Imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées

Résumé

La jonction neuromusculaire larvaire du poisson-zèbre est un modèle intéressant pour l’étude de la physiologie synaptique. Il se prête à de nombreuses techniques expérimentales, notamment l’électrophysiologie et l’imagerie optique. Ici, nous décrivons un protocole d’imagerie de la transmission synaptique à l’aide d’une sonde à base de pHluorin sous un microscope à épifluorescence vertical.

Résumé

La communication neuronale est médiée par la transmission synaptique, qui dépend principalement de la libération de neurotransmetteurs stockés dans les vésicules synaptiques (SV) en réponse à un potentiel d’action (PA). Étant donné que les SV sont recyclés localement à la terminaison présynaptique, la coordination de l’exocytose et de l’endocytose des SV est importante pour une transmission synaptique soutenue. Une protéine fluorescente verte sensible au pH, appelée pHluorin, fournit un outil puissant pour surveiller l’exocytose / endocytose SV en la ciblant sur la lumière SV. Cependant, le suivi du recyclage des SV piloté par AP avec les sondes à base de pHluorin est encore largement limité aux préparations de culture in vitro , car l’introduction de sondes génétiquement codées et l’imagerie optique ultérieure sont techniquement difficiles en général pour les modèles animaux in vivo ou les préparations tissulaires. Le poisson-zèbre est un système modèle offrant des caractéristiques précieuses, notamment la facilité de manipulation génétique, la clarté optique et le développement externe rapide. Nous avons récemment généré un poisson-zèbre transgénique qui exprime fortement une sonde marquée à la pHluorine aux terminaisons des motoneurones et développé un protocole pour surveiller l’exo/endocytose SV induite par AP à la jonction neuromusculaire (JNM), un modèle de synapse bien établi qui se forme in vivo. Dans cet article, nous montrons comment préparer une préparation de NMJ de poisson-zèbre larvaire adaptée à l’imagerie pHluorin. Nous montrons également que la préparation permet une imagerie en accéléré sous un microscope à épifluorescence vertical conventionnel, fournissant une plate-forme rentable pour l’analyse de la fonction NMJ.

Introduction

La transmission synaptique, médiée par la libération de neurotransmetteurs par les vésicules synaptiques (SV) à la terminaison présynaptique, est un processus fondamental sous-jacent à la fonction nerveuse¹. Dans les premières études, la transmission synaptique était mesurée principalement par des techniques électrophysiologiques qui détectent la réponse postsynaptique provoquée par les neurotransmetteurs et leurs récepteurs. Au cours des dernières décennies, cependant, plusieurs types de techniques d’imagerie ont été développés pour visualiser directement la fonction présynaptique². L’une des sondes les plus utilisées est une protéine fluorescente verte sensible au pH appelée pHluorin ^3,4.

Le recyclage des vésicules synaptiques (SV) au niveau de la terminaison présynaptique est un processus crucial pour la transmission soutenue des neurotransmetteurs⁵. Suite à la libération de neurotransmetteurs par exocytose des SV, dont la lumière est généralement maintenue à pH acide ^6,7, la membrane et les protéines SV sont immédiatement récupérées de la membrane plasmique par endocytose. Les SV nouvellement formés sont ensuite réacidifiés et les neurotransmetteurs sont rechargés. Lorsque pHluorin est ciblée dans la lumière SV en la fusionnant à la protéine SV, elle présente une fluorescence minimale à l’état de repos. Cependant, lors de l’exocytose SV, il est exposé au pH neutre dans l’espace extracellulaire, ce qui entraîne une fluorescence brillante. Par la suite, la fluorescence diminue progressivement suite à la réacidification de la SV. Par conséquent, la fluorescence de pHluorin permet de surveiller les processus de recyclage des SV.

Dans des études pionnières, synaptobrevin/VAMP 2, la protéine vésiculaire SNARE (soluble NSF-attachment protein receptor) responsable de la fusion des vésicules synaptiques dans les synapses du cerveau antérieur⁸ et la plus abondante parmi les protéines SV⁹, a été sélectionnée comme partenaire de fusion pour pHluorin, et la protéine de fusion résultante a été désignée comme synaptopHluorin (SpH)^3,4. Cependant, le SpH présentait un faible rapport signal/bruit (S/B) en raison de l’expression de surface substantielle de la sonde. Par conséquent, d’autres protéines SV ont été testées en tant que partenaires porteurs 10,11,12. À ce jour, il a été démontré que les transporteurs vésiculaires présentent l’expression de surface la plus faible 13,14,15. L’utilisation de ces sondes a été initialement établie dans des neurones de mammifères en culture pour suivre le recyclage des SV induits par AP 8,9,10,11,12,13 et a été étendue à d’autres préparations, y compris des tissus disséqués et des animaux in vivo 16,17,18,19,20,^{21 et 22.}

Les larves de poisson-zèbre sont un système modèle avec des caractéristiques précieuses, notamment la facilité de manipulation génétique, la clarté optique et le développement externe rapide. Le poisson-zèbre transgénique exprimant la pHluorin fusionnée à la synaptophysine, appelée SypHy, a été généré et appliqué à plusieurs configurations expérimentales, par exemple, le suivi de la fusion spontanée des neurones spinaux par voie SV in vivo²¹, le recyclage des SV indépendants de l’AP au niveau des synapses de type ruban in vivo^20,22 ou dans des cellules isolées 23,24,25. Cependant, l’application de l’imagerie pHluorin du recyclage des SV induits par AP dans le modèle de poisson-zèbre est encore limitée.

La jonction neuromusculaire (JNM) sert de modèle attrayant pour étudier la physiologie synaptique²⁶, et plusieurs études ont réussi à réaliser l’imagerie du recyclage SV induit par AP avec SpH chez la souris^18,19. L’utilisation des NMJ pour le recyclage des SV chez le poisson-zèbre a été mise au point par Wen et ^al.16. Récemment, nous avons généré des poissons-zèbres Tg qui expriment fortement la pHluorin marquée avec un transporteur vésiculaire de GABA (VGAT) spécifiquement dans les motoneurones²⁷. Cette sonde contient également un HaloTag en tandem avec pHluorin à la queue luminale du VGAT et est donc nommée VpHalo. Bien que le VGAT ne soit pas exprimé de manière endogène dans les motoneurones cholinergiques, nous avons confirmé que VpHalo se localise dans tous les pools de SV et est correctement recyclé en réponse aux PA en combinant l’enregistrement électrophysiologique, le marquage SV dépendant de l’activité avec les ligands HaloTag et l’imagerie en direct de pHluorin²⁷. En raison du niveau d’expression élevé et d’une fraction de surface minimale de VpHalo, la préparation de NMJ à partir de ce poisson Tg a permis de surveiller le recyclage des SV induits par AP avec un bon rapport S/B. De plus, la distribution clairsemée des NMJ dans le corps transparent rend la microscopie confocale à balayage laser inutile à cette fin. Bien que la surveillance du recyclage des SV induits par l’AP chez le poisson-zèbre intact soit la direction future souhaitable, il est de première importance d’établir la préparation de NMJ qui convient pour valider l’utilisation de la sonde à base de pHluorin dans des conditions bien contrôlées, comme cela a été fait dans les préparations d’élevage 3,4,10,11,12,13,14,15 . Ici, nous décrivons un protocole de dissection pour préparer un échantillon de NMJ de poisson-zèbre larvaire qui peut être utilisé pour plusieurs types d’expériences, par exemple, l’enregistrement par patch clamp des courants d’extrémité, l’étiquetage HaloTag des SV recyclés et l’imagerie en direct pHluorin, comme indiqué ci-dessus. De plus, nous nous sommes concentrés sur et avons fourni un protocole détaillé pour l’imagerie en direct de pHluorin à l’aide de cette préparation de JNM sous un microscope épifluorescent conventionnel équipé d’un dispositif de stimulation électrique et d’un système de perfusion de solution.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été menées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux à l’Université médicale et pharmaceutique d’Osaka. Les poissons-zèbres ont été élevés et maintenus sous un cycle de 14 heures de lumière à 10 heures d’obscurité. Les embryons et les larves ont été maintenus à 28-30 °C dans de l’eau d’œuf contenant 0,006 % de sel marin et 0,01 % de bleu de méthylène. Les expériences ont été menées 4 à 7 jours après la fécondation (dpf). Il est recommandé de nourrir les poissons deux fois par jour à partir de 5 dpf lorsque les expériences sont effectuées après 6 dpf. Le milieu doit être changé avant chaque repas.

1. Préparation des solutions

1. Préparez 200 mL de solution extracellulaire (112 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 10 mM d’HEPES, 10 mM de glucose, 2 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂, pH 7,3-7,4). Mélangez 6,4 mL de 3,5 M de NaCl, 0,4 mL de 1 M de KCl, 1 mL de 1 M HEPES (pH de 7,5), 0,4 mL de 1 M de CaCl₂, 0,2 mL de 1 M MgCl₂ et 360 mg de glucose, et ajoutez de l’eau ultrapure à 200 mL. Si le pH est en dehors de la plage 7,3-7,4, ajustez-le avec 1 M de NaOH. Utilisez la solution extracellulaire fraîchement préparée pour chaque expérience.
2. Préparez 100 mL de solution extracellulaire contenant 3 μM de D-tubocurarine (D-TBC). Ajouter 20 μL de solution mère de D-TBC 15 mM à 100 mL de solution extracellulaire.
   REMARQUE : La solution mère de D-TBC est préparée dans de l’eau et conservée à -20 °C.
   ATTENTION : Portez des gants et faites des préparatifs dans la cagoule lors de la manipulation de la poudre D-TBC. Il est également recommandé de porter des gants lors de la manipulation de la solution D-TBC.
3. Préparez 25 mL de solution extracellulaire contenant 0,02 % de tricaïne (MS-222). Ajouter 0,5 mL de solution mère de tricaïne à 1 % à 25 mL de solution extracellulaire.
   REMARQUE : La solution mère de tricaïne est préparée dans de l’eau et conservée à 4 °C. La tricaïne n’est utilisée que pour la dissection, et non pendant l’imagerie.

2. Préparation de l’électrode bipolaire à partir du capillaire en verre thêta

1. Tirez les capillaires en verre thêta à l’aide de l’extracteur de micropipette de sorte que le diamètre de la pointe soit compris entre 3 et 10 μm (Figure 1A).
   REMARQUE : Nous recommandons un protocole avec deux étapes ou plus pour tirer le capillaire.
2. Connectez la pipette en verre thêta (1,17 mm de diamètre intérieur avec 0,165 mm d’épaisseur de septum) à l’isolateur de stimulus. Remplissez la pipette avec la solution extracellulaire. Insérez un mince fil de platine (0,1 mm de diamètre) dans chaque ouverture du capillaire en verre thêta et connectez l’extrémité arrière du fil à l’isolateur de stimulus (Figure 1B). Attention à ne pas court-circuiter les deux fils de platine.

3. Préparation de l’échantillon

REMARQUE : Ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec les larves de poisson-zèbre Tg(hb9 :tTAad, TRE :RFP-P2A-VpHalo)²⁷, dans lesquelles les deux protéines suivantes, liées par un peptide de clivage P2A, ont été exprimées spécifiquement dans les motoneurones : une protéine fluorescente rouge rapporteure TagRFP et une protéine capteur VpHalo, qui est une protéine de fusion de pHluorin et de HaloTag avec la partie luminale du VGAT (Figure 2A). Le promoteur hb9 pilote l’expression du tTAad (transactivateur avancé contrôlé par la tétracycline), qui à son tour induit l’expression des gènes sous le promoteur composite de l’élément de réponse à la tétracycline (TRE). Le système d’expression inductible par Tet augmente le niveau d’expression des protéines. pHluorin permet de surveiller en direct le recyclage des SV en fonction de l’activité, tandis que HaloTag visualise les SV recyclés au cours d’une période donnée en marquant de manière covalente la protéine fusionnée (Figure 2A). Bien que les deux méthodes présentent des avantages uniques, dans cet article, nous nous concentrons sur l’imagerie pHluorin.

1. Verser 25 ml de solution extracellulaire contenant 0,02 % de tricane dans la boîte de Pétri en verre.
2. Pour la dissection, transférez une larve dans la boîte de Pétri. Pelez la peau de la larve à l’aide de deux pinces fines. À l’aide de la première pince, maintenez la larve en place et pincez la peau du côté dorsal de la vessie natatoire avec l’autre pince (figure 3A).
3. Retirez la vessie natatoire, les organes internes et la tête à l’aide de scalpels. La peau des deux côtés du corps du poisson peut souvent être retirée simultanément, voir Vidéo 1.

4. Placement de l’échantillon dans la chambre d’imagerie et insertion de l’électrode de stimulation

REMARQUE : Étant donné que le pH luminal au repos du SV est inférieur au pH 6,0, la fluorescence de la pHluorine aux JNM chez les poissons vivants est à peine observable (figure 2B). Cependant, lorsque la lumière SV a été alcalinisée, une localisation restreinte de VpHalo dans les NMJ a été observée (Figure 2C). Notamment, l’image confocale de la pile z des NMJ a montré qu’ils ne se chevauchaient pas dans le plan xy, à l’exception des bords des segments du corps (Figure 2C). Sur la base de cette observation, nous avons postulé que le microscope à épifluorescence était applicable pour l’imagerie en direct de VpHalo chez les larves de poisson-zèbre, ce qui a été validé comme détaillé dans le protocole suivant.

1. Transférez l’échantillon dans la chambre d’imagerie (Figure 3B) à l’aide d’une pipette Pasteur en verre dont l’embout est poli au feu. Fixez mécaniquement l’échantillon à l’aide d’un fil de nylon collé à un fil de platine en forme de C de manière à ce qu’il soit orienté à un angle approximativement parallèle à l’électrode de stimulation. (Figure 3C).
   REMARQUE : Un fil de platine en forme de C avec un fil de nylon a été fabriqué en laboratoire. Environ 1 cm de fil de platine de 0,5 mm de diamètre a été façonné en forme de C et tapoté avec un marteau pour l’aplatir. Le fil de nylon peut être obtenu à partir d’articles ménagers. Nous avons collé le fil de nylon, qui a été obtenu en démontant un égouttoir de cuisine disponible dans une épicerie. Un dispositif de fixation similaire est couramment utilisé dans l’expérience de la tranche de cerveau²⁸.
2. Perfuser continuellement l’échantillon avec une solution extracellulaire contenant 3 μM DE D-TBC à une vitesse d’environ 1,0 mL/min à l’aide d’un système de perfusion par gravité.
   REMARQUE : Il est recommandé de contrôler la température de la chambre à l’aide d’un réchauffeur de solution en ligne.
3. Insérez l’électrode de stimulation dans la moelle épinière. Tenez l’électrode préparée à partir de la pipette en verre thêta à l’étape 2 sur le porte-pipette équipé du micromanipulateur motorisé. Insérez l’électrode dans l’échantillon de manière à ce que l’extrémité se trouve près des motoneurones de la moelle épinière, qui sont situés sur la face ventrale de la moelle épinière et peuvent être identifiés comme des neurones positifs à TagRFP dans cet échantillon (Figure 3D). Avancez l’électrode à un angle oblique par rapport au segment adjacent à la position cible.
   REMARQUE : La frontière entre les segments du corps est dense et difficile à pénétrer, il est donc nécessaire d’appuyer lentement sur l’électrode. La position de la pointe de l’électrode est très importante. S’il est éloigné de la moelle épinière, il stimule directement les muscles adjacents, ce qui entraîne une grande dérive de l’image dans l’imagerie time-lapse suivante.

5. Acquisition d’images

1. Sélectionnez la région d’imagerie. Sur la base de l’image en direct de la fluorescence TagRFP, sélectionnez une région d’imagerie qui comprend plus de quelques boutons et exclut ceux à la limite du segment du corps (Figure 2C et Figure 4A). Choisissez la région du même segment corporel de l’électrode de stimulation car l’innervation des motoneurones est limitée à un seul segment du corps^29,30. Basculez l’unité de filtre de fluorescence pour la fluorescence GFP/pHluorin.
   REMARQUE : Dans ce dispositif expérimental, pHluorin a été imagé avec une excitation de 470/40 nm et des filtres d’émission de 510/20 nm. TagRFP a été imagé avec une excitation de 555/20 nm et des filtres d’émission de 595/44 nm. Le logiciel Micro-Manager est utilisé pour contrôler simultanément l’acquisition d’images avec une caméra scientifique cMOS et l’obturateur TTL de la source lumineuse LED. Pour synchroniser l’acquisition d’images et la stimulation électrique, Arduino est utilisé comme dispositif d’E/S numériques. Une autre option qui ne nécessite pas de script est d’utiliser Digidata et son logiciel de Molecular Devices.
2. Déterminez le réglage du logiciel d’acquisition d’images et du dispositif d’E/S numériques afin que l’acquisition d’images et la stimulation électrique soient synchronisées. Optimisez l’exposition et l’intensité de la source lumineuse pour obtenir une image suffisamment lumineuse en mode time-lapse 1 Hz sans saturation et entrez le temps d’exposition dans le champ Exposition [ms] de la fenêtre principale du Micro-Manager.
3. Déterminez la fréquence de stimulation, le nombre de potentiels d’action (PA) et le temps entre le début de l’acquisition de l’image et la délivrance de la stimulation, en les codant dans le script Arduino. En fonction des paramètres, déterminez le nombre d’images acquises correspondant à la durée totale d’acquisition d’images et saisissez-le dans le champ Nombre de la fenêtre Acquisition multidimensionnelle du Micro-Manager. Réglez 1 s dans le champ Intervalle pour obtenir une imagerie time-lapse de 1 Hz. Pour la stimulation électrique, délivrez des impulsions de tension constante de 1 ms (70 mV) à travers l’isolateur de stimulus.
4. Effectuer l’acquisition d’images. Exécutez la commande numériseur et effectuez l’acquisition d’images. Vérifiez qu’il n’y a pas de dérive d’image inacceptable et que les réponses pHluorin peuvent être observées. Sinon, la position de l’électrode est incorrecte. Revenez à l’étape 4.2.
   REMARQUE : Les lésions tissulaires qui peuvent potentiellement affecter la réponse pHluorin peuvent être facilement identifiées par l’image DIC des fibres musculaires. Si aucune réponse pHluorin n’est observée en l’absence de tels dommages, le positionnement de l’électrode peut être incorrect. Cela peut être identifié comme une grande dérive de l’image, car un mauvais positionnement des électrodes provoque une contraction musculaire, comme décrit à l’étape 4.2. L’autre problème qui entraîne parfois l’incapacité à susciter une réponse pHluorin est l’air emprisonné dans le capillaire en verre thêta, ce qui conduit à l’isolation électrique de l’électrode. La contraction musculaire due à un mauvais positionnement des électrodes provoque une dérive de l’image dans l’axe Z, qui ne peut pas être corrigée lors des analyses d’images ultérieures (voir étape 6.5). Par conséquent, il est recommandé d’identifier les données présentant de grandes dérives d’image lors de l’acquisition de l’image et d’en être exclues.
5. Selon le but de l’expérience, modifiez l’intensité de la stimulation (c’est-à-dire la fréquence et le nombre d’impulsions) et/ou la température. Enregistrez les images time-lapse sous la forme d’une pile de séries chronologiques d’images TIFF. Voir la vidéo 2.

6. Analyse d’images

REMARQUE : Utilisez Fiji pour effectuer le traitement et l’analyse d’image suivants. Utilisez Microsoft Excel ou un tableur similaire pour calculer les résultats de mesure. Utilisez Igor Pro pour effectuer l’ajustement de la courbe sur le résultat obtenu.

1. Créez une image de différence qui met en évidence les synapses actives, comme décrit ci-dessous.
   1. Ouvrez la pile d’images de séries chronologiques dans Fidji en choisissant Fichier > Ouvrir. Si les images affichées sont sombres, choisissez Image >Ajuster >Luminosité/Contraste >Auto. Ne cliquez pas sur Appliquer, car cela rééchelonnerait l’intensité du signal, ce qui rendrait impossible une analyse plus approfondie. Choisissez Analyser > Définir l’échelle et entrez le facteur d’étalonnage défini dans la condition d’imagerie.
   2. Créez une pile de cinq images prises pendant la période de pré-stimulus en sélectionnant Image > Dupliquer et en entrant un nombre approprié qui indique la plage de la séquence d’images (par exemple, 11-15 pour l’expérience avec une période de pré-stimulus de 15 s).
   3. Sélectionnez Piles de > d’images > Projet Z , puis Intensité moyenne dans le menu déroulant Type de projection. Appuyez sur OK pour créer une image représentative de la période précédant le stimulus (Figure 4B). Le processus de calcul de la moyenne est important pour réduire l’effet des fluctuations du signal.
   4. Créez une image moyenne de la période post-stimulus en utilisant un traitement similaire (Figure 4B). Dupliquez une pile de cinq images immédiatement après la fin de la stimulation (par exemple, la 26-30^ème image pour la période de pré-stimulus de 15 s et l’expérience de la période de stimulus de 10 s). Sélectionnez Traiter > calculatrice d’images et définissez l’image moyenne avant le stimulus et l’image moyenne après le stimulus comme Image 1 et Image 2 dans les menus déroulants, respectivement.
   5. Sélectionnez Soustraire dans le menu déroulant Opération et appuyez sur OK pour créer une image de différence qui met en évidence les synapses actives (Figure 4B).
2. Définir les régions d’intérêt (ROI) à analyser.
   1. Sélectionnez Modifier > Sélection > Spécifiez et créez un retour sur investissement circulaire de 7 μm de diamètre sur l’image de différence créée à l’étape 6.1. Placez le retour sur la synapse active en surbrillance et appuyez sur T pour ajouter le retour sur investissement dans le gestionnaire de retour sur investissement. Dans le résultat représentatif illustré à la figure 4C-D, 6 zones d’intérêt ont été positionnées autour des boutons.
   2. Positionnez 5 autres zones d’intérêt de la même taille dans les régions où aucune augmentation du signal n’est observée. Utilisez leur fluorescence moyenne comme signal de fond à l’étape suivante. Enregistrez les retours sur investissement en sélectionnant Plus >Enregistrer dans le menu Gestionnaire de retour sur investissement.
3. Mesurez l’intensité du signal et calculez la variation substantielle de la fluorescence.
   1. Sélectionnez la pile de séries chronologiques d’origine et transférez les retours sur investissement enregistrés à l’étape 6.2 dans la pile. Sélectionnez Analyser > Définir les mesures et cochez uniquement la case Valeur de gris moyenne. Mesurez l’intensité moyenne de fluorescence dans les zones d’intérêt sur tous les points temporels en sélectionnant Plus > Multi Mesure dans le menu Gestionnaire de retour sur investissement.
   2. Copiez toutes les valeurs de la fenêtre Résultats et collez-les dans un tableur. Calculez le signal de fond moyen des 5 zones d’intérêt d’arrière-plan et soustrayez-le de chaque retour d’intérêt synaptique, ce qui fournit un changement substantiel de fluorescence dans chaque bouton (Figure 4D). Faites la moyenne de toutes les données d’une seule vue (dans ce cas, 6 boutons), comptée comme n = 1 expérience. Dans la figure 4E, chaque trace obtenue par calcul de la moyenne est représentée par F/F₀ en divisant la valeur à tous les points temporels par la valeur moyenne au cours de la période de référence initiale.
4. Estimez la constante de temps de décroissance de la fluorescence (tau) par ajustement de courbe.
   1. Ouvrez une nouvelle table de données dans Igor Pro en sélectionnant Fenêtre > Nouvelle table. Copiez les données de point temporel et F/F₀ de la feuille de calcul et collez-les dans le tableau dans une autre rangée. Choisissez Fenêtre > Nouveau graphique, sélectionnez les données F/F₀ comme Vague Y et les données de point temporel comme Vague X, puis appuyez sur Exécuter pour créer un graphique.
   2. Choisissez Fenêtre > Afficher les infos et définissez la plage de données à analyser en plaçant un curseur sur le pic du signal et l’autre à la fin de la trace. Choisissez Analyse > ajustement de courbe et sélectionnez exp_XOffset dans le menu déroulant Fonction et les vagues X et Y appropriées dans le menu déroulant Vague.
   3. Cliquez sur Options de données et appuyez sur le bouton Curseurs pour définir la plage d’ajustement de courbe. Cliquez sur Coefficients, entrez 1 pour Y0 et appuyez sur Exécuter. L’ajustement de la courbe par cette procédure fournit une valeur tau qui représente le taux de décroissance de la fluorescence, qui reflète les taux d’endocytose et de réacidification de la SV.
5. Effectuez une correction manuelle de la dérive (en option) comme décrit ci-dessous.
   1. Si une dérive de l’image se produit et que le point sélectionné se déplace en dehors du retour d’intérêt de 7 μm de diamètre pendant la période d’acquisition de l’image, exécutez le plug-in de correction manuelle de la dérive. Ouvrez la pile d’images de séries chronologiques aux Fidji en sélectionnant Fichier > Ouvrir. Sélectionnez l’outil Point en cliquant sur la barre d’outils Point.
   2. Trouvez le bouton le plus lumineux comme point de repère et placez un point au centre de celui-ci. Appuyez sur T pour ajouter le point au gestionnaire de retour sur investissement. Répétez ce processus pour toute la séquence d’images. Affichez la première image et sélectionnez Plugins > Enregistrement > Correction manuelle de la dérive. Enregistrez la pile de séries d’images corrigée dans un nouveau fichier et utilisez-la pour l’analyse.
      REMARQUE : Bien que la dérive X-Y puisse être corrigée, une dérive Z excessive n’est pas corrigible avec cette méthode.

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Résultats

Si l’échantillon disséqué est préparé sans lésions tissulaires graves et que l’électrode de stimulation est correctement insérée dans la moelle épinière, une réponse pHluorin robuste peut être déclenchée par une stimulation électrique à haute fréquence (Figure 4D,E). La fluorescence de base avant le stimulus était probablement due à la sonde présente à la surface de la présynapse. L’augmentation de la fluorescenc...

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Discussion

La larve de poisson-zèbre NMJ est un système modèle émergent pour l’étude de la physiologie et de la pathologie synaptiques^26,31. Un poisson-zèbre transgénique exprimant le SpH d’une manière spécifique aux neurones a déjà été généré et utilisé pour l’analyse d’un mutant présentant un défaut locomoteur¹⁷. Wen et ^al.17 ont démontré une augmentation d’env...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion system	ALA	VCPlus-4G
5x objective	Olympus	NPLN5X
Custum made imaging chamber	Physiotech	custum made	A black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate.
Digital I/O device	Arduino	Uno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrate	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJ	https://imagej.net/	imageJ 1.54f
Fine forceps	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipette	IWAKI	IK-PAS-5P	The tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm.
Glass Petri dish	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
Inline solution heater	Warner Instruments	SF-28
LED illumination system	X-cyte	XYLIS
Methylen blue	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tube	Warner Instruments	64-1553
Motorized micromanipulator	Scientifica	PatchStar
Motorized movable sample plate	Scientifica	MMSP
Pipette holder	Narishige	H-13
Pipette puller	Narishige	PC-100
Platinum wire (φ0.1mm)	Nilaco	PT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)	Niaco	PT-351381
Scalpel	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS camera	Thorlabs	CC215MU
Sea salt	NAPQO	Instant Ocean
Stereo microscope	Olympus	SZX7
Stimulus isolater	AMPI	ISO-FLEX
Suction tube	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Theta glass capillary	Sutter Instrument	BT-150-10
Tricaine (MS-222)	TCI	T0941
Upright microscope	Olympus	BX51WI