Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הצומת העצבי-שרירי של זחל דג הזברה הוא מודל אטרקטיבי לחקר הפיזיולוגיה הסינפטית. הוא מתאים לטכניקות ניסיוניות רבות, כולל אלקטרופיזיולוגיה והדמיה אופטית. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להדמיית שידור סינפטי באמצעות בדיקה מבוססת pHluorin תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף.

Abstract

תקשורת עצבית מתווכת על ידי העברה סינפטית, שתלויה בעיקר בשחרור נוירוטרנסמיטורים המאוחסנים בשלפוחיות סינפטיות (SVs) בתגובה לפוטנציאל פעולה (AP). מכיוון ש-SVs ממוחזרים באופן מקומי בקצה הפרה-סינפטי, תיאום של אקסוציטוזיס SV ואנדוציטוזיס חשוב להעברה סינפטית מתמשכת. חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH, הנקרא pHluorin, מספק כלי רב עוצמה לניטור אקסו/אנדוציטוזיס SV על ידי כיוונו ללומן SV. עם זאת, מעקב אחר מיחזור SV מונע AP עם בדיקות מבוססות pHluorin עדיין מוגבל במידה רבה להכנות לתרבית חוץ גופית מכיוון שהכנסת בדיקות מקודדות גנטית והדמיה אופטית לאחר מכן מאתגרת מבחינה טכנית באופן כללי עבור מודלים של בעלי חיים in vivo או הכנת רקמות. דג הזברה היא מערכת מודל המציעה תכונות יקרות ערך, כולל קלות מניפולציה גנטית, בהירות אופטית והתפתחות חיצונית מהירה. לאחרונה יצרנו דג זברה טרנסגני המבטא מאוד בדיקה עם תווית pHluorin במסופי נוירונים מוטוריים ופיתחנו פרוטוקול לניטור אקסו/אנדוציטוזיס SV מונע AP בצומת העצבי-שרירי (NMJ), מודל סינפסה מבוסס היטב שנוצר in vivo. במאמר זה, אנו מראים כיצד להכין תכשיר NMJ של דג זברה זחל המתאים להדמיית pHluorin. אנו מראים גם כי התכשיר מאפשר הדמיה בזמן-lapse תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף קונבנציונאלי, ומספק פלטפורמה חסכונית לניתוח תפקוד NMJ.

Introduction

העברה סינפטית, המתווכת על ידי שחרור נוירוטרנסמיטר משלפוחיות סינפטיות (SVs) בטרמינל הפרה-סינפטי, היא תהליך בסיסי העומד בבסיס תפקוד העצב1. במחקרים מוקדמים, העברה סינפטית נמדדה בעיקר על ידי טכניקות אלקטרופיזיולוגיות המזהות את התגובה הפוסט-סינפטית שמעוררים נוירוטרנסמיטורים והקולטנים שלהם. עם זאת, במהלך העשורים האחרונים פותחו מספר סוגים של טכניקות הדמיה המדמות ישירות את התפקוד הפרה-סינפטי2. אחד הבדיקות הנפוצים ביותר הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH הנקרא pHluorin 3,4.

מיחזור שלפוחיות סינפטיות (SVs) בטרמינל הפרה-סינפטי הוא תהליך מכריע להעברה מתמשכת של נוירוטרנסמיטורים5. בעקבות שחרור נוירוטרנסמיטורים על ידי אקסוציטוזיס של SVs, שהלומן שלהם נשמר בדרך כלל ב-pH חומצי 6,7, הממברנה וחלבוני SV נשלפים מיד מקרום הפלזמה על ידי אנדוציטוזיס. SVs חדשים שנוצרו עוברים החמצה מחדש, ונוירוטרנסמיטורים נטענים מחדש. כאשר pHluorin מכוון ללומן SV על ידי היתוך לחלבון SV, הוא מפגין פלואורסצנטיות מינימלית במצב מנוחה. עם זאת, עם אקסוציטוזיס SV, הוא נחשף ל-pH הנייטרלי בחלל החוץ-תאי, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות בהירה. לאחר מכן, הקרינה פוחתת בהדרגה בעקבות החמצה מחדש של SV. לכן, פלואורסצנטיות pHluorin מאפשרת ניטור של תהליכי מיחזור SV.

במחקרים חלוציים, synaptobrevin/VAMP 2, חלבון SNARE (קולטן חלבון מסיס NSF) האחראי לאיחוי שלפוחית סינפטית בסינפסות המוח הקדמי8 והנפוץ ביותר מבין חלבוני SV9, נבחר כשותף היתוך ל-pHluorin, וחלבון ההיתוך שנוצר סומן כ-synaptopHluorin (SpH)3,4. עם זאת, SpH הציג יחס אות לרעש נמוך (S/N) בשל ביטוי פני השטח המשמעותי של הגשושית. לכן, חלבוני SV אחרים נבדקו כשותפים נשאים 10,11,12. עד כה, הוכח כי מובילי שלפוחית מציגים את ביטוי פני השטח הנמוך ביותר 13,14,15. השימוש בבדיקות אלה הוקם בתחילה בתאי עצב של יונקים מתורבתים כדי לעקוב אחר מיחזור SV מונע AP 8,9,10,11,12,13 והורחב לתכשירים אחרים, כולל רקמות מנותחות ובעלי חיים in vivo 16,17,18,19,20,21,22.

דג זברה זחל הוא מערכת מודל בעלת מאפיינים יקרי ערך, כולל קלות מניפולציה גנטית, בהירות אופטית והתפתחות חיצונית מהירה. דג זברה טרנסגני המבטא pHluorin התמזג לסינפטופיזין, הנקרא SypHy, נוצר ויושם על מספר הגדרות ניסוי, למשל, ניטור איחוי SV ספונטני של נוירונים בעמוד השדרה in vivo21, מיחזור SV בלתי תלוי ב-AP בסינפסות מסוג סרט in vivo20,22 או בתאים מבודדים 23,24,25. עם זאת, היישום של הדמיית pHluorin של מיחזור SV מונע AP במודל דג הזברה עדיין מוגבל.

הצומת העצבי-שרירי (NMJ) משמש כמודל אטרקטיבי לחקר פיזיולוגיה סינפטית26, ומספר מחקרים ביצעו בהצלחה הדמיה של מיחזור SV מונע AP עם SpH בעכבר 18,19. השימוש ב-NMJs למיחזור SV בדגי זברה היה חלוץ על ידי Wen et al.16. לאחרונה, יצרנו דג זברה Tg המבטא מאוד pHluorin המתויג עם טרנספורטר GABA שלפוחית (VGAT) במיוחד בנוירונים מוטוריים27. בדיקה זו מכילה גם HaloTag במקביל ל-pHluorin בזנב הלומינלי של VGAT ולכן היא נקראת VpHalo. למרות ש-VGAT אינו מתבטא באופן אנדוגני בנוירונים מוטוריים כולינרגיים, אישרנו ש-VpHalo מתמקם בכל מאגרי ה-SV וממוחזר כראוי בתגובה ל-APs על ידי שילוב של רישום אלקטרופיזיולוגי, תיוג SV תלוי פעילות עם ליגנדים של HaloTag והדמיה חיה של pHluorin27. בשל רמת הביטוי הגבוהה וחלק פני השטח המינימלי של VpHalo, הכנת NMJ מדג Tg זה אפשרה ניטור של מיחזור SV מונע AP עם יחס S/N טוב. יתר על כן, הפיזור הדליל של NMJs בגוף השקוף הופך את מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי למיותר למטרה זו. למרות שניטור מיחזור SV מונע AP בדגי זברה שלמים הוא הכיוון העתידי הרצוי, יש חשיבות עליונה לבסס את תכשיר NMJ המתאים לאימות השימוש בבדיקה מבוססת pHluorin בתנאים מבוקרים היטב, כפי שנעשה בתכשירים מתורבתים 3,4,10,11,12,13,14,15 . כאן, אנו מתארים פרוטוקול דיסקציה להכנת דגימת NMJ של דג זברה זחל שיכולה לשמש למספר סוגים של ניסויים, למשל, הקלטת מהדק תיקון של זרמי לוחית קצה, תיוג HaloTag של SVs ממוחזרים והדמיה חיה של pHluorin, כפי שנדון לעיל. יתר על כן, התמקדנו וסיפקנו פרוטוקול מפורט להדמיה חיה של pHluorin באמצעות תכשיר NMJ זה תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונאלי המצויד במכשיר גירוי חשמלי ומערכת זלוף תמיסה.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית והפרמצבטית של אוסקה. דגי הזברה גודלו ונשמרו במחזור אור של 14 שעות עד 10 שעות חושך. העוברים והזחלים נשמרו בטמפרטורה של 28-30 מעלות צלזיוס במי ביצים המכילים 0.006% מלח ים ו-0.01% מתילן כחול. הניסויים נערכו 4-7 ימים לאחר ההפריה (dpf). מומלץ להאכיל את הדגים פעמיים ביום מ-5 dpf ואילך כאשר הניסויים מבוצעים לאחר 6 dpf. יש להחליף את המדיום לפני כל האכלה.

1. הכנת פתרונות

  1. הכן 200 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית (112 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, 10 מ"מ HEPES, 10 מ"מ גלוקוז, 2 מ"מ CaCl2, 1 מ"מ MgCl2, pH 7.3-7.4). מערבבים 6.4 מ"ל של 3.5 M NaCl, 0.4 מ"ל של 1 M KCl, 1 מ"ל של 1 M HEPES (pH 7.5), 0.4 מ"ל של 1 M CaCl2, 0.2 מ"ל של 1 M MgCl2 ו-360 מ"ג גלוקוז, ומוסיפים מים טהורים במיוחד ל-200 מ"ל. אם ה-pH נמצא מחוץ לטווח 7.3-7.4, התאם אותו עם 1 M NaOH. השתמש בתמיסה החוץ-תאית הטרייה שהוכנה לכל ניסוי.
  2. הכן 100 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית המכילה 3 מיקרומטר D-tubocurarine (D-TBC). הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי D-TBC של 15 מ"מ ל-100 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית.
    הערה: תמיסת מלאי D-TBC מוכנה במים ומאוחסנת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    זהירות: ללבוש כפפות ולבצע הכנות במכסה המנוע בעת טיפול באבקת D-TBC. כפפות מומלצות גם בעת הטיפול בתמיסת D-TBC.
  3. הכן 25 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית המכילה 0.02% טריקאין (MS-222). הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת מלאי טריקאין 1% ל-25 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית.
    הערה: תמיסת מלאי טריקאין מוכנה במים ומאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. טריקאין משמש רק לדיסקציה, לא במהלך הדמיה.

2. הכנת אלקטרודה דו קוטבית מנימי זכוכית תטא

  1. משוך נימי זכוכית תטא באמצעות מושך המיקרו-פיפטה כך שקוטר הקצה יהיה בתחום של 3-10 מיקרומטר (איור 1A).
    הערה: אנו ממליצים על פרוטוקול עם שני שלבים או יותר למשיכת הנימים.
  2. חבר את פיפטת זכוכית התטא (1.17 מ"מ קוטר פנימי עם 0.165 מ"מ עובי מחיצה) למבודד הגירוי. מלאו את הפיפטה בתמיסה החוץ-תאית. הכניסו חוט פלטינה דק (קוטר 0.1 מ"מ) לכל פתח של נימי זכוכית התטא וחברו את הקצה האחורי של החוט למבודד הגירוי (איור 1B). היזהר לא לקצר את שני חוטי הפלטינה.

3. הכנת מדגם

הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לשימוש עם זחלי דג הזברה Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo)27, שבהם שני החלבונים הבאים, המקושרים על ידי פפטיד מחשוף P2A, באו לידי ביטוי באופן דו-כיווני במיוחד בתאי עצב מוטוריים: חלבון פלואורסצנטי אדום מדווח TagRFP וחלבון חיישן VpHalo, שהוא חלבון היתוך של pHluorin ו-HaloTag לחלק הלומינלי של VGAT (איור 2A). מקדם hb9 מניע את הביטוי של ה-tTAad (טרנסאקטיבטור מבוקר טטרציקלין-מתקדם), אשר בתורו גורם לביטוי הגנים תחת המקדם המרוכב של אלמנט התגובה הטטרציקלין (TRE). מערכת הביטוי הניתנת להשראת Tet מעלה את רמת ביטוי החלבון. pHluorin מאפשר ניטור חי של מיחזור SV תלוי פעילות, בעוד ש-HaloTag מדמה SVs ממוחזרים במהלך תקופה נתונה על ידי תיוג קוולנטי של החלבון המותך (איור 2A). למרות שלשתי השיטות יש יתרונות ייחודיים, במאמר זה אנו מתמקדים בהדמיית pHluorin.

  1. יוצקים 25 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית המכילה 0.02% טריקן לתוך צלחת הפטרי מזכוכית.
  2. לדיסקציה, העבירו זחל לצלחת הפטרי. מקלפים את עור הזחל בשני מלקחיים עדינים. השתמשו במלקחיים הראשונים כדי להחזיק את הזחל במקומו, וצבטו את העור בצד הגבי של שלפוחית השחייה עם המלקחיים האחרים (איור 3A).
  3. הסר את שלפוחית השתן, האיברים הפנימיים והראש בעזרת אזמלים. לעתים קרובות ניתן להסיר את העור משני צידי גוף הדג בו זמנית, ראה סרטון 1.

4. הנחת הדגימה בתא ההדמיה והחדרת האלקטרודה המגרה

הערה: מאחר שה-pH הלומינלי במנוחה של ה-SV נמוך מ-pH 6.0, פלואורסצנטיות של pHluorin ב-NMJs בדגים חיים בקושי נצפית (איור 2B). עם זאת, כאשר לומן SV היה אלקלי, נצפתה לוקליזציה מוגבלת של VpHalo ל-NMJs (איור 2C). יש לציין שתמונת ה-z-stack הקונפוקלית של ה-NMJs הראתה שהם לא חופפים זה את זה במישור ה-xy, למעט הקצוות של מקטעי הגוף (איור 2C). בהתבסס על תצפית זו, הנחנו כי מיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי ישים להדמיה חיה של VpHalo בזחלי דג הזברה, אשר אומתה כמפורט בפרוטוקול הבא.

  1. העבירו את הדגימה לתא ההדמיה (איור 3B) באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית עם קצה מלוטש באש. תקן מכנית את הדגימה עם חוט ניילון המודבק לחוט פלטינה בצורת C כך שהוא מכוון בזווית מקבילה בערך לאלקטרודה המגרה. (איור 3C).
    הערה: חוט פלטינה בצורת C עם חוט ניילון יוצר במעבדה. כ-1 ס"מ של חוט פלטינה בקוטר 0.5 מ"מ נוצר לצורת C והקיש בפטיש כדי לשטח אותו. ניתן להשיג חוט ניילון מחפצי בית. הדבקנו את חוט הניילון, שהושג על ידי פירוק מייבש מטבח הזמין במכולת. מכשיר קיבוע דומה משמש באופן שגרתי בניסוי פרוסת המוח28.
  2. החדרה רציפה של הדגימה בתמיסה חוץ-תאית המכילה 3 מיקרומטר D-TBC בקצב של כ-1.0 מ"ל/דקה באמצעות מערכת זלוף זרימת כבידה.
    הערה: מומלץ לשלוט בטמפרטורת החדר באמצעות מחמם תמיסה מקוון.
  3. הכנס את אלקטרודת הגירוי לחוט השדרה. החזק את האלקטרודה שהוכנה מפיפטת זכוכית התטה בשלב 2 על מחזיק הפיפטה המצויד במיקרומניפולטור הממונע. הכניסו את האלקטרודה לדגימה כך שהקצה יהיה ליד תאי העצב המוטוריים של עמוד השדרה, שממוקמים בצד הגחון של חוט השדרה, ויכולים להיות מזוהים כתאי עצב חיוביים ל-TagRFP בדגימה הזו (איור 3D). קדם את האלקטרודה בזווית אלכסונית מהקטע הסמוך למצב המטרה.
    הערה: הגבול בין מקטעי הגוף צפוף וקשה לחדירה, ולכן יש צורך ללחוץ על האלקטרודה לאט. מיקום קצה האלקטרודה חשוב מאוד. אם הוא רחוק מחוט השדרה, הוא מגרה את השרירים הסמוכים ישירות, וכתוצאה מכך תמונה גדולה נסחפת בהדמיית זמן-lapse שלאחר מכן.

5. רכישת תמונות

  1. בחר את אזור ההדמיה. בהתבסס על התמונה החיה של הקרינה של TagRFP, בחרו אזור הדמיה שכולל יותר מכמה בוטונים ואינו כולל את אלה שבגבול מקטע הגוף (איור 2C ואיור 4A). בחר את האזור באותו קטע גוף של אלקטרודת הגירוי מכיוון שהעצבוב של הנוירונים המוטוריים מוגבל בתוך מקטע גוף יחיד29,30. החלף את יחידת מסנן הקרינה לפלואורסצנציה GFP/pHluorin.
    הערה: במערך ניסיוני זה, pHluorin צולם עם עירור של 470/40 ננומטר ומסנני פליטה של 510/20 ננומטר. TagRFP צולם עם עירור של 555/20 ננומטר ומסנני פליטה של 595/44 ננומטר. תוכנת Micro-Manager משמשת לשליטה בו-זמנית בקליטת תמונה באמצעות מצלמת cMOS מדעית ותריס TTL של מקור אור LED. כדי לסנכרן רכישת תמונה וגירוי חשמלי, Arduino משמש כמכשיר I/O דיגיטלי. אפשרות נוספת שאינה דורשת סקריפט היא להשתמש ב- Digidata ובתוכנה שלה מ- Molecular Devices.
  2. קבע את ההגדרה של תוכנת רכישת תמונות והתקן קלט/פלט דיגיטלי כך שרכישת התמונה והגירוי החשמלי יסונכרנו. מטב את החשיפה והעוצמה של מקור האור כדי לקבל תמונה בהירה מספיק במצב דולג זמן של 1 הרץ ללא רוויה והזן את זמן החשיפה בשדה החשיפה [ms] של חלון ה-Micro-Manager הראשי.
  3. קבע את תדירות הגירוי, מספר פוטנציאל הפעולה (APs) והזמן בין תחילת רכישת התמונה למסירת הגירוי, וקידוד אותם בסקריפט Arduino. בהתאם לפרמטרים, קבע את מספר התמונות שנרכשו המתאים לאורך הכולל של רכישת התמונה והזן אותו בשדה ספירה של חלון הרכישה הרב-ממדית של המיקרו-מנהל. הגדר 1 שניות בשדה מרווח כדי להשיג הדמיה של קיטועי זמן של 1 הרץ. לגירוי חשמלי, ספק פולסים של מתח קבוע של 1 ms (70 mV) דרך מבודד הגירוי.
  4. בצע רכישת תמונות. בצע את פקודת הדיגיטייזר ובצע רכישת תמונה. ודא שאין סחיפה בלתי מקובלת של תמונה ושניתן לצפות בתגובות pHluorin. אחרת, מיקום האלקטרודה שגוי. חזור לשלב 4.2.
    הערה: ניתן לזהות בקלות נזק לרקמות שעלול להשפיע על תגובת ה-pHluorin על ידי תמונת ה-DIC של סיבי השריר. אם לא נצפתה תגובת pHluorin בהיעדר נזק כזה, מיקום האלקטרודה עשוי להיות שגוי. ניתן לזהות זאת כסחיפה גדולה של תמונה מכיוון שמיקום לא נכון של אלקטרודות גורם להתכווצות שרירים, כמתואר בשלב 4.2. הבעיה הנוספת שגורמת לפעמים לכישלון לעורר תגובת pHluorin היא אוויר הכלוא בנימי זכוכית התטא, מה שמוביל לבידוד חשמלי של האלקטרודה. התכווצות שרירים עקב מיקום שגוי של אלקטרודות גורמת לסחף תמונה בציר Z, שלא ניתן לתקן בניתוחי תמונה עוקבים (ראה שלב 6.5). לכן, מומלץ לזהות נתונים עם סחיפות תמונה גדולות במהלך רכישת התמונה ולא לכלול אותם.
  5. בהתאם למטרת הניסוי, שנה את עוצמת הגירוי (כלומר, תדירות ומספר הפולסים) ו/או הטמפרטורה. שמור את תמונות קיטועי הזמן כערימה של סדרות זמן של תמונות TIFF. ראה סרטון 2.

6. ניתוח תמונה

הערה: השתמש בפיג'י כדי לבצע את עיבוד התמונה והניתוח הבאים. השתמש ב-Microsoft Excel או בתוכנת גיליונות אלקטרוניים דומה כדי לחשב את תוצאות המדידה. השתמש ב-Igor Pro כדי לבצע התאמת עקומה על התוצאה המתקבלת.

  1. צור תמונה שונה המדגישה סינפסות פעילות כמתואר להלן.
    1. פתח את ערימת התמונות של סדרות הזמן בפיג'י על-ידי בחירה באפשרות File > Open. אם התמונות המוצגות עמומות, בחרו Image >Adjust >Brightness/Contrast >Auto. אל תלחץ על החל, מכיוון שפעולה זו תשנה את קנה המידה של עוצמת האות, מה שיהפוך את המשך הניתוח לבלתי אפשרי. בחר נתח > הגדר קנה מידה והזן את גורם הכיול המוגדר בתנאי ההדמיה.
    2. צור ערימה של חמש תמונות שצולמו במהלך תקופת טרום הגירוי על ידי בחירה באפשרות Image > Duplicate והזנת מספר מתאים המציין את טווח רצף התמונות (למשל, 11-15 לניסוי עם תקופה של 15 שניות לפני הגירוי).
    3. בחר Image > Stacks > Z Project ובחר Average Intensity מהתפריט הנפתח Projection Type. לחץ על אישור כדי ליצור תמונה מייצגת של התקופה שלפני הגירוי (איור 4B). תהליך המיצוע חשוב כדי להפחית את ההשפעה של תנודות האות.
    4. צרו תמונה ממוצעת של התקופה שלאחר הגירוי באמצעות עיבוד דומה (איור 4B). שכפל ערימה של חמש תמונות מיד לאחר סיום הגירוי (למשל, התמונה ה-26-30 עבור תקופת 15 שניות לפני הגירוי וניסוי תקופת הגירוי של 10 שניות). בחר תהליך > מחשבון תמונה והגדר את התמונה הממוצעת לפני הגירוי ואת התמונה הממוצעת לאחר הגירוי כתמונה 1 ותמונה 2 בתפריטים הנפתחים, בהתאמה.
    5. בחר החסר מהתפריט הנפתח פעולה ולחץ על אישור כדי ליצור תמונה שונה המדגישה סינפסות פעילות (איור 4B).
  2. הגדר את אזורי העניין (ROIs) שיש לנתח.
    1. בחר Edit > Selection > Specify וצור החזר ROI מעגלי בקוטר 7 מיקרומטר על תמונת ההבדל שנוצרה בשלב 6.1. הנח את ה-ROI על הסינפסה הפעילה המודגשת ולחץ על T כדי להוסיף את ההחזר על ההשקעה במנהל ה-ROI. בתוצאה המייצגת המוצגת באיור 4C-D, 6 החזר ROI הוצבו סביב הבוטונים.
    2. מקם עוד 5 החזר ROI באותו גודל באזורים שבהם לא נצפתה עלייה באות. השתמש בפלואורסצנטיות הממוצעת שלהם כאות הרקע בשלב הבא. שמור את ההחזר על ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות עוד >שמור מתפריט מנהל החזר ההשקעה.
  3. מדוד את עוצמת האות וחשב את השינוי המהותי בקרינה.
    1. בחר את מחסנית סדרת הזמן המקורית והעבר את החזר ה-ROI שנשמר בשלב 6.2 לערימה. בחר נתח > קבע מידות ובחר רק בתיבת הסימון ערך אפור ממוצע. מדוד את עוצמת הקרינה הממוצעת בהחזר ההשקעה על פני כל נקודות הזמן על ידי בחירה באפשרות More > Multi Measure מתפריט מנהל החזר ההשקעה.
    2. העתק את כל הערכים בחלון התוצאות והדבק אותם בתוכנית גיליון אלקטרוני. חשב את אות הרקע הממוצע מ-5 החזר ה-ROI של הרקע והחסר אותו מכל החזר ROI סינפטי, המספק שינוי מהותי של הקרינה בכל בוטון (איור 4D). ממוצע של כל הנתונים מתצוגה אחת (במקרה זה, 6 בוטונים), שנספרים כניסוי n = 1. באיור 4E, כל עקבה המתקבלת על ידי מיצוע מיוצגת כ-F/F0 על ידי חלוקת הערך בכל נקודות הזמן בערך הממוצע במהלך תקופת הבסיס הראשונית.
  4. הערך את קבוע זמן הדעיכה הקרינה (tau) על ידי התאמת עקומה.
    1. פתח טבלת נתונים חדשה ב- Igor Pro על-ידי בחירה באפשרות חלון > טבלה חדשה. העתק את נקודת הזמן ונתוני F/F0 מהגיליון האלקטרוני והדבק אותם בטבלה בשורה אחרת. בחר Window > New Graph, בחר נתוני F/F0 כ- Y Wave ונתוני נקודת זמן כ- X Wave, ולחץ על Do It ליצירת תרשים.
    2. בחר Window > Show Info והגדר את טווח הנתונים שיש לנתח על-ידי הצבת סמן אחד על שיא האות והשני על קצה המעקב. בחר Analysis > Curve Fitting ובחר exp_XOffset בתפריט הנפתח Function ואת גלי X ו-Y המתאימים בתפריט הנפתח Wave.
    3. לחץ על אפשרויות נתונים ולחץ על כפתור הסמנים כדי להגדיר את טווח התאמת העקומה. לחץ על מקדמים, הזן 1 עבור Y0 ולחץ על עשה זאת. התאמת עקומה על ידי הליך זה מספקת ערך טאו המייצג את קצב דעיכת הקרינה, המשקף את שיעורי האנדוציטוזיס וההחמצה מחדש של SV.
  5. בצע תיקון סחיפה ידני (אופציונלי) כמתואר להלן.
    1. אם מתרחשת סחיפה של התמונה והנקודה שנבחרה זזה מחוץ להחזר ה-ROI בקוטר 7 מיקרומטר במהלך תקופת רכישת התמונה, הפעל את התוסף Manual Drift Correction. פתח את אוסף התמונות של סדרת הזמן בפיג'י על-ידי בחירה באפשרות File > Open. בחר את הכלי Point על-ידי לחיצה על סרגל הכלים Point.
    2. מצא את הזרוע הבהירה ביותר כנקודת ציון ומקם נקודה במרכזו. הקש T כדי להוסיף את הנקודה למנהל ההחזר על ההשקעה. חזור על תהליך זה עבור כל רצף התמונות. הצג את התמונה הראשונה ובחר Plugins > Registration > Manual Drift Correction. שמור את ערימת סדרת התמונות המתוקנת כקובץ חדש והשתמש בה לניתוח.
      הערה: למרות שניתן לתקן סחיפה XY, סחף Z מוגזם אינו ניתן לתיקון בשיטה זו.

תוצאות

אם הדגימה המנותחת מוכנה ללא נזק חמור לרקמות, ואלקטרודת הגירוי מוחדרת כראוי לחוט השדרה, ניתן לעורר תגובת pHluorin חזקה על ידי גירוי חשמלי בתדר גבוה (איור 4D,E). הקרינה הבסיסית לפני הגירוי נבעה ככל הנראה מהגשושית הקיימת על פני השטח של הפרה-סינפסה. העלייה ...

Discussion

דג הזברה הזחלי NMJ הוא מערכת מודל מתפתחת לחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה הסינפטית 26,31. דג זברה טרנסגני המבטא SpH באופן ספציפי לנוירונים כבר נוצר ושימש לניתוח מוטציה המציגה פגם תנועתי17. Wen et al.17 הדגימו עלייה של פי 2 בערך ב?...

Disclosures

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע KAKENHI Grant 18K06882 ל- F. O.; ומענק האגודה היפנית לקידום המדע KAKENHI 21K06429 ו-24K10020 ל-Y.E.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40x water immersion objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion systemALAVCPlus-4G
5x objectiveOlympusNPLN5X
Custum made imaging chamberPhysiotechcustum madeA black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate. 
Digital I/O deviceArduinoUno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrateSigma93750
ExcelMicrosoftMicrosoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJhttps://imagej.net/imageJ 1.54f
Fine forcepsAsOne7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipetteIWAKIIK-PAS-5PThe tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm. 
Glass Petri dishAsOne1-4564-06
Igor ProWaveMetricsVer. 6.37
Inline solution heaterWarner InstrumentsSF-28
LED illumination systemX-cyteXYLIS
Methylen blueWako133-06962
Micro-Managerhttps://micro-manager.org/Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tubeWarner Instruments64-1553
Motorized micromanipulatorScientificaPatchStar
Motorized movable sample plateScientificaMMSP
Pipette holderNarishigeH-13
Pipette pullerNarishigePC-100
Platinum wire (φ0.1mm)NilacoPT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)NiacoPT-351381
ScalpelAsOne8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS cameraThorlabsCC215MU
Sea saltNAPQOInstant Ocean
Stereo microscopeOlympusSZX7
Stimulus isolaterAMPIISO-FLEX
Suction tubeWarner InstrumentsST-3, 64-1406
Temperature controllerWarner InstrumentsTC-324C
Theta glass capillarySutter InstrumentBT-150-10
Tricaine (MS-222)TCIT0941
Upright microscopeOlympusBX51WI

References

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).
  2. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  3. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  4. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  5. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  6. Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles. J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).
  7. Egashira, Y., et al. Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).
  8. Schoch, S., et al. Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice. Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).
  9. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  10. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  11. Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  12. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons. Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).
  13. Voglmaier, S. M., et al. Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling. Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).
  14. Balaji, J., Ryan, T. A. Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).
  15. Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif. J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).
  16. Wen, H., et al. Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources. Elife. 2, e01206 (2013).
  17. Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release. J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).
  18. Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin. J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  19. Tabares, L., et al. Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin. J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).
  20. Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina. Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).
  21. Almeida, R. G., et al. Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth. Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).
  22. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nat Comm. 9 (1), 1388 (2018).
  23. Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone. eLife. 5, e13245 (2016).
  24. Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones. iScience. 17, 10-23 (2019).
  25. Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells. STAR Protoc. 3 (1), 101107 (2022).
  26. Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model. Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).
  27. Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses. J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).
  28. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. J Vis Exp. (131), e55936 (2018).
  29. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).
  30. Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  31. Brehm, P., Wen, H. Zebrafish neuromuscular junction: The power of n. Neurosci Lett. 713, 134503 (2019).
  32. Ben Fredj, N., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Mandal, A., et al. Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons. J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).
  34. Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766 (2022).
  35. Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton. Front Cell Neurosci. 8, 409 (2014).
  36. Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular ph. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PHlapse

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved