Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Resumo

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Resumo

A comunicação neuronal é mediada pela transmissão sináptica, que depende principalmente da liberação de neurotransmissores armazenados nas vesículas sinápticas (SVs) em resposta a um potencial de ação (PA). Como os SVs são reciclados localmente no terminal pré-sináptico, a coordenação da exocitose e endocitose do SV é importante para a transmissão sináptica sustentada. Uma proteína fluorescente verde sensível ao pH, chamada pHluorina, fornece uma ferramenta poderosa para monitorar a exo/endocitose do SV, direcionando-a para o lúmen do SV. No entanto, o rastreamento da reciclagem de SV orientada por AP com as sondas baseadas em pHluorina ainda é amplamente limitado a preparações de cultura in vitro porque a introdução de sondas geneticamente codificadas e imagens ópticas subsequentes é tecnicamente desafiadora em geral para modelos animais in vivo ou preparações de tecidos. O peixe-zebra é um sistema modelo que oferece recursos valiosos, incluindo facilidade de manipulação genética, clareza óptica e rápido desenvolvimento externo. Recentemente, geramos um peixe-zebra transgênico que expressa altamente uma sonda marcada com pHluorina nos terminais do neurônio motor e desenvolvemos um protocolo para monitorar exo/endocitose SV orientada por AP na junção neuromuscular (NMJ), um modelo de sinapse bem estabelecido que se forma in vivo. Neste artigo, mostramos como preparar a preparação de larvas de peixe-zebra NMJ adequada para imagens de pHluorin. Também mostramos que a preparação permite imagens de lapso de tempo sob microscópio de epifluorescência vertical convencional, fornecendo uma plataforma econômica para analisar a função da JNM.

Introdução

A transmissão sináptica, mediada pela liberação de neurotransmissores das vesículas sinápticas (SVs) no terminal pré-sináptico, é um processo fundamental subjacente à função nervosa¹. Nos primeiros estudos, a transmissão sináptica foi medida principalmente por técnicas eletrofisiológicas que detectam a resposta pós-sináptica provocada por neurotransmissores e seus receptores. Nas últimas décadas, no entanto, vários tipos de técnicas de imagem foram desenvolvidos para visualizar diretamente a função pré-sináptica². Uma das sondas mais utilizadas é uma proteína fluorescente verde sensível ao pH chamada pHluorin ^3,4.

A reciclagem de vesículas sinápticas (SVs) no terminal pré-sináptico é um processo crucial para a transmissão sustentada de neurotransmissores⁵. Após a liberação de neurotransmissores por exocitose de SVs, cujo lúmen é geralmente mantido em pH ácido ^6,7, as proteínas de membrana e SV são imediatamente recuperadas da membrana plasmática por endocitose. As SVs recém-formadas são então reacidificadas e os neurotransmissores são recarregados. Quando a pHluorina é direcionada para o lúmen SV fundindo-o à proteína SV, ela exibe fluorescência mínima no estado de repouso. No entanto, após a exocitose do SV, ele é exposto ao pH neutro no espaço extracelular, resultando em fluorescência brilhante. Posteriormente, a fluorescência diminui gradualmente após a reacidificação do SV. Portanto, a fluorescência de pHluorina permite o monitoramento dos processos de reciclagem de SV.

Em estudos pioneiros, a sinaptobrevin/VAMP 2, a proteína vesicular SNARE (receptor de proteína de ligação NSF solúvel) responsável pela fusão de vesículas sinápticas nas sinapses do prosencéfalo⁸ e a mais abundante entre as proteínas SV⁹, foi selecionada como parceira de fusão para a pHluorina, e a proteína de fusão resultante foi designada como sinaptopHluorin (SpH)^3,4. No entanto, o SpH exibiu uma baixa relação sinal-ruído (S/N) devido à expressão superficial substancial da sonda. Portanto, outras proteínas SV foram testadas como parceiras transportadoras 10,11,12. Até o momento, os transportadores vesiculares demonstraram exibir a menor expressão de superfície 13,14,15. O uso dessas sondas foi inicialmente estabelecido em neurônios de mamíferos cultivados para rastrear a reciclagem de SV impulsionada por AP 8,9,10,11,12,13 e foi estendido a outras preparações, incluindo tecidos dissecados e animais in vivo 16,17,18,19,20,^21,22.

O peixe-zebra larval é um sistema modelo com características valiosas, incluindo facilidade de manipulação genética, clareza óptica e rápido desenvolvimento externo. O peixe-zebra transgênico expressando pHluorina fundida à sinaptofisina, chamado SypHy, foi gerado e aplicado a várias configurações experimentais, por exemplo, monitoramento da fusão espontânea de SV de neurônios espinhais in vivo²¹, reciclagem de SV independente de AP em sinapses do tipo fita in vivo^20,22 ou em células isoladas 23,24,25. No entanto, a aplicação de imagens de pHluorina da reciclagem de SV orientada por AP no modelo de peixe-zebra ainda é limitada.

A junção neuromuscular (NMJ) serve como um modelo atraente para estudar a fisiologia sináptica²⁶, e vários estudos realizaram com sucesso a reciclagem de VS orientada por AP com SpH em camundongos ^18,19. O uso de NMJs para reciclagem de VS em peixe-zebra foi iniciado por Wen et ^al.16. Recentemente, geramos peixes-zebra Tg que expressam altamente pHluorina marcada com um transportador GABA vesicular (VGAT) especificamente em neurônios motores²⁷. Esta sonda também contém um HaloTag em conjunto com pHluorin na cauda luminal do VGAT e é, portanto, chamada de VpHalo. Embora o VGAT não seja expresso endogenamente em neurônios motores colinérgicos, confirmamos que o VpHalo se localiza em todos os pools de SV e é devidamente reciclado em resposta aos APs, combinando registro eletrofisiológico, marcação de SV dependente de atividade com ligantes HaloTag e imagens ao vivo de pHluorin²⁷. Devido ao alto nível de expressão e uma fração superficial mínima de VpHalo, a preparação de NMJ a partir deste peixe Tg permitiu o monitoramento da reciclagem de SV impulsionada por AP com uma boa relação S/N. Além disso, a distribuição esparsa de NMJs no corpo transparente torna a microscopia confocal de varredura a laser desnecessária para esse fim. Embora o monitoramento da reciclagem de SV orientada por AP em peixe-zebra intacto seja a direção futura desejável, é de primordial importância estabelecer a preparação NMJ que seja adequada para validar o uso da sonda à base de pHluorina sob condições bem controladas, como foi feito em preparações cultivadas 3,4,10,11,12,13,14,15 . Aqui, descrevemos um protocolo de dissecação para preparar uma amostra NMJ de larva de peixe-zebra que pode ser usada para vários tipos de experimentos, por exemplo, registro de patch clamp de correntes de placa terminal, marcação HaloTag de SVs reciclados e imagem ao vivo de pHluorin, conforme discutido acima. Além disso, nos concentramos e fornecemos um protocolo detalhado para a imagem ao vivo de pHluorina usando esta preparação NMJ sob um microscópio epifluorescente convencional equipado com um dispositivo de estimulação elétrica e um sistema de perfusão de solução.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais na Universidade Médica e Farmacêutica de Osaka. Os peixes-zebra foram criados e mantidos sob um ciclo de 14 h de luz a 10 h de escuridão. Os embriões e larvas foram mantidos a 28-30 °C em água de ovo contendo 0,006% de sal marinho e 0,01% de azul de metileno. Os experimentos foram conduzidos em 4-7 dias pós-fertilização (dpf). Recomenda-se que os peixes sejam alimentados duas vezes ao dia a partir de 5 dpf, quando os experimentos forem realizados após 6 dpf. O meio deve ser trocado antes de cada mamada.

1. Preparação das soluções

1. Prepare 200 mL de solução extracelular (112 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM de glicose, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7,3-7,4). Misture 6,4 mL de NaCl 3,5 M, 0,4 mL de KCl 1 M, 1 mL de HEPES 1 M (pH 7,5), 0,4 mL de CaCl_{1 M 2}, 0,2 mL de 1 M MgCl₂ e 360 mg de glicose e adicione água ultrapura a 200 mL. Se o pH estiver fora da faixa de 7,3-7,4, ajuste-o com 1 M NaOH. Use a solução extracelular recém-preparada para cada experimento.
2. Prepare 100 mL de solução extracelular contendo 3 μM de D-tubocurarina (D-TBC). Adicione 20 μL de solução estoque de D-TBC a 15 mM a 100 mL de solução extracelular.
   NOTA: A solução-mãe de D-TBC é preparada em água e armazenada a -20 °C.
   CUIDADO: Use luvas e faça preparações no capuz ao manusear o pó D-TBC. Luvas também são recomendadas ao manusear a solução D-TBC.
3. Prepare 25 mL de solução extracelular contendo tricaína a 0,02% (MS-222). Adicione 0,5 mL de solução estoque de tricaína a 1% a 25 mL de solução extracelular.
   NOTA: A solução-mãe de tricaína é preparada em água e armazenada a 4 °C. A tricaína é usada apenas para dissecação, não durante a imagem.

2. Preparação do eletrodo bipolar a partir do capilar de vidro

1. Puxe os capilares de vidro usando o extrator de micropipeta de modo que o diâmetro da ponta fique na faixa de 3-10 μm (Figura 1A).
   NOTA: Recomendamos um protocolo com duas ou mais etapas para puxar o capilar.
2. Conecte a pipeta de vidro (1.17 mm de diâmetro interno com 0.165 mm de espessura do septo) ao Isolador de Estímulo. Encha a pipeta com a solução extracelular. Insira um fio de platina fino (0.1 mm de diâmetro) em cada abertura do capilar de vidro e conecte a extremidade traseira do fio ao isolador de estímulo (Figura 1B). Tenha cuidado para não causar curto-circuito nos dois fios de platina.

3. Preparação da amostra

NOTA: Este protocolo foi otimizado para uso com larvas de peixe-zebra Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo)²⁷, nas quais as duas proteínas a seguir, ligadas por um peptídeo de clivagem P2A, foram expressas bicistronicamente especificamente em neurônios motores: uma proteína fluorescente vermelha repórter TagRFP e uma proteína sensor VpHalo, que é uma proteína de fusão de pHluorin e HaloTag para a parte luminal do VGAT (Figura 2A). O promotor hb9 impulsiona a expressão do tTAad (transativador controlado por tetraciclina avançado), que por sua vez induz a expressão dos genes sob o promotor composto do elemento de resposta à tetraciclina (TRE). O sistema de expressão induzível por Tet aumenta o nível de expressão de proteínas. O pHluorin permite o monitoramento ao vivo da reciclagem de SV dependente da atividade, enquanto o HaloTag visualiza SVs reciclados durante um determinado período, marcando covalentemente a proteína fundida ( Figura 2A ). Embora ambos os métodos tenham vantagens únicas, neste artigo nos concentramos na imagem de pHluorina.

1. Despeje 25 mL de solução extracelular contendo 0,02% de tricano na placa de Petri de vidro.
2. Para dissecação, transfira uma larva para a placa de Petri. Descasque a pele da larva com duas pinças finas. Use a primeira pinça para manter a larva no lugar e aperte a pele do lado dorsal da bexiga natatória com a outra pinça (Figura 3A).
3. Remova a bexiga natatória, os órgãos internos e a cabeça com bisturis. A pele de ambos os lados do corpo do peixe pode ser removida simultaneamente, veja o Vídeo 1.

4. Colocação da amostra na câmara de imagem e inserção do eletrodo estimulante

NOTA: Como o pH luminal em repouso do SV está abaixo de pH 6,0, a fluorescência da pHluorina em NMJs em peixes vivos é quase inobservável (Figura 2B). No entanto, quando o lúmen SV foi alcalinizado, observou-se localização restrita de VpHalo às JNMs (Figura 2C). Notavelmente, a imagem confocal da pilha z das JNMs mostrou que elas não se sobrepunham no plano xy, exceto nas bordas dos segmentos do corpo (Figura 2C). Com base nessa observação, postulamos que o microscópio de epifluorescência era aplicável para imagens ao vivo de VpHalo em larvas de peixe-zebra, o que foi validado conforme detalhado no protocolo a seguir.

1. Transfira a amostra para a câmara de imagem (Figura 3B) usando uma pipeta Pasteur de vidro com uma ponta polida a fogo. Fixe mecanicamente a amostra com um fio de náilon colado a um fio de platina em forma de C de modo que fique orientado em um ângulo aproximadamente paralelo ao eletrodo de estimulação. (Figura 3C).
   NOTA: Um fio de platina em forma de C com um fio de náilon foi fabricado em laboratório. Aproximadamente 1 cm de fio de platina de 0,5 mm de diâmetro foi formado em forma de C e batido com um martelo para achatá-lo. O fio de nylon pode ser obtido de utensílios domésticos. Colamos o fio de náilon, que foi obtido desmontando um escorredor de cozinha disponível em uma mercearia. Um dispositivo de fixação semelhante é usado rotineiramente no experimento de corte de cérebro²⁸.
2. Perfundir continuamente a amostra com uma solução extracelular contendo 3 μM D-TBC a uma taxa de aproximadamente 1,0 mL / min usando um sistema de perfusão por fluxo por gravidade.
   NOTA: Recomenda-se que a temperatura da câmara seja controlada usando um aquecedor de solução em linha.
3. Insira o eletrodo de estimulação na medula espinhal. Segure o eletrodo preparado a partir da pipeta de vidro na etapa 2 no porta-pipetas equipado com o micromanipulador motorizado. Insira o eletrodo na amostra de forma que a ponta fique perto dos neurônios motores espinhais, que estão localizados no lado ventral da medula espinhal e podem ser identificados como neurônios positivos para TagRFP nesta amostra (Figura 3D). Avance o eletrodo em um ângulo oblíquo do segmento adjacente até a posição alvo.
   NOTA: O limite entre os segmentos do corpo é denso e difícil de penetrar, por isso é necessário pressionar o eletrodo lentamente. A posição da ponta do eletrodo é muito importante. Se estiver distante da medula espinhal, estimula os músculos adjacentes diretamente, resultando em uma grande imagem à deriva na imagem de lapso de tempo subsequente.

5. Aquisição de imagem

1. Selecione a região de imagem. Com base na imagem ao vivo da fluorescência TagRFP, selecione uma região de imagem que inclua mais do que alguns botões e exclua aqueles no limite do segmento corporal (Figura 2C e Figura 4A). Escolha a região dentro do mesmo segmento corporal do eletrodo de estimulação porque a inervação do neurônio motor é limitada em um único segmento corporal^29,30. Troque a unidade de filtro de fluorescência por fluorescência GFP/pHluorin.
   NOTA: Nesta configuração experimental, a pHluorina foi fotografada com filtros de excitação de 470/40 nm e emissão de 510/20 nm. O TagRFP foi fotografado com excitação de 555/20 nm e filtros de emissão de 595/44 nm. O software Micro-Manager é usado para controlar simultaneamente a aquisição de imagens com uma câmera cMOS científica e o obturador TTL da fonte de luz LED. Para sincronizar a aquisição de imagens e a estimulação elétrica, o Arduino é usado como um dispositivo de E/S digital. Outra opção que não requer um script é usar o Digidata e seu software da Molecular Devices.
2. Determine a configuração do software de aquisição de imagem e do dispositivo de E/S digital para que a aquisição de imagem e a estimulação elétrica sejam sincronizadas. Otimize a exposição e a intensidade da fonte de luz para adquirir uma imagem suficientemente brilhante em um modo de lapso de tempo de 1 Hz sem saturação e insira o tempo de exposição no campo Exposição [ms] da janela principal do Micro-Manager.
3. Determine a frequência de estimulação, o número de potenciais de ação (APs) e o tempo entre o início da aquisição da imagem e a entrega da estimulação, codificando-os no script Arduino. Dependendo dos parâmetros, determine o número de imagens adquiridas correspondente ao comprimento total da aquisição da imagem e insira-o no campo Contagem da janela Aquisição Multidimensional do Micro-Manager. Defina 1 s no campo Intervalo para obter imagens de lapso de tempo de 1 Hz. Para estimulação elétrica, forneça pulsos de tensão constante de 1 ms (70 mV) através do isolador de estímulo.
4. Execute a aquisição de imagens. Execute o comando digitalizador e execute a aquisição de imagem. Verifique se não há desvio de imagem inaceitável e se as respostas de pHluorina podem ser observadas. Caso contrário, a posição do eletrodo está incorreta. Retorne à etapa 4.2.
   NOTA: Danos teciduais que podem afetar potencialmente a resposta da pHluorina podem ser facilmente identificados pela imagem DIC das fibras musculares. Se nenhuma resposta de pHluorina for observada na ausência de tal dano, o posicionamento do eletrodo pode estar incorreto. Isso pode ser identificado como grande desvio de imagem porque o posicionamento inadequado do eletrodo causa contração muscular, conforme descrito na etapa 4.2. O outro problema que às vezes resulta em falha em induzir a resposta da pHluorina é o ar preso no capilar de vidro, o que leva ao isolamento elétrico do eletrodo. A contração muscular devido ao posicionamento incorreto do eletrodo causa desvio de imagem no eixo Z, que não pode ser corrigido em análises de imagem subsequentes (consulte a etapa 6.5). Portanto, recomenda-se que os dados com grandes desvios de imagem sejam identificados durante a aquisição da imagem e excluídos.
5. Dependendo do objetivo do experimento, altere a intensidade da estimulação (ou seja, frequência e número de pulsos) e/ou temperatura. Salve as imagens de lapso de tempo como uma pilha de séries temporais de imagens TIFF. Veja o vídeo 2.

6. Análise de imagem

NOTA: Use Fiji para executar o seguinte processamento e análise de imagem. Use o Microsoft Excel ou software de planilha semelhante para calcular os resultados da medição. Use o Igor Pro para realizar o ajuste da curva no resultado obtido.

1. Crie uma imagem de diferença que destaque as sinapses ativas, conforme descrito abaixo.
   1. Abra a pilha de imagens de séries temporais em Fiji escolhendo Arquivo > Abrir. Se as imagens exibidas estiverem esmaecidas, escolha Imagem >Ajustar >Brilho/Contraste >Automático. Não clique em Aplicar, pois isso redimensionará a intensidade do sinal, impossibilitando uma análise mais aprofundada. Escolha Analisar > Definir escala e insira o fator de calibração definido na condição de imagem.
   2. Crie uma pilha de cinco imagens tiradas durante o período de pré-estímulo selecionando Imagem > Duplicar e inserindo um número apropriado que indique o intervalo da sequência de imagens (por exemplo, 11-15 para o experimento com um período de pré-estímulo de 15 s).
   3. Selecione Pilhas de > de imagem > projeto Z e selecione Intensidade média no menu suspenso Tipo de projeção. Pressione OK para criar uma imagem representativa do período pré-estímulo (Figura 4B). O processo de média é importante para reduzir o efeito das flutuações de sinal.
   4. Crie uma imagem média do período pós-estímulo usando processamento semelhante (Figura 4B). Duplique uma pilha de cinco imagens imediatamente após o final da estimulação (por exemplo, a 26-30ª imagem para o período pré-estímulo de 15 s e o experimento do período de estímulo de 10 s). Selecione Processar > Calculadora de Imagens e defina a imagem média pré-estímulo e a imagem média pós-estímulo como Imagem 1 e Imagem 2 nos menus suspensos, respectivamente.
   5. Selecione Subtrair no menu suspenso Operação e pressione OK para criar uma imagem de diferença que destaque as sinapses ativas (Figura 4B).
2. Defina as regiões de interesse (ROIs) a serem analisadas.
   1. Selecione Editar > Seleção > Especifique e crie um ROI circular de 7 μm de diâmetro na imagem de diferença criada na etapa 6.1. Coloque o ROI na sinapse ativa destacada e pressione T para adicionar o ROI no ROI Manager. No resultado representativo mostrado na Figura 4C-D, 6 ROIs foram posicionadas ao redor dos botões.
   2. Posicione outras 5 ROIs do mesmo tamanho em regiões onde nenhum aumento de sinal é observado. Use sua fluorescência média como sinal de fundo na próxima etapa. Salve os ROIs selecionando Mais >Salvar no menu Gerenciador de ROI.
3. Meça a intensidade do sinal e calcule a mudança substancial na fluorescência.
   1. Selecione a pilha de séries temporais original e transfira os ROIs salvos na etapa 6.2 para a pilha. Selecione Analisar > Definir Medidas e marque apenas a caixa de seleção Valor médio de cinza. Meça a intensidade média de fluorescência nos ROIs em todos os pontos de tempo selecionando Mais > Medida múltipla no menu Gerenciador de ROI.
   2. Copie todos os valores na janela Resultados e cole-os em um programa de planilha. Calcule o sinal de fundo médio das 5 ROIs de fundo e subtraia-o de cada ROI sináptico, o que fornece uma mudança substancial de fluorescência em cada botão (Figura 4D). Calcule a média de todos os dados de uma única visualização (neste caso, 6 boutons), contados como n = 1 experimento. Na Figura 4E, cada traço obtido pela média é representado como F / F₀ , dividindo o valor em todos os pontos de tempo pelo valor médio durante o período inicial da linha de base.
4. Estime a constante de tempo de decaimento de fluorescência (tau) por ajuste de curva.
   1. Abra uma nova tabela de dados no Igor Pro selecionando Janela > Nova Tabela. Copie os dados do ponto de tempo e F / F₀ da planilha e cole-os na tabela em uma linha diferente. Escolha Janela > Novo gráfico, selecione os dados F/F₀ como Onda Y e os dados do ponto de tempo como Onda X e pressione Do It para criar um gráfico.
   2. Escolha Janela > Mostrar informações e defina o intervalo de dados a serem analisados colocando um cursor no pico do sinal e o outro no final do rastreamento. Escolha Análise > Ajuste de curva e selecione exp_XOffset no menu suspenso Função e as Ondas X e Y apropriadas no menu suspenso Onda.
   3. Clique em Opções de dados e pressione o botão Cursores para definir o intervalo de ajuste da curva. Clique em Coeficientes, insira 1 para Y0 e pressione Fazer. O ajuste da curva por este procedimento fornece um valor tau que representa a taxa de decaimento da fluorescência, que reflete as taxas de endocitose e reacidificação do SV.
5. Execute a correção manual de desvio (opcional) conforme descrito abaixo.
   1. Se ocorrer desvio de imagem e o ponto selecionado se mover para fora do ROI de 7 μm de diâmetro durante o período de aquisição da imagem, execute o plug-in de correção de desvio manual. Abra a pilha de imagens de série temporal em Fiji selecionando Arquivo > Abrir. Selecione a ferramenta Ponto clicando na barra de ferramentas Ponto.
   2. Encontre o bouton mais brilhante como um ponto de referência e coloque um ponto no centro dele. Pressione T para adicionar o ponto ao gerenciador de ROI. Repita esse processo para toda a sequência de imagens. Exiba a primeira imagem e selecione Plug-ins > Registro > Correção manual de desvio. Salve a pilha de séries de imagens corrigidas como um novo arquivo e use-a para análise.
      NOTA: Embora o desvio XY possa ser corrigido, o desvio Z excessivo não pode ser corrigido com este método.

Resultados

Se a amostra dissecada for preparada sem danos graves ao tecido e o eletrodo de estimulação for inserido adequadamente na medula espinhal, uma resposta robusta de pHluorina pode ser obtida por estimulação elétrica de alta frequência ( Figura 4D , E ). A fluorescência basal pré-estímulo foi provavelmente devido à sonda presente na superfície da pré-sinapse. O aumento da fluorescência durante a estimulação reflete a liberação ...

Discussão

A larva de peixe-zebra NMJ é um sistema modelo emergente para o estudo da fisiologia e patologia sináptica^26,31. Um peixe-zebra transgênico expressando SpH de maneira neuroespecífica já foi gerado e empregado para a análise de um mutante exibindo um defeito locomotor¹⁷. Wen et ^al.17 demonstraram um aumento de aproximadamente 2 vezes na fluorescência da pHluorina durante a est...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion system	ALA	VCPlus-4G
5x objective	Olympus	NPLN5X
Custum made imaging chamber	Physiotech	custum made	A black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate.
Digital I/O device	Arduino	Uno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrate	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJ	https://imagej.net/	imageJ 1.54f
Fine forceps	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipette	IWAKI	IK-PAS-5P	The tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm.
Glass Petri dish	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
Inline solution heater	Warner Instruments	SF-28
LED illumination system	X-cyte	XYLIS
Methylen blue	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tube	Warner Instruments	64-1553
Motorized micromanipulator	Scientifica	PatchStar
Motorized movable sample plate	Scientifica	MMSP
Pipette holder	Narishige	H-13
Pipette puller	Narishige	PC-100
Platinum wire (φ0.1mm)	Nilaco	PT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)	Niaco	PT-351381
Scalpel	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS camera	Thorlabs	CC215MU
Sea salt	NAPQO	Instant Ocean
Stereo microscope	Olympus	SZX7
Stimulus isolater	AMPI	ISO-FLEX
Suction tube	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Theta glass capillary	Sutter Instrument	BT-150-10
Tricaine (MS-222)	TCI	T0941
Upright microscope	Olympus	BX51WI