데 사용됩니다. 이미지 획득과 전기 자극을 동기화하기 위해 Arduino는 디지털 I/O 디바이스로 사용됩니다. 스크립트가 필요하지 않은 또 다른 옵션은 Digidata와 Molecular Devices의 해당 소프트웨어를 사용하는 것입니다.
2. 이미지 획득 소프트웨어와 디지털 I/O 장치의 설정을 결정하여 이미지 획득과 전기 자극이 동기화되도록 합니다. 광원의 노출과 강도를 최적화하여 채도 없이 1Hz 타임랩스 모드에서 충분히 밝은 이미지를 얻고 메인 Micro-Manager 창의 노출[ms] 필드에 노출 시간을 입력합니다.
3. 자극 주파수, 활동 전위(AP)의 수, 이미지 획득 시작과 자극 전달 사이의 시간을 결정하고 Arduino 스크립트에 코딩합니다. 파라미터에 따라 이미지 획득의 총 길이에 해당하는 획득된 이미지의 수를 결정하고 Micro-Manager의 Multi-Dimensional Acquisition 창의 Count 필드에 입력합니다. 간격 필드에 1초를 설정하여 1Hz 타임랩스 이미징을 달성합니다. 전기 자극의 경우 자극 아이솔레이터를 통해 1ms 정전압 펄스(70mV)를 전달합니다.
4. 이미지 획득을 수행합니다. 디지타이저 명령을 실행하고 이미지 획득을 수행합니다. 허용할 수 없는 이미지 드리프트가 없고 pHluorin 반응을 관찰할 수 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면 전극 위치가 올바르지 않습니다. 4.2단계로 돌아갑니다.
   참고: pHluorin 반응에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 조직 손상은 근섬유의 DIC 이미지로 쉽게 식별할 수 있습니다. 이러한 손상이 없는 상태에서 pHluorin 반응이 관찰되지 않으면 전극 위치가 정확하지 않을 수 있습니다. 이는 4.2단계에서 설명한 것처럼 부적절한 전극 배치가 근육 수축을 유발하기 때문에 큰 이미지 드리프트로 식별될 수 있습니다. 때때로 pHluorin 반응을 유도하지 못하는 또 다른 문제는 세타 유리 모세관에 공기가 갇혀 전극의 전기 절연으로 이어집니다. 잘못된 전극 위치로 인한 근육 수축으로 인해 Z축에서 이미지 드리프트가 발생하며, 이는 후속 이미지 분석에서 수정할 수 없습니다(6.5단계 참조). 따라서 이미지 획득 중에 큰 이미지 드리프트가 있는 데이터를 식별하고 제외하는 것이 좋습니다.
5. 실험의 목적에 따라 자극 강도(즉, 주파수 및 펄스 수) 및/또는 온도를 변경합니다. 타임랩스 이미지를 TIFF 이미지의 시계열 스택으로 저장합니다. 동영상 2를 참조하십시오.

6. 이미지 분석

참고: 피지를 사용하여 다음 이미지 처리 및 분석을 수행합니다. Microsoft Excel 또는 유사한 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 측정 결과를 계산합니다. Igor Pro를 사용하여 얻은 결과에 대해 곡선 피팅을 수행합니다.

1. 아래 설명된 대로 활성 시냅스를 강조 표시하는 차이 이미지를 만듭니다.
   1. File > Open(열기)을 선택하여 피지에서 이미지의 시계열 스택을 엽니다. 표시된 이미지가 흐리면 이미지 >조정 >밝기/대비 >자동을 선택합니다. Apply를 클릭하면 신호 강도가 재조정되어 추가 분석이 불가능해지므로 클릭하지 마십시오. Analyze(분석) > Set Scale(스케일 설정)을 선택하고 이미징 조건에 정의된 보정 계수를 입력합니다.
   2. Image > Duplicate를 선택하고 이미지 시퀀스의 범위를 나타내는 적절한 숫자를 입력하여 사전 자극 기간 동안 촬영한 5개의 이미지 스택을 만듭니다(예: 15초의 사전 자극 기간이 있는 실험의 경우 11-15).
   3. Z 프로젝트> 이미지 > 스택을 선택하고 프로젝션 유형 드롭다운 메뉴에서 평균 강도를 선택합니다. OK를 눌러 사전 자극 기간의 대표 이미지를 생성합니다(그림 4B). 평균화 프로세스는 신호 변동의 영향을 줄이는 데 중요합니다.
   4. 유사한 처리를 사용하여 자극 후 기간의 평균 이미지를 생성합니다(그림 4B). 자극이 끝난 직후 5개의 이미지 스택을 복제합니다(예: 15초 사전 자극 기간 및 10초 자극 기간 실험에 대한 26-30^번째 이미지). Process > Image Calculator(이미지 계산기) 를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 평균 사전 자극 이미지와 평균 자극 후 이미지를 각각 Image 1 및 Image 2로 설정합니다.
   5. Operation 드롭다운 메뉴에서 Subtract 를 선택하고 OK 를 눌러 활성 시냅스를 강조하는 차이 이미지를 생성합니다(그림 4B).
2. 분석할 관심 영역(ROI)을 정의합니다.
   1. Edit > Selection > Select를 선택하고 6.1단계에서 생성한 차이 이미지에 대해 7μm 직경의 원형 ROI를 생성합니다. 강조 표시된 활성 시냅스에 ROI를 배치하고 T를 눌러 ROI Manager에 ROI를 추가합니다. 그림 4C-D에 표시된 대표 결과에서 6개의 ROI가 부통 주변에 배치되었습니다.
   2. 신호 증가가 관찰되지 않는 영역에 동일한 크기의 ROI를 5개 더 배치합니다. 다음 단계에서 평균 형광을 배경 신호로 사용합니다. ROI Manager 메뉴에서 More >Save 를 선택하여 ROI를 저장합니다.
3. 신호 강도를 측정하고 형광의 실질적인 변화를 계산합니다.
   1. 원래 시계열 스택을 선택하고 6.2단계에서 저장한 ROI를 스택으로 전송합니다. 분석 > 측정 설정을 선택하고 평균 회색 값 확인란만 선택합니다. ROI Manager 메뉴에서 More > Multi Measure 를 선택하여 모든 시점에 대한 ROI의 평균 형광 강도를 측정합니다.
   2. 결과 창의 모든 값을 복사하여 스프레드시트 프로그램에 붙여넣습니다. 5개의 백그라운드 ROI에서 평균 백그라운드 신호를 계산하고 각 시냅스 ROI에서 이 신호를 빼면 각 부톤에서 상당한 형광 변화가 나타납니다(그림 4D). 단일 보기(이 경우 6 boutons)의 모든 데이터를 평균화하고 n = 1 실험으로 계산합니다. 그림 4E에서 평균화로 얻은 각 트레이스는 모든 시점의 값을 초기 기준선 기간 동안의 평균값으로 나누어 F/F₀ 로 표시됩니다.
4. 곡선 피팅을 통해 형광 감쇠 시간 상수(tau)를 추정합니다.
   1. Igor Pro에서 Window > New Table을 선택하여 새 데이터 테이블을 엽니다. 스프레드시트에서 시점 및 F/F₀ 데이터를 복사하여 테이블의 다른 행에 붙여넣습니다. 창 > 새 그래프를 선택하고, F/F₀ 데이터를 Y 웨이브로, 시점 데이터를 X 웨이브로 선택한 다음, Do It을 눌러 그래프를 만듭니다.
   2. Window > Show Info를 선택하고 신호 피크에 커서를 놓고 트레이스 끝에 커서를 하나씩 놓아 분석할 데이터의 범위를 정의합니다. Analysis > Curve Fitting(곡선 피팅)을 선택하고 Function(함수) 드롭다운 메뉴에서 exp_XOffset파를 선택한 다음 Waves(웨이브) 드롭다운 메뉴에서 적절한 X Waves(X 웨이브와 Y 웨이브)를 선택합니다.
   3. 데이터 옵션(Data Options)을 클릭하고 커서(Cursors) 버튼을 눌러 곡선 피팅 범위를 설정합니다. 계수를 클릭하고 Y0에 1을 입력한 다음 Do It을 누릅니다. 이 절차에 의한 곡선 피팅은 형광 감소율을 나타내는 타우 값을 제공하며, 이는 SV 세포내이입 및 재산성화 속도를 반영합니다.
5. 아래 설명된 대로 수동 드리프트 보정(선택 사항)을 수행합니다.
   1. 이미지 드리프트가 발생하고 이미지 획득 기간 동안 선택한 스폿이 7μm 직경 ROI를 벗어나면 Manual Drift Correction 플러그인을 실행합니다. File > Open을 선택하여 피지에서 시계열 이미지 스택을 엽니다. Point 도구 모음에서 클릭하여 Point 도구를 선택합니다.
   2. 가장 밝은 부통을 랜드마크로 찾고 그 중앙에 점을 배치합니다. T 를 눌러 ROI 매니저에 포인트를 추가합니다. 전체 이미지 시퀀스에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 첫 번째 이미지를 표시하고 Plugins > Registration > Manual Drift Correction을 선택합니다. 수정된 이미지 시리즈 스택을 새 파일로 저장하고 분석에 사용합니다.
      참고: XY 드리프트는 수정할 수 있지만 과도한 Z 드리프트는 이 방법으로 수정할 수 없습니다.

결과

절개된 샘플이 심각한 조직 손상 없이 준비되고 자극 전극이 척수에 적절하게 삽입되면 고주파 전기 자극에 의해 강력한 플루오린 반응을 유도할 수 있습니다(그림 4D, E). pre-stimulus baseline fluorescence는 presynapse의 표면에 존재하는 프로브로 인한 것일 수 있습니다. 자극 중 형광의 증가는 프로브가 표면으로 방출되는 것을 반영합니다. 이?...

토론

유충 제브라피시 NMJ는 시냅스 생리학 및 병리학 연구를 위한 새로운 모델 시스템입니다^26,31. 뉴런 특이적 방식으로 SpH를 발현하는 형질전환 제브라피시(transgenic zebrafish)가 이미 생성되어 운동 결함¹⁷을 보이는 돌연변이의 분석에 사용되었다. Wen et ^al.17은 WT 대조군 NMJ에서 100Hz에서 1000개의 AP?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion system	ALA	VCPlus-4G
5x objective	Olympus	NPLN5X
Custum made imaging chamber	Physiotech	custum made	A black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate.
Digital I/O device	Arduino	Uno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrate	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJ	https://imagej.net/	imageJ 1.54f
Fine forceps	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipette	IWAKI	IK-PAS-5P	The tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm.
Glass Petri dish	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
Inline solution heater	Warner Instruments	SF-28
LED illumination system	X-cyte	XYLIS
Methylen blue	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tube	Warner Instruments	64-1553
Motorized micromanipulator	Scientifica	PatchStar
Motorized movable sample plate	Scientifica	MMSP
Pipette holder	Narishige	H-13
Pipette puller	Narishige	PC-100
Platinum wire (φ0.1mm)	Nilaco	PT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)	Niaco	PT-351381
Scalpel	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS camera	Thorlabs	CC215MU
Sea salt	NAPQO	Instant Ocean
Stereo microscope	Olympus	SZX7
Stimulus isolater	AMPI	ISO-FLEX
Suction tube	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Theta glass capillary	Sutter Instrument	BT-150-10
Tricaine (MS-222)	TCI	T0941
Upright microscope	Olympus	BX51WI