Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Özet

Zebra balığı larva nöromüsküler kavşağı, sinaptik fizyolojiyi incelemek için çekici bir modeldir. Elektrofizyoloji ve optik görüntüleme dahil olmak üzere birçok deneysel tekniğe uygundur. Burada, dik bir epifloresan mikroskobu altında pHluorin bazlı bir prob kullanarak sinaptik iletimi görüntülemek için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Nöronal iletişime, esas olarak bir aksiyon potansiyeline (AP) yanıt olarak sinaptik veziküllerde (SV'ler) depolanan nörotransmiterlerin salınmasına bağlı olan sinaptik iletim aracılık eder. SV'ler presinaptik terminalde lokal olarak geri dönüştürüldüğünden, SV ekzositozu ve endositozun koordinasyonu, sürekli sinaptik iletim için önemlidir. pHluorin adı verilen pH'a duyarlı yeşil bir floresan proteini, SV ekzo/endositozunu SV lümenine hedefleyerek izlemek için güçlü bir araç sağlar. Bununla birlikte, pHluorin bazlı problarla AP güdümlü SV geri dönüşümünün izlenmesi, genetik olarak kodlanmış probların tanıtılması ve müteakip optik görüntüleme, genel olarak in vivo hayvan modelleri veya doku preparatları için teknik olarak zor olduğundan, hala büyük ölçüde in vitro kültür preparatlarıyla sınırlıdır. Zebra balığı, genetik manipülasyon kolaylığı, optik netlik ve hızlı dış geliştirme gibi değerli özellikler sunan bir model sistemdir. Kısa bir süre önce, motor nöron terminallerinde pHluorin etiketli bir probu yüksek oranda eksprese eden transgenik bir zebra balığı ürettik ve in vivo olarak oluşan iyi kurulmuş bir sinaps modeli olan nöromüsküler kavşakta (NMJ) AP güdümlü SV ekzo / endositozunu izlemek için bir protokol geliştirdik. Bu yazıda, pHluorin görüntülemesine uygun larva zebra balığı NMJ preparatının nasıl hazırlanacağını gösteriyoruz. Ayrıca, preparatın geleneksel dik epifloresan mikroskobu altında hızlandırılmış görüntülemeye izin verdiğini ve NMJ fonksiyonunu analiz etmek için uygun maliyetli bir platform sağladığını gösteriyoruz.

Giriş

Presinaptik terminaldeki sinaptik veziküllerden (SV'ler) nörotransmitter salınımının aracılık ettiği sinaptik iletim, sinir fonksiyonunun altında yatan temel bir süreçtir¹. Erken çalışmalarda, sinaptik iletim öncelikle nörotransmiterler ve reseptörleri tarafından ortaya çıkan postsinaptik yanıtı tespit eden elektrofizyolojik tekniklerle ölçülmüştür. Bununla birlikte, son birkaç on yılda, presinaptik fonksiyonu doğrudan görselleştiren çeşitli görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir². En yaygın kullanılan problardan biri, pHluorin ^3,4 adı verilen pH'a duyarlı yeşil bir floresan proteinidir.

Presinaptik terminalde sinaptik veziküllerin (SV'ler) geri dönüşümü, nörotransmiterlerin sürekli iletimi için çok önemli bir süreçtir⁵. Lümeni genellikle asidik pH^6,7'de tutulan SV'lerin ekzositozu ile nörotransmiterlerin salınmasını takiben, zar ve SV proteinleri endositoz ile hemen plazma zarından alınır. Yeni oluşan SV'ler daha sonra yeniden asitleştirilir ve nörotransmiterler yeniden yüklenir. pHluorin, SV proteinine kaynaştırılarak SV lümenine hedeflendiğinde, dinlenme durumunda minimum floresan sergiler. Bununla birlikte, SV ekzositozu üzerine, hücre dışı boşlukta nötr pH'a maruz kalır ve bu da parlak floresan ile sonuçlanır. Daha sonra, SV yeniden asitlenmesini takiben floresan yavaş yavaş azalır. Bu nedenle, pHluorin floresansı, SV geri dönüşüm süreçlerinin izlenmesini sağlar.

Öncü çalışmalarda, ön beyin sinapslarında⁸ sinaptik vezikül füzyonundan sorumlu olan ve SV proteinleri⁹ arasında en bol bulunan veziküler SNARE (çözünür NSF-bağlı protein reseptörü) proteini olan sinaptobrevin/2, pHluorin için bir füzyon ortağı olarak seçildi ve elde edilen füzyon proteini sinaptopHluorin (SpH) olarak ^{belirlendi3,4}. Bununla birlikte, SpH, probun önemli yüzey ifadesi nedeniyle düşük bir sinyal-gürültü (S/N) oranı sergiledi. Bu nedenle, diğer SV proteinleri taşıyıcı ortaklar olarak test edilmiştir 10,11,12. Bugüne kadar, veziküler taşıyıcıların en düşük yüzey ifadesini sergilediği^{gösterilmiştir} 13,14,15. Bu probların kullanımı başlangıçta AP güdümlü SV geri dönüşümünü^{izlemek için kültürlenmiş} memeli nöronlarında kurulmuştur 8,9,10,11,12,13 ve disseke dokular ve in vivo hayvanlar^{16,17,18,19,20} dahil olmak üzere diğer preparatlara genişletilmiştir.^21,22.

Larva zebra balığı, genetik manipülasyon kolaylığı, optik netlik ve hızlı dış gelişme gibi değerli özelliklere sahip bir model sistemdir. SypHy adı verilen sinaptofizin ile kaynaşmış pHluorin eksprese eden transgenik zebra balığı üretildi ve çoklu deney düzeneklerine uygulandı, örneğin, in vivo²¹ spinal nöronların spontan SV füzyonunun izlenmesi, in vivo ^20,22 veya izole hücrelerde şerit tipi sinapslarda AP'den bağımsız SV geri dönüşümü^23,24,25. Bununla birlikte, zebra balığı modelinde AP güdümlü SV geri dönüşümünün pHluorin görüntülemesinin uygulaması hala sınırlıdır.

Nöromüsküler kavşak (NMJ), sinaptik fizyolojiyi incelemek için çekici bir model görevi görür²⁶ ve birkaç çalışma, farede^18,19 SpH ile AP güdümlü SV geri dönüşümünü başarıyla görüntüledi. Zebra balıklarında SV geri dönüşümü için NMJ'lerin kullanımına Wen ve ^ark.16 öncülük etmiştir. Son zamanlarda, özellikle motor nöronlarda²⁷ veziküler GABA taşıyıcı (VGAT) ile etiketlenmiş pHluorin'i yüksek oranda eksprese eden Tg zebra balığı ürettik. Bu prob ayrıca VGAT'ın luminal kuyruğunda pHluorin ile birlikte bir HaloTag içerir ve bu nedenle VpHalo olarak adlandırılır. VGAT, kolinerjik motor nöronlarda endojen olarak eksprese edilmese de, VpHalo'nun tüm SV havuzlarına lokalize olduğunu ve elektrofizyolojik kayıt, aktiviteye bağlı SV etiketlemesini HaloTag ligandları ile birleştirerek ve pHluorin^27'nin canlı görüntülemesini birleştirerek AP'lere yanıt olarak uygun şekilde geri dönüştürüldüğünü doğruladık. Yüksek ekspresyon seviyesi ve VpHalo'nun minimum yüzey fraksiyonu nedeniyle, bu Tg balığından NMJ hazırlığı, AP güdümlü SV geri dönüşümünün iyi bir S/N oranıyla izlenmesini sağladı. Ayrıca, NMJ'lerin şeffaf gövde içindeki seyrek dağılımı, bu amaç için konfokal lazer tarama mikroskobunu gereksiz kılar. Bozulmamış zebra balıklarında AP güdümlü SV geri dönüşümünün izlenmesi arzu edilen gelecek yönü olsa da, kültürlenmiş preparatlarda yapıldığı gibi, pHluorin bazlı probun iyi kontrol edilen koşullar altında kullanımını doğrulamak için uygun olan NMJ preparatının oluşturulması birincil öneme sahiptir 3,4,10,11,12,13,14,15 . Burada, yukarıda tartışıldığı gibi, uç plaka akımlarının yama kelepçesi kaydı, geri dönüştürülmüş SV'lerin HaloTag etiketlemesi ve pHluorin canlı görüntüleme gibi birden fazla deney türü için kullanılabilecek bir larva zebra balığı NMJ örneği hazırlamak için bir diseksiyon protokolünü açıklıyoruz. Ayrıca, bir elektrik stimülasyon cihazı ve bir çözelti perfüzyon sistemi ile donatılmış geleneksel bir epifloresan mikroskop altında bu NMJ preparatını kullanarak pHluorin'in canlı görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokole odaklandık ve sağladık.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Osaka Tıp ve Eczacılık Üniversitesi'nde hayvanların bakımı ve kullanımına ilişkin yönergelere uygun olarak yürütülmüştür. Zebra balığı, 14 saat ışık ila 10 saat karanlık döngü altında büyütüldü ve korundu. Embriyolar ve larvalar 28-30 °C'de %0.006 deniz tuzu ve %0.01 metilen mavisi içeren yumurta suyunda muhafaza edildi. Deneyler döllenmeden 4-7 gün sonra (dpf) yapıldı. 6 dpf'den sonra deneyler yapıldığında balıkların 5 dpf'den itibaren günde iki kez beslenmesi önerilir. Her beslemeden önce ortam değiştirilmelidir.

1. Çözeltilerin hazırlanması

1. 200 mL hücre dışı çözelti hazırlayın (112 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glikoz, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.3-7.4). 6.4 mL 3.5 M NaCl, 0.4 mL 1 M KCl, 1 mL 1 M HEPES (pH 7.5), 0.4 mL 1 M CaCl₂, 0.2 mL 1 M_MgCl2 ve 360 mg glikozu karıştırın ve 200 mL'ye ultra saf su ekleyin. PH 7.3-7.4 aralığının dışındaysa, 1 M NaOH ile ayarlayın. Her deney için taze hazırlanmış hücre dışı çözeltiyi kullanın.
2. 3 μM D-tubokurarin (D-TBC) içeren 100 mL hücre dışı çözelti hazırlayın. 100 mL hücre dışı çözeltiye 20 μL 15 mM D-TBC stok çözeltisi ekleyin.
   NOT: D-TBC stok çözeltisi suda hazırlanır ve -20 °C'de saklanır.
   DİKKAT: D-TBC tozu ile çalışırken eldiven giyin ve başlıkta hazırlıklar yapın. D-TBC solüsyonu ile çalışırken eldiven kullanılması da önerilir.
3. % 0.02 trikain (MS-222) içeren 25 mL hücre dışı çözelti hazırlayın. 25 mL hücre dışı çözeltiye 0.5 mL% 1 tricaine stok çözeltisi ekleyin.
   NOT: Trikain stok çözeltisi suda hazırlanır ve 4 °C'de saklanır. Trikain görüntüleme sırasında değil, sadece diseksiyon için kullanılır.

2. Teta cam kılcal damardan bipolar elektrotun hazırlanması

1. Uç çapı 3-10 μm aralığında olacak şekilde mikropipet çekiciyi kullanarak teta cam kılcal damarları çekin (Şekil 1A).
   NOT: Kılcal damarı çekmek için iki veya daha fazla adımlı bir protokol öneririz.
2. teta cam pipeti (1.17 mm iç çap ve 0.165 mm septum kalınlığı) Stimulus İzolatörüne bağlayın. Pipeti hücre dışı solüsyonla doldurun. Teta cam kılcal damarın her bir açıklığına ince bir platin tel (0.1 mm çapında) yerleştirin ve telin arka ucunu Uyarı İzolatörüne bağlayın (Şekil 1B). İki platin kabloyu kısa devre yapmamaya dikkat edin.

3. Numune hazırlama

NOT: Bu protokol, bir P2A bölünme peptidi ile bağlanan aşağıdaki iki proteinin spesifik olarak motor nöronlarda bistilrik olarak eksprese edildiği Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo) zebra balığı larvaları²⁷ ile kullanım için optimize edilmiştir: bir muhabir kırmızı floresan proteini TagRFP ve pHluorin ve HaloTag'ın VGAT'ın lümen kısmına bir füzyon proteini olan bir sensör proteini VpHalo (Şekil 2A)). Hb9 promotörü, tTAad'ın (tetrasiklin kontrollü transaktivatör gelişmiş) ekspresyonunu yönlendirir ve bu da tetrasiklin yanıt elemanı (TRE) kompozit promotörü altındaki genlerin ekspresyonunu indükler. Tet ile indüklenebilir ekspresyon sistemi, protein ekspresyon seviyesini arttırır. pHluorin, aktiviteye bağlı SV geri dönüşümünün canlı olarak izlenmesine izin verirken, HaloTag, kaynaşmış proteini kovalent olarak etiketleyerek belirli bir süre boyunca geri dönüştürülen SV'leri görselleştirir (Şekil 2A). Her iki yöntemin de benzersiz avantajları olmasına rağmen, bu yazıda pHluorin görüntülemeye odaklanıyoruz.

1. % 0.02 trikan içeren 25 mL hücre dışı çözeltiyi cam Petri kabına dökün.
2. Diseksiyon için, bir larvayı Petri kabına aktarın. Larva derisini iki ince forseps ile soyun. Larvaları yerinde tutmak için ilk forsepsleri kullanın ve diğer forseps ile yüzme kesesinin dorsal tarafındaki cildi sıkıştırın (Şekil 3A).
3. Yüzme kesesini, iç organları ve başı neşterle çıkarın. Balığın vücudunun her iki tarafındaki deri genellikle aynı anda çıkarılabilir, bkz. Video 1.

4. Numunenin görüntüleme odasına yerleştirilmesi ve uyarıcı elektrotun yerleştirilmesi

NOT: SV'nin dinlenme luminal pH'ı pH 6.0'ın altında olduğundan, canlı balıklarda NMJ'lerde pHluorin floresansı zar zor gözlemlenebilir (Şekil 2B). Bununla birlikte, SV lümeni alkalize edildiğinde, VpHalo'nun NMJ'lere sınırlı lokalizasyonu gözlenmiştir (Şekil 2C). Özellikle, NMJ'lerin konfokal z-yığını görüntüsü, vücut segmentlerinin kenarları dışında, xy düzleminde birbirleriyle örtüşmediklerini gösterdi (Şekil 2C). Bu gözleme dayanarak, epifloresan mikroskobun, zebra balığı larvalarında VpHalo'nun canlı görüntülenmesi için uygulanabilir olduğunu varsaydık ve bu, aşağıdaki protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi doğrulandı.

1. Ateşle parlatılmış uçlu bir cam Pasteur pipeti kullanarak numuneyi görüntüleme odasına (Şekil 3B) aktarın. Numuneyi, uyarıcı elektroda yaklaşık olarak paralel bir açıyla yönlendirilecek şekilde C şeklinde bir platin tele yapıştırılmış bir naylon iplikle mekanik olarak sabitleyin. (Şekil 3C).
   NOT: Laboratuvarda naylon iplikli C şeklinde bir platin tel imal edilmiştir. Yaklaşık 1 cm 0,5 mm çapında platin tel C şeklinde şekillendirildi ve düzleştirmek için bir çekiçle vuruldu. Naylon iplik ev eşyalarından elde edilebilir. Bir markette bulunan bir mutfak süzgecinin sökülmesiyle elde edilen naylon ipliği yapıştırdık. Benzer bir fiksasyon cihazı beyin dilimi deneyinde rutin olarak kullanılmaktadır²⁸.
2. Numuneyi, bir yerçekimi akış perfüzyon sistemi kullanarak yaklaşık 1.0 mL / dak hızında 3 μM D-TBC içeren hücre dışı bir çözelti ile sürekli olarak perfüze edin.
   NOT: Hazne sıcaklığının bir hat içi çözelti ısıtıcısı kullanılarak kontrol edilmesi önerilir.
3. Stimülasyon elektrodunu omuriliğe yerleştirin. 2. adımda teta cam pipetten hazırlanan elektrodu, motorlu mikromanipülatör ile donatılmış pipet tutucusuna tutun. Elektrodu, uç, omuriliğin ventral tarafında bulunan ve bu örnekte TagRFP pozitif nöronlar olarak tanımlanabilen spinal motor nöronlara yakın olacak şekilde numuneye yerleştirin (Şekil 3D). Elektrodu, bitişik segmentten hedef konuma eğik bir açıyla ilerletin.
   NOT: Vücut segmentleri arasındaki sınır yoğundur ve nüfuz etmesi zordur, bu nedenle elektroda yavaşça basmak gerekir. Elektrot ucunun konumu çok önemlidir. Omurilikten uzaksa, bitişik kasları doğrudan uyarır ve sonraki hızlandırılmış görüntülemede büyük bir görüntünün sürüklenmesine neden olur.

5. Görüntü edinme

1. Görüntüleme bölgesini seçin. TagRFP floresansının canlı görüntüsüne dayanarak, birkaç bouton'dan fazlasını içeren ve vücut segmenti sınırındakileri hariç tutan bir görüntüleme bölgesi seçin (Şekil 2C ve Şekil 4A). Stimülasyon elektrodunun aynı vücut segmenti içindeki bölgeyi seçin, çünkü motor nöron innervasyonu tek bir vücut segmenti içinde sınırlıdır^29,30. GFP/pHluorin floresan için floresan filtre ünitesini değiştirin.
   NOT: Bu deney düzeneğinde pHluorin, 470/40 nm uyarma ve 510/20 nm emisyon filtreleri ile görüntülenmiştir. TagRFP, 555/20 nm uyarma ve 595/44 nm emisyon filtreleri ile görüntülendi. Micro-Manager yazılımı, bilimsel bir cMOS kamera ve LED ışık kaynağının TTL deklanşörü ile görüntü alımını eş zamanlı olarak kontrol etmek için kullanılır. Görüntü alımını ve elektriksel stimülasyonu senkronize etmek için Arduino, dijital bir G/Ç cihazı olarak kullanılır. Komut dosyası gerektirmeyen başka bir seçenek de Molecular Devices'tan Digidata ve yazılımını kullanmaktır.
2. Görüntü alma ve elektrik stimülasyonunun senkronize edilmesi için görüntü alma yazılımının ve dijital G/Ç cihazının ayarını belirleyin. Doygunluk olmadan 1 Hz hızlandırılmış modda yeterince parlak bir görüntü elde etmek için ışık kaynağının pozlamasını ve yoğunluğunu optimize edin ve pozlama süresini ana Micro-Manager penceresinin Pozlama [ms] alanına girin.
3. Stimülasyon frekansını, aksiyon potansiyellerinin (AP'ler) sayısını ve görüntü alımının başlangıcı ile stimülasyon iletimi arasındaki süreyi belirleyin ve bunları Arduino komut dosyasında kodlayın. Parametrelere bağlı olarak, toplam görüntü alma uzunluğuna karşılık gelen alınan görüntü sayısını belirleyin ve bunu Mikro Yöneticinin Çok Boyutlu Edinme penceresinin Sayı alanına girin. 1 Hz zaman atlamalı görüntüleme elde etmek için Aralık alanında 1 s olarak ayarlayın. Elektriksel stimülasyon için, uyaran izolatöründen 1 ms sabit voltaj darbeleri (70 mV) verin.
4. Görüntü alımını gerçekleştirin. Sayısallaştırıcı komutunu yürütün ve görüntü alımını gerçekleştirin. Kabul edilemez bir görüntü kayması olmadığını ve pHluorin yanıtlarının gözlemlenebildiğini doğrulayın. Aksi takdirde, elektrot konumu yanlıştır. Adım 4.2'ye geri dönün.
   NOT: pHluorin yanıtını potansiyel olarak etkileyebilecek doku hasarı, kas liflerinin DIC görüntüsü ile kolayca tanımlanabilir. Böyle bir hasarın yokluğunda herhangi bir pHluorin yanıtı gözlenmezse, elektrot konumlandırması yanlış olabilir. Bu, büyük görüntü kayması olarak tanımlanabilir, çünkü yanlış elektrot konumlandırması, adım 4.2'de açıklandığı gibi kas kasılmasına neden olur. Bazen pHluorin tepkisinin ortaya çıkarılmamasına neden olan diğer sorun, teta cam kılcal damarda sıkışan havadır ve bu da elektrotun elektriksel izolasyonuna yol açar. Yanlış elektrot konumlandırmasından kaynaklanan kas kasılması, Z ekseninde görüntü kaymasına neden olur ve bu durum sonraki görüntü analizlerinde düzeltilemez (bkz. adım 6.5). Bu nedenle, büyük görüntü kaymalarına sahip verilerin görüntü alımı sırasında tanımlanması ve hariç tutulması önerilir.
5. Deneyin amacına bağlı olarak, stimülasyon yoğunluğunu (yani darbe sıklığı ve sayısı) ve/veya sıcaklığı değiştirin. Zaman atlamalı görüntüleri, TIFF görüntülerinden oluşan bir zaman serisi yığını olarak kaydedin. Video 2'ye bakın.

6. Görüntü analizi

NOT: Aşağıdaki görüntü işleme ve analizi gerçekleştirmek için Fiji'yi kullanın. Ölçüm sonuçlarını hesaplamak için Microsoft Excel veya benzeri bir elektronik tablo yazılımı kullanın. Elde edilen sonuç üzerinde eğri uydurma yapmak için Igor Pro'yu kullanın.

1. Aşağıda açıklandığı gibi aktif sinapsları vurgulayan bir fark görüntüsü oluşturun.
   1. Dosya > Aç'ı seçerek Fiji'deki görüntülerin zaman serisi yığınını açın. Görüntülenen görüntüler soluksa, Görüntü >Ayarla >Parlaklık/Kontrast >Otomatik'i seçin. Uygula'ya tıklamayın, çünkü bu sinyal yoğunluğunu yeniden ölçeklendirir ve daha fazla analizi imkansız hale getirir. Analiz Et > Ölçeği Ayarla'yı seçin ve görüntüleme koşulunda tanımlanan kalibrasyon faktörünü girin.
   2. Görüntü > Çoğalt'ı seçerek ve görüntü dizisinin aralığını belirten uygun bir sayı girerek (örneğin, 15 s'lik bir ön uyaran periyodu olan deney için 11-15) uyaran öncesi dönemde çekilen beş görüntüden oluşan bir yığın oluşturun.
   3. Görüntü > Yığınları > Z Projesi'ni seçin ve Projeksiyon Türü açılır menüsünden Ortalama Yoğunluk'u seçin. Uyaran öncesi dönemin temsili bir görüntüsünü oluşturmak için Tamam'a basın (Şekil 4B). Ortalama alma işlemi, sinyal dalgalanmalarının etkisini azaltmak için önemlidir.
   4. Benzer işlemeyi kullanarak uyaran sonrası dönemin ortalama bir görüntüsünü oluşturun (Şekil 4B). Stimülasyonun bitiminden hemen sonra beş görüntüden oluşan bir yığını çoğaltın (örneğin, 15 sn uyaran öncesi periyodu ve 10 sn uyaran periyodu deneyi için 26-30^{. görüntü).} Görüntü Hesaplayıcı > İşlem'i seçin ve açılır menülerde ortalama uyaran öncesi görüntüyü ve ortalama uyaran sonrası görüntüyü sırasıyla Resim 1 ve Resim 2 olarak ayarlayın.
   5. İşlem açılır menüsünden Çıkar'ı seçin ve aktif sinapsları vurgulayan bir fark görüntüsü oluşturmak için Tamam'a basın (Şekil 4B).
2. Analiz edilecek ilgi alanlarını (ROI'ler) tanımlayın.
   1. Düzenle > Seçimi seçin > Adım 6.1'de oluşturulan fark görüntüsünde 7 μm çapında dairesel bir ROI belirleyin ve oluşturun. ROI'yi vurgulanan aktif sinaps üzerine yerleştirin ve ROI'yi ROI Yöneticisi'ne eklemek için T tuşuna basın. Şekil 4C-D'de gösterilen temsili sonuçta, butonların etrafına 6 ROI yerleştirildi.
   2. Sinyal artışının gözlenmediği bölgelerde aynı boyutta 5 ROI daha konumlandırın. Bir sonraki adımda arka plan sinyali olarak ortalama floresanlarını kullanın. ROI Yöneticisi menüsünden Daha Fazla >Kaydet'i seçerek ROI'leri kaydedin.
3. Sinyal yoğunluğunu ölçün ve floresandaki önemli değişikliği hesaplayın.
   1. Orijinal zaman serisi yığınını seçin ve adım 6.2'de kaydedilen ROI'leri yığına aktarın. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve yalnızca Ortalama gri değer onay kutusunu seçin. ROI Yöneticisi menüsünden More > Multi Measure'ı seçerek ROI'lerdeki ortalama floresan yoğunluğunu tüm zaman noktalarında ölçün.
   2. Sonuçlar penceresindeki tüm değerleri kopyalayın ve bir elektronik tablo programına yapıştırın. 5 arka plan ROI'sinden ortalama arka plan sinyalini hesaplayın ve bunu her bir bouton'da önemli bir floresan değişikliği sağlayan her sinaptik ROI'den çıkarın (Şekil 4D). Tek bir görünümden (bu durumda, 6 bouton) elde edilen tüm verilerin ortalaması, n = 1 deney olarak sayılır. Şekil 4E'de, ortalama alma ile elde edilen her iz, tüm zaman noktalarındaki değerin ilk temel dönem boyunca ortalama değere bölünmesiyle F/F₀ olarak temsil edilir.
4. Eğri uydurma ile floresan bozunma süresi sabitini (tau) tahmin edin.
   1. Igor Pro'da Pencere > Yeni Tablo'yu seçerek yeni bir veri tablosu açın. Elektronik tablodan zaman noktası ve F/F₀ verilerini kopyalayın ve farklı bir satırdaki tabloya yapıştırın. Yeni Grafik > Pencere'yi seçin, F/F₀ verilerini Y Dalgası ve zaman noktası verilerini X Dalgası olarak seçin ve bir grafik oluşturmak için Yap'a basın.
   2. Pencere > Bilgileri Göster'i seçin ve bir imleci sinyal tepe noktasına, diğerini de izlemenin sonuna getirerek analiz edilecek veri aralığını tanımlayın. Analiz > Eğri Uydurma'yı seçin ve İşlev açılır menüsünde exp_XOffset'yi seçin ve Dalga açılır menüsünde uygun X ve Y Dalgaları'nı seçin.
   3. Veri Seçenekleri'ne tıklayın ve eğri uydurma aralığını ayarlamak için İmleçler düğmesine basın. Katsayılar'a tıklayın, Y0 için 1 girin ve Yap'a basın. Bu prosedürle eğri uydurma, SV endositozu ve yeniden asitleşme oranlarını yansıtan floresan bozunma oranını temsil eden bir tau değeri sağlar.
5. Aşağıda açıklandığı gibi manuel sapma düzeltmesi (İsteğe bağlı) gerçekleştirin.
   1. Görüntü alma süresi boyunca görüntü kayması meydana gelirse ve seçilen nokta 7 μm çaplı ROI'nin dışına çıkarsa, Manuel Sapma Düzeltme eklentisini çalıştırın. Dosya > Aç'ı seçerek Fiji'de zaman serisi görüntü yığınını açın. Nokta araç çubuğunu tıklatarak Nokta aracını seçin.
   2. Yer işareti olarak en parlak bouton'u bulun ve ortasına bir nokta yerleştirin. Noktayı ROI yöneticisine eklemek için T tuşuna basın. Bu işlemi tüm görüntü dizisi için tekrarlayın. İlk görüntüyü görüntüleyin ve Kayıt > Eklentiler > Manuel Sapma Düzeltme'yi seçin. Düzeltilmiş görüntü serisi yığınını yeni bir dosya olarak kaydedin ve analiz için kullanın.
      NOT: X-Y kayması düzeltilebilse de, aşırı Z-kayması bu yöntemle düzeltilemez.

Sonuçlar

Diseke edilen örnek ciddi doku hasarı olmadan hazırlanırsa ve stimülasyon elektrodu omuriliğe uygun şekilde yerleştirilirse, yüksek frekanslı elektrik stimülasyonu ile sağlam bir pHluorin yanıtı ortaya çıkarılabilir (Şekil 4D, E). Uyaran öncesi başlangıç floresansı, muhtemelen presinapsın yüzeyinde bulunan probdan kaynaklanıyordu. Stimülasyon sırasında floresanstaki artış, probun yüzeye ekzositotik salınımı...

Tartışmalar

Larva zebra balığı NMJ, sinaptik fizyoloji ve patoloji çalışmaları için ortaya çıkan bir model sistemdir^26,31. SpH'ı nörona özgü bir şekilde eksprese eden bir transgenik zebra balığı zaten üretilmiş ve bir lokomotor kusur sergileyen bir mutantın analizi için kullanılmıştır¹⁷. Wen ve ^ark.17, WT kontrol NMJ'lerinde 100 Hz'de 1000 AP'nin uyarılması sırasın...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion system	ALA	VCPlus-4G
5x objective	Olympus	NPLN5X
Custum made imaging chamber	Physiotech	custum made	A black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate.
Digital I/O device	Arduino	Uno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrate	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJ	https://imagej.net/	imageJ 1.54f
Fine forceps	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipette	IWAKI	IK-PAS-5P	The tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm.
Glass Petri dish	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
Inline solution heater	Warner Instruments	SF-28
LED illumination system	X-cyte	XYLIS
Methylen blue	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tube	Warner Instruments	64-1553
Motorized micromanipulator	Scientifica	PatchStar
Motorized movable sample plate	Scientifica	MMSP
Pipette holder	Narishige	H-13
Pipette puller	Narishige	PC-100
Platinum wire (φ0.1mm)	Nilaco	PT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)	Niaco	PT-351381
Scalpel	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS camera	Thorlabs	CC215MU
Sea salt	NAPQO	Instant Ocean
Stereo microscope	Olympus	SZX7
Stimulus isolater	AMPI	ISO-FLEX
Suction tube	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Theta glass capillary	Sutter Instrument	BT-150-10
Tricaine (MS-222)	TCI	T0941
Upright microscope	Olympus	BX51WI