Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Die neuromuskuläre Verbindung der Zebrafischlarve ist ein attraktives Modell für die Untersuchung der synaptischen Physiologie. Es ist für viele experimentelle Techniken zugänglich, einschließlich Elektrophysiologie und optischer Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Abbildung der synaptischen Übertragung mit einer pHluorin-basierten Sonde unter einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop.

Zusammenfassung

Die neuronale Kommunikation wird durch synaptische Übertragung vermittelt, die hauptsächlich von der Freisetzung von Neurotransmittern abhängt, die in synaptischen Vesikeln (SVs) als Reaktion auf ein Aktionspotential (AP) gespeichert sind. Da SVs lokal am präsynaptischen Terminal recycelt werden, ist die Koordination von SV-Exozytose und Endozytose wichtig für eine anhaltende synaptische Übertragung. Ein pH-empfindliches grün fluoreszierendes Protein namens pHluorin bietet ein leistungsstarkes Werkzeug zur Überwachung der SV-Exozytose/Endozytose, indem es auf das SV-Lumen ausgerichtet ist. Die Verfolgung des AP-getriebenen SV-Recyclings mit den pHluorin-basierten Sonden ist jedoch noch weitgehend auf in vitro Kulturpräparate beschränkt, da die Einführung von genetisch kodierten Sonden und die anschließende optische Bildgebung für in vivo Tiermodelle oder Gewebepräparate generell eine technische Herausforderung darstellt. Zebrafish ist ein Modellsystem, das wertvolle Eigenschaften bietet, darunter einfache genetische Manipulation, optische Klarheit und schnelle externe Entwicklung. Wir haben kürzlich einen transgenen Zebrafisch erzeugt, der eine pHluorin-markierte Sonde an den Motoneuronenenden stark exprimiert, und ein Protokoll zur Überwachung der AP-gesteuerten SV-Exo/Endozytose an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) entwickelt, einem gut etablierten Synapsenmodell, das sich in vivo bildet. In diesem Artikel zeigen wir, wie man ein NMJ-Präparat für Zebrafischlarven vorbereitet, das für die pHluorin-Bildgebung geeignet ist. Wir zeigen auch, dass das Präparat eine Zeitraffer-Bildgebung unter einem herkömmlichen aufrechten Epifluoreszenzmikroskop ermöglicht und damit eine kostengünstige Plattform für die Analyse der NMJ-Funktion bietet.

Einleitung

Die synaptische Übertragung, die durch die Freisetzung von Neurotransmittern aus synaptischen Vesikeln (SVs) am präsynaptischen Ende vermittelt wird, ist ein grundlegender Prozess, der der Nervenfunktion zugrunde liegt¹. In frühen Studien wurde die synaptische Übertragung hauptsächlich durch elektrophysiologische Techniken gemessen, die die postsynaptische Reaktion detektierten, die von Neurotransmittern und ihren Rezeptoren ausgelöst wurde. In den letzten Jahrzehnten wurden jedoch verschiedene Arten von bildgebenden Verfahren entwickelt, die die präsynaptische Funktion direkt sichtbar machen². Eine der am weitesten verbreiteten Sonden ist ein pH-empfindliches grün fluoreszierendes Protein namens pHluorin ^3,4.

Das Recycling von synaptischen Vesikeln (SVs) am präsynaptischen Terminal ist ein entscheidender Prozess für die nachhaltige Übertragung von Neurotransmittern⁵. Nach der Freisetzung von Neurotransmittern durch Exozytose von SVs, deren Lumen im Allgemeinen auf einem sauren pH-Wert^{von 6,7} gehalten wird, werden die Membran- und SV-Proteine sofort durch Endozytose aus der Plasmamembran gewonnen. Neu gebildete SVs werden dann wieder angesäuert und Neurotransmitter werden neu geladen. Wenn pHluorin durch Fusion mit dem SV-Protein in das SV-Lumen eindringt, zeigt es im Ruhezustand eine minimale Fluoreszenz. Bei der SV-Exozytose wird es jedoch dem neutralen pH-Wert im extrazellulären Raum ausgesetzt, was zu einer hellen Fluoreszenz führt. In der Folge nimmt die Fluoreszenz nach der SV-Resäuerung allmählich ab. Daher ermöglicht die pHluorin-Fluoreszenz die Überwachung von SV-Recyclingprozessen.

In bahnbrechenden Studien wurde Synaptobrevin/VAMP 2, das vesikuläre SNARE-Protein (löslicher NSF-attachment protein receptor), das für die synaptische Vesikelfusion in den Vorderhirnsynapsen^{verantwortlich ist 8} und das häufigste unter den SV-Proteinen⁹, als Fusionspartner für pHluorin ausgewählt, und das resultierende Fusionsprotein wurde als synaptopHluorin (SpH) ^{bezeichnet3,4}. SpH wies jedoch ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) auf, was auf die hohe Oberflächenexpression der Sonde zurückzuführen ist. Daher wurden andere SV-Proteine als Trägerpartner getestet 10,11,12. Bisher wurde gezeigt, dass vesikuläre Transporter die geringste Oberflächenexpression aufweisen 13,14,15. Die Verwendung dieser Sonden wurde ursprünglich in kultivierten Säugetierneuronen etabliert, um das AP-gesteuerte SV-Recycling^zu verfolgen 8,9,10,11,12,13 und wurde auf andere Präparate ausgeweitet, einschließlich präparierter Gewebe und In-vivo-Tiere 16,17,18,19,20,^21,22.

Die Zebrafischlarve ist ein Modellsystem mit wertvollen Eigenschaften, darunter einfache genetische Manipulation, optische Klarheit und schnelle äußere Entwicklung. Transgene Zebrafische, die an Synaptophysin fusioniertes Phluorin exprimieren, genannt SypHy, wurden erzeugt und auf mehrere Versuchsaufbauten angewendet, z.B. zur Überwachung der spontanen SV-Fusion von Spinalneuronen in vivo²¹, AP-unabhängiges SV-Recycling an bandartigen Synapsen in vivo^20,22 oder in isolierten Zellen 23,24,25. Die Anwendung der pHluorin-Bildgebung des AP-getriebenen SV-Recyclings im Zebrafischmodell ist jedoch noch begrenzt.

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) dient als attraktives Modell für die Untersuchung der synaptischen Physiologie²⁶, und mehrere Studien führten erfolgreich die Bildgebung von AP-getriebenem SV-Recycling mit SpH in der Maus^{durch 18,19}. Die Verwendung von NMJs für das SV-Recycling im Zebrafisch wurde von Wen et ^al.16 vorangetrieben. Kürzlich haben wir Tg-Zebrafische erzeugt, die mit einem vesikulären GABA-Transporter (VGAT) markiertes pHluorin spezifisch in Motoneuronen exprimieren²⁷. Diese Sonde enthält auch einen HaloTag im Tandem mit pHluorin am luminalen Schwanz von VGAT und wird daher VpHalo genannt. Obwohl VGAT in cholinergen Motoneuronen nicht endogen exprimiert wird, haben wir durch die Kombination von elektrophysiologischer Aufzeichnung, aktivitätsabhängiger SV-Markierung mit HaloTag-Liganden und Live-Bildgebung von pHluorin²⁷ bestätigt, dass VpHalo in allen SV-Pools lokalisiert und als Reaktion auf APs korrekt recycelt wird. Aufgrund des hohen Expressionsniveaus und eines minimalen Oberflächenanteils von VpHalo ermöglichte die NMJ-Präparation aus diesem Tg-Fisch die Überwachung des AP-getriebenen SV-Recyclings mit einem guten S/N-Verhältnis. Darüber hinaus macht die spärliche Verteilung der NMJs im transparenten Körper die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie für diesen Zweck überflüssig. Obwohl die Überwachung des AP-getriebenen SV-Recyclings in intakten Zebrafischen die wünschenswerte zukünftige Richtung ist, ist es von primärer Bedeutung, das NMJ-Präparat zu etablieren, das geeignet ist, die Verwendung der pHluorin-basierten Sonde unter gut kontrollierten Bedingungen zu validieren, wie dies bei den kultivierten Präparaten 3,4,10,11,12,13,14,15 der Fall war . Hier beschreiben wir ein Dissektionsprotokoll zur Präparation einer NMJ-Probe von Zebrafischlarven, das für verschiedene Arten von Experimenten verwendet werden kann, z. B. die Patch-Clamp-Aufzeichnung von Endplattenströmen, die HaloTag-Markierung von recycelten SVs und die pHluorin-Live-Bildgebung, wie oben beschrieben. Darüber hinaus konzentrierten wir uns auf die Live-Bildgebung von pHluorin unter Verwendung dieses NMJ-Präparats unter Verwendung eines konventionellen Epifluoreszenzmikroskops, das mit einem elektrischen Stimulationsgerät und einem Lösungsperfusionssystem ausgestattet war, und stellten ein detailliertes Protokoll zur Verfügung.

Protokoll

Alle Eingriffe an Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren an der Medizinischen und Pharmazeutischen Universität Osaka durchgeführt. Die Zebrafische wurden unter einem 14-stündigen Licht- bis 10-Stunden-Dunkelzyklus aufgezogen und gehalten. Die Embryonen und Larven wurden bei 28-30 °C in Eiwasser gehalten, das 0,006 % Meersalz und 0,01 % Methylenblau enthielt. Die Experimente wurden 4-7 Tage nach der Befruchtung (dpf) durchgeführt. Es wird empfohlen, die Fische ab 5 dpf zweimal täglich zu füttern, wenn Versuche nach 6 dpf durchgeführt werden. Das Medium muss vor jeder Fütterung gewechselt werden.

1. Herstellung von Lösungen

1. Bereiten Sie 200 mL extrazelluläre Lösung vor (112 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glukose, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7,3-7,4). Mischen Sie 6,4 ml 3,5 m NaCl, 0,4 ml 1 m KCl, 1 ml 1 m HEPES (pH 7,5), 0,4 ml 1 m CaCl₂, 0,2 ml 1 m MgCl₂ und 360 mg Glukose und fügen Sie 200 ml Reinstwasser hinzu. Wenn der pH-Wert außerhalb des Bereichs von 7,3-7,4 liegt, stellen Sie ihn mit 1 M NaOH ein. Verwenden Sie für jedes Experiment die frisch zubereitete extrazelluläre Lösung.
2. Bereiten Sie 100 ml extrazelluläre Lösung vor, die 3 μM D-Tubocurarin (D-TBC) enthält. 20 μl 15 mM D-TBC-Stammlösung zu 100 ml extrazellulärer Lösung hinzufügen.
   HINWEIS: Die D-TBC-Stammlösung wird in Wasser hergestellt und bei -20 °C gelagert.
   ACHTUNG: Tragen Sie Handschuhe und bereiten Sie sich in der Haube vor, wenn Sie mit D-TBC-Pulver umgehen. Auch beim Umgang mit der D-TBC-Lösung werden Handschuhe empfohlen.
3. Bereiten Sie 25 ml extrazelluläre Lösung mit 0,02 % Tricain (MS-222) vor. Fügen Sie 0,5 ml 1%ige Tricain-Stammlösung zu 25 ml extrazellulärer Lösung hinzu.
   HINWEIS: Die Tricain-Stammlösung wird in Wasser zubereitet und bei 4 °C gelagert. Tricain wird nur zum Sezieren verwendet, nicht während der Bildgebung.

2. Vorbereitung der bipolaren Elektrode aus Theta-Glaskapillare

1. Ziehen Sie Theta-Glaskapillaren mit dem Mikropipettenabzieher, so dass der Spitzendurchmesser im Bereich von 3-10 μm liegt (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Wir empfehlen ein Protokoll mit zwei oder mehr Schritten zum Ziehen der Kapillare.
2. Verbinden Sie die Thetaglaspipette (1,17 mm Innendurchmesser mit 0,165 mm Septumdicke) mit dem Stimulus Isolator. Füllen Sie die Pipette mit der extrazellulären Lösung. Führen Sie einen dünnen Platindraht (0,1 mm Durchmesser) in jede Öffnung der Thetaglaskapillare ein und verbinden Sie das hintere Ende des Drahtes mit dem Stimulus-Isolator (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, die beiden Platindrähte nicht kurzzuschließen.

3. Vorbereitung der Probe

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die Verwendung mit Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo) Zebrafischlarven²⁷ optimiert, in denen die folgenden beiden Proteine, die durch ein P2A-Spaltpeptid verbunden sind, spezifisch in Motoneuronen biistronisch exprimiert wurden: ein rot fluoreszierendes Reporterprotein TagRFP und ein Sensorprotein VpHalo, das ein Fusionsprotein von pHluorin und HaloTag zum luminalen Teil von VGAT ist (Abbildung 2A). Der hb9-Promotor steuert die Expression des tTAad (Tetracyclin-controlled transactivator-advanced), was wiederum die Expression der Gene unter dem zusammengesetzten Promotor des Tetracyclin-Response-Elements (TRE) induziert. Das Tet-induzierbare Expressionssystem erhöht das Niveau der Proteinexpression. pHluorin ermöglicht die Live-Überwachung des aktivitätsabhängigen SV-Recyclings, während HaloTag SVs, die während eines bestimmten Zeitraums recycelt wurden, durch kovalente Markierung des fusionierten Proteins visualisiert (Abbildung 2A). Obwohl beide Methoden einzigartige Vorteile haben, konzentrieren wir uns in diesem Artikel auf die pHluorin-Bildgebung.

1. Gießen Sie 25 ml extrazelluläre Lösung mit 0,02 % Trican in die Petrischalen aus Glas.
2. Zum Sezieren geben Sie eine Larve in die Petrischale. Schälen Sie die Haut der Larve mit zwei feinen Pinzetten. Halten Sie die Larve mit der ersten Pinzette fest und kneifen Sie die Haut auf der dorsalen Seite der Schwimmblase mit der anderen Pinzette zusammen (Abbildung 3A).
3. Entferne die Schwimmblase, die inneren Organe und den Kopf mit Skalpellen. Die Haut auf beiden Seiten des Fischkörpers kann oft gleichzeitig entfernt werden, siehe Video 1.

4. Platzierung der Probe in der Bildgebungskammer und Einführung der Stimulationselektrode

HINWEIS: Da der luminale pH-Wert des SV im Ruhezustand unter pH 6,0 liegt, ist die pHluorin-Fluoreszenz an NMJs in lebenden Fischen kaum beobachtbar (Abbildung 2B). Wenn das SV-Lumen jedoch alkalisiert wurde, wurde eine eingeschränkte Lokalisation von VpHalo an NMJs beobachtet (Abbildung 2C). Bemerkenswert ist, dass das konfokale Z-Stapel-Bild der NMJs zeigte, dass sie sich in der xy-Ebene nicht überlappten, mit Ausnahme der Kanten der Körpersegmente (Abbildung 2C). Basierend auf dieser Beobachtung postulierten wir, dass das Epifluoreszenzmikroskop für die Live-Bildgebung von VpHalo in Zebrafischlarven geeignet ist, was wie im folgenden Protokoll beschrieben validiert wurde.

1. Übertragen Sie die Probe mit einer Pasteur-Glaspipette mit feuerpolierter Spitze in die Bildgebungskammer (Abbildung 3B). Fixieren Sie die Probe mechanisch mit einem Nylonfaden, der auf einen C-förmigen Platindraht geklebt ist, so dass sie in einem Winkel annähernd parallel zur Stimulationselektrode ausgerichtet ist. (Abbildung 3C).
   HINWEIS: Im Labor wurde ein C-förmiger Platindraht mit einem Nylonfaden hergestellt. Etwa 1 cm Platindraht mit einem Durchmesser von 0,5 mm wurde zu einer C-Form geformt und mit einem Hammer abgeklopft, um ihn abzuflachen. Nylonfaden kann aus Haushaltsgegenständen gewonnen werden. Wir haben den Nylonfaden geklebt, der durch die Demontage einer in einem Lebensmittelgeschäft erhältlichen Küchenabtropffläche erhalten wurde. Eine ähnliche Fixierungsvorrichtung wird routinemäßig im Gehirnschnitt-Experiment²⁸ verwendet.
2. Die Probe wird kontinuierlich mit einer extrazellulären Lösung perfundiert, die 3 μM D-TBC mit einer Geschwindigkeit von ca. 1,0 ml/min unter Verwendung eines Schwerkraftfluss-Perfusionssystems enthält.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die Kammertemperatur mit einer Inline-Lösungsheizung zu regeln.
3. Führen Sie die Stimulationselektrode in das Rückenmark ein. Halten Sie die Elektrode, die in Schritt 2 aus der Thetaglaspipette hergestellt wurde, auf den Pipettenhalter, der mit dem motorisierten Mikromanipulator ausgestattet ist. Führen Sie die Elektrode so in die Probe ein, dass sich die Spitze in der Nähe der spinalen Motoneuronen befindet, die sich auf der ventralen Seite des Rückenmarks befinden und in dieser Probe als TagRFP-positive Neuronen identifiziert werden können (Abbildung 3D). Schieben Sie die Elektrode in einem schrägen Winkel vom angrenzenden Segment in die Zielposition.
   HINWEIS: Die Grenze zwischen den Körpersegmenten ist dicht und schwer zu durchdringen, daher ist es notwendig, die Elektrode langsam zu drücken. Die Position der Elektrodenspitze ist sehr wichtig. Ist es vom Rückenmark entfernt, stimuliert es direkt die angrenzenden Muskeln, was dazu führt, dass in der anschließenden Zeitrafferaufnahme ein großes Bild driftet.

5. Bilderfassung

1. Wählen Sie den Imaging-Bereich aus. Wählen Sie basierend auf dem Live-Bild der TagRFP-Fluoreszenz eine Bildgebungsregion aus, die mehr als ein paar Boutons umfasst und diejenigen an der Körpersegmentgrenze ausschließt (Abbildung 2C und Abbildung 4A). Wählen Sie die Region innerhalb desselben Körpersegments der Stimulationselektrode, da die Innervation des Motoneurons innerhalb eines einzigen Körpersegments begrenzt ist^29,30. Schalten Sie die Fluoreszenzfiltereinheit auf GFP/pHluorin-Fluoreszenz um.
   HINWEIS: In diesem Versuchsaufbau wurde pHluorin mit 470/40 nm Anregung und 510/20 nm Emissionsfiltern abgebildet. TagRFP wurde mit 555/20 nm Anregungs- und 595/44 nm Emissionsfiltern abgebildet. Die Micro-Manager-Software wird verwendet, um die Bilderfassung gleichzeitig mit einer wissenschaftlichen cMOS-Kamera und dem TTL-Verschluss der LED-Lichtquelle zu steuern. Um Bildaufnahme und elektrische Stimulation zu synchronisieren, wird Arduino als digitales I/O-Gerät verwendet. Eine weitere Möglichkeit, für die kein Skript erforderlich ist, ist die Verwendung von Digidata und seiner Software von Molecular Devices.
2. Bestimmen Sie die Einstellung der Bilderfassungssoftware und des digitalen I/O-Geräts, sodass Bildaufnahme und elektrische Stimulation synchronisiert werden. Optimieren Sie die Belichtung und Intensität der Lichtquelle, um ein ausreichend helles Bild in einem 1-Hz-Zeitraffermodus ohne Sättigung zu erhalten, und geben Sie die Belichtungszeit in das Feld Belichtung [ms] des Hauptfensters des Micro-Manager-Fensters ein.
3. Bestimmen Sie die Stimulationsfrequenz, die Anzahl der Aktionspotentiale (APs) und die Zeit zwischen dem Beginn der Bildaufnahme und der Stimulationsabgabe, indem Sie sie im Arduino-Skript codieren. Bestimmen Sie in Abhängigkeit von den Parametern die Anzahl der aufgenommenen Bilder, die der Gesamtlänge der Bildaufnahme entspricht, und geben Sie sie in das Feld Anzahl des Fensters Mehrdimensionale Aufnahme des Mikromanagers ein. Stellen Sie 1 s in das Intervallfeld ein, um eine Zeitrafferaufnahme von 1 Hz zu erzielen. Für die elektrische Stimulation geben Sie 1 ms Konstantspannungsimpulse (70 mV) über den Stimulusisolator ab.
4. Führen Sie die Bildaufnahme durch. Führen Sie den Digitizer-Befehl aus und führen Sie die Bildaufnahme durch. Stellen Sie sicher, dass keine inakzeptable Bilddrift vorliegt und dass pHluorin-Reaktionen beobachtet werden können. Andernfalls ist die Elektrodenposition falsch. Kehren Sie zu Schritt 4.2 zurück.
   HINWEIS: Gewebeschäden, die möglicherweise die pHluorin-Reaktion beeinträchtigen können, können anhand des DIC-Bildes der Muskelfasern leicht identifiziert werden. Wenn keine pHluorin-Reaktion beobachtet wird, wenn keine solche Schädigung vorliegt, kann die Elektrodenpositionierung falsch sein. Dies kann als große Bilddrift identifiziert werden, da eine falsche Elektrodenpositionierung eine Muskelkontraktion verursacht, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Das andere Problem, das manchmal dazu führt, dass die pHluorin-Reaktion nicht ausgelöst wird, ist die in der Thetaglaskapillare eingeschlossene Luft, die zu einer elektrischen Isolierung der Elektrode führt. Eine Muskelkontraktion durch falsche Elektrodenpositionierung führt zu einer Bilddrift in der Z-Achse, die in nachfolgenden Bildanalysen nicht korrigiert werden kann (siehe Schritt 6.5). Daher wird empfohlen, Daten mit großen Bildabweichungen während der Bildaufnahme zu identifizieren und auszuschließen.
5. Je nach Zweck des Experiments ändern Sie die Stimulationsintensität (d. h. Frequenz und Anzahl der Impulse) und/oder die Temperatur. Speichern Sie die Zeitrafferbilder als Zeitserienstapel von TIFF-Bildern. Siehe Video 2.

6. Bildanalyse

HINWEIS: Verwenden Sie Fiji, um die folgende Bildverarbeitung und -analyse durchzuführen. Verwenden Sie Microsoft Excel oder eine ähnliche Tabellenkalkulationssoftware, um die Messergebnisse zu berechnen. Verwenden Sie Igor Pro, um die Kurvenanpassung des erhaltenen Ergebnisses durchzuführen.

1. Erstellen Sie ein Differenzbild, das aktive Synapsen hervorhebt, wie unten beschrieben.
   1. Öffnen Sie den Zeitserienstapel der Bilder in Fidschi, indem Sie Datei > Öffnen auswählen. Wenn die angezeigten Bilder dunkel sind, wählen Sie Bild >Anpassen >Helligkeit/Kontrast >Auto. Klicken Sie nicht auf Übernehmen, da dies die Signalintensität neu skaliert und eine weitere Analyse unmöglich macht. Wählen Sie Analysieren > Maßstab festlegen und geben Sie den Kalibrierungsfaktor ein, der in der Bildgebungsbedingung definiert ist.
   2. Erstellen Sie einen Stapel von fünf Bildern, die während der Vor-Stimulus-Phase aufgenommen wurden, indem Sie Bild > Duplizieren auswählen und eine entsprechende Zahl eingeben, die den Bereich der Bildsequenz angibt (z. B. 11-15 für das Experiment mit einer Vor-Stimulus-Periode von 15 s).
   3. Wählen Sie "Bild> "Stapel" > "Z-Projekt " und wählen Sie " Durchschnittliche Intensität" aus dem Dropdown-Menü "Projektionstyp". Drücken Sie OK , um ein repräsentatives Bild der Zeit vor dem Stimulus zu erstellen (Abbildung 4B). Der Mittelungsprozess ist wichtig, um die Auswirkungen von Signalschwankungen zu reduzieren.
   4. Erstellen Sie ein durchschnittliches Bild der Post-Stimulus-Periode mit einer ähnlichen Verarbeitung (Abbildung 4B). Duplizieren Sie einen Stapel von fünf Bildern unmittelbar nach dem Ende der Stimulation (z. B. das 26.-30^. Bild für die 15-s-Vor-Stimulus-Periode und das 10-s-Stimulus-Perioden-Experiment). Wählen Sie > Bildrechner verarbeiten und legen Sie das gemittelte Vor-Stimulus-Bild und das gemittelte Nach-Stimulus-Bild in den Dropdown-Menüs als Bild 1 bzw. Bild 2 fest.
   5. Wählen Sie Subtrahieren aus dem Dropdown-Menü Operation und drücken Sie OK , um ein Differenzbild zu erstellen, das aktive Synapsen hervorhebt (Abbildung 4B).
2. Definieren Sie die zu analysierenden Regionen (Regions of Interest, ROIs).
   1. Wählen Sie > Auswahl bearbeiten > Geben Sie einen kreisförmigen ROI mit einem Durchmesser von 7 μm für das in Schritt 6.1 erstellte Differenzbild an, und erstellen Sie es. Platzieren Sie den ROI auf der markierten aktiven Synapse und drücken Sie T, um den ROI im ROI-Manager hinzuzufügen. In dem repräsentativen Ergebnis, das in Abbildung 4C-D gezeigt ist, wurden 6 ROIs um die Boutons herum positioniert.
   2. Positionieren Sie weitere 5 ROIs derselben Größe in Regionen, in denen kein Signalanstieg zu beobachten ist. Verwenden Sie im nächsten Schritt ihre durchschnittliche Fluoreszenz als Hintergrundsignal. Speichern Sie die ROIs, indem Sie im Menü ROI-Manager die Option Mehr >Speichern auswählen.
3. Messen Sie die Signalintensität und berechnen Sie die wesentliche Änderung der Fluoreszenz.
   1. Wählen Sie den ursprünglichen Zeitreihen-Stack aus und übertragen Sie die in Schritt 6.2 gespeicherten ROIs auf den Stack. Wählen Sie Analysieren > Messungen festlegen aus, und aktivieren Sie nur das Kontrollkästchen Mittlerer Grauwert. Messen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität in den ROIs über alle Zeitpunkte, indem Sie im Menü des ROI-Managers die Option Mehr > Multi Measure auswählen.
   2. Kopieren Sie alle Werte im Ergebnisfenster und fügen Sie sie in ein Tabellenkalkulationsprogramm ein. Berechnen Sie das durchschnittliche Hintergrundsignal aus den 5 Hintergrund-ROIs und subtrahieren Sie es von jedem synaptischen ROI, was zu einer erheblichen Änderung der Fluoreszenz in jedem Bouton führt (Abbildung 4D). Mittelwert aller Daten aus einer einzelnen Ansicht (in diesem Fall 6 Boutons), gezählt als n = 1 Experiment. In Abbildung 4E wird jede durch Mittelwertbildung erhaltene Ablaufverfolgung als F/F₀ dargestellt, indem der Wert zu allen Zeitpunkten durch den Durchschnittswert während des anfänglichen Basiszeitraums dividiert wird.
4. Schätzen Sie die Fluoreszenzabklingzeitkonstante (tau) durch Kurvenanpassung.
   1. Öffnen Sie eine neue Datentabelle in Igor Pro, indem Sie Fenster > Neue Tabelle auswählen. Kopieren Sie den Zeitpunkt und die F/F_0-Daten aus der Tabelle, und fügen Sie sie in einer anderen Zeile in die Tabelle ein. Wählen Sie Fenster > Neues Diagramm, wählen Sie F/F_0-Daten als Y-Welle und Zeitpunktdaten als X-Welle aus, und drücken Sie Ausführen , um ein Diagramm zu erstellen.
   2. Wählen Sie Fenster > Info anzeigen und definieren Sie den Bereich der zu analysierenden Daten, indem Sie einen Cursor auf die Signalspitze und den anderen auf das Ende der Kurve setzen. Wählen Sie Analyse > Kurvenanpassung aus, und wählen Sie im Dropdown-Menü Funktion die Option exp_XOffset und im Dropdown-Menü Welle die entsprechenden X- und Y-Wellen aus.
   3. Klicken Sie auf Datenoptionen, und drücken Sie die Schaltfläche Cursor, um den Kurvenanpassungsbereich festzulegen. Klicken Sie auf Koeffizienten, geben Sie 1 für Y0 ein, und drücken Sie Ausführen. Die Kurvenanpassung nach diesem Verfahren liefert einen Tau-Wert, der die Geschwindigkeit des Fluoreszenzzerfalls darstellt, der die Raten der SV-Endozytose und -Wiederansäuerung widerspiegelt.
5. Führen Sie die manuelle Abweichungskorrektur (optional) wie unten beschrieben durch.
   1. Wenn eine Bilddrift auftritt und sich der ausgewählte Punkt während des Bildaufnahmezeitraums außerhalb des ROI von 7 μm Durchmesser bewegt, führen Sie das Plug-in für die manuelle Driftkorrektur aus. Öffnen Sie den Zeitreihen-Image-Stack in Fidschi, indem Sie Datei > Öffnen auswählen. Wählen Sie das Punktwerkzeug aus, indem Sie auf die Punktsymbolleiste klicken.
   2. Suchen Sie den hellsten Anstecker als Orientierungspunkt und platzieren Sie einen Punkt in der Mitte. Drücken Sie T , um den Punkt zum ROI-Manager hinzuzufügen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die gesamte Bildsequenz. Zeigen Sie das erste Bild an und wählen Sie Plugins > Registrierung > Manuelle Abweichungskorrektur aus. Speichern Sie den korrigierten Bildserienstapel als neue Datei, und verwenden Sie ihn für die Analyse.
      HINWEIS: Obwohl die X-Y-Drift korrigiert werden kann, kann eine übermäßige Z-Drift mit dieser Methode nicht korrigiert werden.

Ergebnisse

Wenn die präparierte Probe ohne schwere Gewebeschäden vorbereitet wird und die Stimulationselektrode korrekt in das Rückenmark eingeführt wird, kann durch hochfrequente elektrische Stimulation eine robuste pHluorin-Reaktion hervorgerufen werden (Abbildung 4D,E). Die Prästimulus-Ausgangsfluoreszenz war wahrscheinlich auf die Sonde zurückzuführen, die auf der Oberfläche der Präsynapse vorhanden war. Die Zunahme der Fluoreszenz währen...

Diskussion

Die Zebrafischlarve NMJ ist ein aufstrebendes Modellsystem für die Erforschung der synaptischen Physiologie und Pathologie ^26,31. Ein transgener Zebrafisch, der SpH neuronenspezifisch exprimiert, wurde bereits erzeugt und für die Analyse einer Mutante mit einem lokomotorischen Defekt eingesetzt¹⁷. Wen et ^al.17 zeigten einen etwa 2-fachen Anstieg der pHluorin-Fluoreszenz während d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion system	ALA	VCPlus-4G
5x objective	Olympus	NPLN5X
Custum made imaging chamber	Physiotech	custum made	A black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate.
Digital I/O device	Arduino	Uno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrate	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJ	https://imagej.net/	imageJ 1.54f
Fine forceps	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipette	IWAKI	IK-PAS-5P	The tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm.
Glass Petri dish	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
Inline solution heater	Warner Instruments	SF-28
LED illumination system	X-cyte	XYLIS
Methylen blue	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tube	Warner Instruments	64-1553
Motorized micromanipulator	Scientifica	PatchStar
Motorized movable sample plate	Scientifica	MMSP
Pipette holder	Narishige	H-13
Pipette puller	Narishige	PC-100
Platinum wire (φ0.1mm)	Nilaco	PT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)	Niaco	PT-351381
Scalpel	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS camera	Thorlabs	CC215MU
Sea salt	NAPQO	Instant Ocean
Stereo microscope	Olympus	SZX7
Stimulus isolater	AMPI	ISO-FLEX
Suction tube	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Theta glass capillary	Sutter Instrument	BT-150-10
Tricaine (MS-222)	TCI	T0941
Upright microscope	Olympus	BX51WI