Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas

Resumen

La unión neuromuscular de las larvas de pez cebra es un modelo atractivo para el estudio de la fisiología sináptica. Es susceptible de muchas técnicas experimentales, como la electrofisiología y las imágenes ópticas. Aquí, describimos un protocolo para la transmisión sináptica de imágenes utilizando una sonda basada en pHluorin bajo un microscopio de epifluorescencia vertical.

Resumen

La comunicación neuronal está mediada por la transmisión sináptica, que depende principalmente de la liberación de neurotransmisores almacenados en vesículas sinápticas (SV) en respuesta a un potencial de acción (AP). Dado que los SV se reciclan localmente en el terminal presináptico, la coordinación de la exocitosis y la endocitosis del SV es importante para la transmisión sináptica sostenida. Una proteína fluorescente verde sensible al pH, llamada pHluorin, proporciona una poderosa herramienta para monitorear la exo/endocitosis SV al dirigirla a la luz SV. Sin embargo, el seguimiento del reciclaje de SV impulsado por PA con las sondas basadas en pHluorin todavía se limita en gran medida a las preparaciones de cultivo in vitro , ya que la introducción de sondas codificadas genéticamente y las imágenes ópticas posteriores es técnicamente desafiante en general para los modelos animales in vivo o las preparaciones de tejidos. El pez cebra es un sistema modelo que ofrece características valiosas, como la facilidad de manipulación genética, la claridad óptica y el rápido desarrollo externo. Recientemente generamos un pez cebra transgénico que expresa altamente una sonda marcada con pHluorin en las terminales de las neuronas motoras y desarrollamos un protocolo para monitorear la exo/endocitosis SV impulsada por AP en la unión neuromuscular (NMJ), un modelo de sinapsis bien establecido que se forma in vivo. En este artículo, mostramos cómo preparar una preparación NMJ para larvas de pez cebra adecuada para la obtención de imágenes de pHluorin. También demostramos que la preparación permite la obtención de imágenes de lapso de tiempo bajo un microscopio de epifluorescencia vertical convencional, lo que proporciona una plataforma rentable para analizar la función de la NMJ.

Introducción

La transmisión sináptica, mediada por la liberación de neurotransmisores de las vesículas sinápticas (SV) en el terminal presináptico, es un proceso fundamental que subyace a la función nerviosa¹. En los primeros estudios, la transmisión sináptica se midió principalmente mediante técnicas electrofisiológicas que detectan la respuesta postsináptica provocada por los neurotransmisores y sus receptores. Sin embargo, en las últimas décadas, se han desarrollado varios tipos de técnicas de imagen que visualizan directamente la función presináptica². Una de las sondas más utilizadas es una proteína fluorescente verde sensible al pH llamada pHluorin ^3,4.

El reciclaje de las vesículas sinápticas (SV) en la terminal presináptica es un proceso crucial para la transmisión sostenida de neurotransmisores⁵. Tras la liberación de neurotransmisores por exocitosis de los SV, cuya luz se mantiene generalmente a pH ácido ^6,7, las proteínas de la membrana y del SV se recuperan inmediatamente de la membrana plasmática por endocitosis. A continuación, los SV recién formados se reacidifican y los neurotransmisores se recargan. Cuando la pHluorin se dirige a la luz SV fusionándola con la proteína SV, exhibe una fluorescencia mínima en el estado de reposo. Sin embargo, tras la exocitosis SV, se expone al pH neutro en el espacio extracelular, lo que da lugar a una fluorescencia brillante. Posteriormente, la fluorescencia disminuye gradualmente después de la reacidificación del SV. Por lo tanto, la fluorescencia de pHluorin permite el seguimiento de los procesos de reciclaje de SV.

En estudios pioneros, la sinaptobrevina/VAMP 2, la proteína vesicular SNARE (soluble NSF-attachment protein receptor) responsable de la fusión de las vesículas sinápticas en las sinapsis del prosencéfalo⁸ y la más abundante entre las proteínas SV⁹, fue seleccionada como compañera de fusión para la pHluorina, y la proteína de fusión resultante se designó como synaptopHluorin (SpH)^3,4. Sin embargo, el SpH exhibió una baja relación señal-ruido (S/N) debido a la expresión sustancial de la superficie de la sonda. Por lo tanto, otras proteínas SV han sido probadas como compañeras portadoras 10,11,12. Hasta la fecha, se ha demostrado que los transportadores vesiculares presentan la expresión superficial más baja 13,14,15. El uso de estas sondas se estableció inicialmente en neuronas de mamíferos cultivadas para rastrear el reciclaje de SV impulsado por AP 8,9,10,11,12,13 y se ha extendido a otras preparaciones, incluidos los tejidos disecados y los animales in vivo 16,17,18,19,20,^21,22.

Las larvas de pez cebra son un sistema modelo con características valiosas, como la facilidad de manipulación genética, la claridad óptica y el rápido desarrollo externo. Se generó un pez cebra transgénico que expresa pHluorin fusionado con sinaptofisina, llamado SypHy, y se aplicó a múltiples configuraciones experimentales, por ejemplo, el monitoreo de la fusión espontánea de SV de neuronas espinales in vivo²¹, el reciclaje de SV independiente de AP en sinapsis tipo cinta in vivo^20,22 o en células aisladas 23,24,25. Sin embargo, la aplicación de las imágenes de pHluorin del reciclaje de SV impulsado por AP en el modelo de pez cebra aún es limitada.

La unión neuromuscular (NMJ) sirve como un modelo atractivo para estudiar la fisiología sináptica²⁶, y varios estudios realizaron con éxito imágenes del reciclaje de SV impulsado por AP con SpH en ratones^18,19. El uso de NMJs para el reciclaje de SV en pez cebra fue iniciado por Wen et ^al.16. Recientemente, generamos peces cebra Tg que expresan altamente pHluorin marcado con un transportador vesicular de GABA (VGAT) específicamente en neuronas motoras²⁷. Esta sonda también contiene un HaloTag en tándem con pHluorin en la cola luminal de VGAT y, por lo tanto, se denomina VpHalo. Aunque VGAT no se expresa endógenamente en las neuronas motoras colinérgicas, confirmamos que VpHalo se localiza en todos los grupos de SV y se recicla adecuadamente en respuesta a los AP mediante la combinación de registro electrofisiológico, etiquetado de SV dependiente de la actividad con ligandos HaloTag e imágenes en vivo de pHluorin²⁷. Debido al alto nivel de expresión y a una fracción superficial mínima de VpHalo, la preparación de NMJ a partir de este pez Tg permitió el seguimiento del reciclaje de SV impulsado por PA con una buena relación S/N. Además, la escasa distribución de NMJ en el cuerpo transparente hace que la microscopía de barrido láser confocal sea innecesaria para este propósito. Aunque el monitoreo del reciclaje de SV impulsado por PA en pez cebra intacto es la dirección futura deseable, es de primordial importancia establecer la preparación de NMJ que sea adecuada para validar el uso de la sonda basada en pHluorin en condiciones bien controladas, como se hizo en las preparaciones cultivadas 3,4,10,11,12,13,14,15 . Aquí, describimos un protocolo de disección para preparar una muestra de NMJ de pez cebra larval que se puede usar para múltiples tipos de experimentos, por ejemplo, registro de corrientes de placa terminal, etiquetado HaloTag de SV reciclados e imágenes en vivo de pHluorin, como se discutió anteriormente. Además, nos centramos y proporcionamos un protocolo detallado para la obtención de imágenes en vivo de pHluorin utilizando esta preparación de NMJ bajo un microscopio epifluorescente convencional equipado con un dispositivo de estimulación eléctrica y un sistema de perfusión en solución.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales en la Universidad Médica y Farmacéutica de Osaka. Los peces cebra se criaron y mantuvieron bajo un ciclo de 14 h de luz a 10 h de oscuridad. Los embriones y larvas se mantuvieron a 28-30 °C en agua de huevo que contenía 0,006% de sal marina y 0,01% de azul de metileno. Los experimentos se llevaron a cabo a los 4-7 días después de la fertilización (dpf). Se recomienda que los peces sean alimentados dos veces al día a partir de los 5 dpf cuando los experimentos se realicen después de los 6 dpf. El medio debe cambiarse antes de cada alimentación.

1. Preparación de soluciones

1. Prepare 200 mL de solución extracelular (112 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 10 mM de glucosa, 2 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂, pH 7,3-7,4). Mezcle 6,4 mL de NaCl 3,5 M, 0,4 mL de KCl 1, 1 mL de HEPES 1 M (pH 7,5), 0,4 mL de CaCl₂ de 1 M, 0,2 mL de MgCl₂ y 360 mg de glucosa, y agregue agua ultrapura a 200 ml. Si el pH está fuera del rango de 7,3-7,4, ajústelo con NaOH 1 M. Utilice la solución extracelular recién preparada para cada experimento.
2. Prepare 100 mL de solución extracelular que contenga 3 μM de D-tubocurarina (D-TBC). Añadir 20 μL de solución madre de D-TBC de 15 mM a 100 mL de solución extracelular.
   NOTA: La solución madre de D-TBC se prepara en agua y se almacena a -20 °C.
   PRECAUCIÓN: Use guantes y haga preparativos en la capucha cuando manipule polvo D-TBC. También se recomiendan guantes cuando se manipula la solución D-TBC.
3. Prepare 25 mL de solución extracelular que contenga tricaína al 0,02% (MS-222). Añadir 0,5 mL de solución madre de tricaína al 1% a 25 mL de solución extracelular.
   NOTA: La solución madre de tricaína se prepara en agua y se almacena a 4 °C. La tricaína se usa solo para la disección, no durante la toma de imágenes.

2. Preparación de electrodo bipolar a partir de capilar de vidrio theta

1. Tire de los capilares de vidrio theta con el extractor de micropipetas de modo que el diámetro de la punta esté en el rango de 3-10 μm (Figura 1A).
   NOTA: Recomendamos un protocolo con dos o más pasos para tirar del capilar.
2. Conecte la pipeta de vidrio theta (1,17 mm de diámetro interior con 0,165 mm de espesor de tabique) al Estimulador Aislador. Llene la pipeta con la solución extracelular. Inserte un alambre delgado de platino (0,1 mm de diámetro) en cada abertura del capilar de vidrio theta y conecte el extremo posterior del cable al Aislador de Estímulo (Figura 1B). Tenga cuidado de no cortocircuitar los dos cables de platino.

3. Preparación de la muestra

NOTA: Este protocolo se ha optimizado para su uso con larvas de pez cebra Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo)²⁷, en las que las siguientes dos proteínas, unidas por un péptido de escisión P2A, se expresaron bicistrónicamente específicamente en las neuronas motoras: una proteína fluorescente roja reportera TagRFP y una proteína sensor VpHalo, que es una proteína de fusión de pHluorin y HaloTag a la parte luminal de VGAT (Figura 2A). El promotor de hb9 impulsa la expresión de tTAad (transactivador controlado por tetraciclina-avanzado), que a su vez induce la expresión de los genes bajo el promotor compuesto del elemento de respuesta a la tetraciclina (TRE). El sistema de expresión inducible por Tet aumenta el nivel de expresión de proteínas. pHluorin permite el monitoreo en vivo del reciclaje de SV dependiente de la actividad, mientras que HaloTag visualiza SV reciclados durante un período determinado mediante el etiquetado covalente de la proteína fusionada (Figura 2A). Aunque ambos métodos tienen ventajas únicas, en este artículo nos centramos en las imágenes de pHluorin.

1. Vierta 25 ml de solución extracelular que contenga 0,02% de tricano en la placa de Petri de vidrio.
2. Para la disección, transfiera una larva a la placa de Petri. Pela la piel de la larva con dos pinzas finas. Use las primeras pinzas para mantener la larva en su lugar y pellizque la piel en el lado dorsal de la vejiga natatoria con las otras pinzas (Figura 3A).
3. Retire la vejiga natatoria, los órganos internos y la cabeza con bisturíes. La piel de ambos lados del cuerpo del pez a menudo se puede quitar simultáneamente, vea el Video 1.

4. Colocación de la muestra en la cámara de imagen e inserción del electrodo estimulante

NOTA: Debido a que el pH luminal en reposo del SV está por debajo del pH 6.0, la fluorescencia de la pHluorina en NMJ en peces vivos es apenas observable (Figura 2B). Sin embargo, cuando el lumen SV se alcalinizó, se observó una localización restringida de VpHalo a NMJ (Figura 2C). En particular, la imagen confocal de la pila z de los NMJ mostró que no se superponían entre sí en el plano xy, excepto por los bordes de los segmentos del cuerpo (Figura 2C). Con base en esta observación, postulamos que el microscopio de epifluorescencia era aplicable para la obtención de imágenes en vivo de VpHalo en larvas de pez cebra, lo cual se validó como se detalla en el siguiente protocolo.

1. Transfiera la muestra a la cámara de imágenes (Figura 3B) utilizando una pipeta Pasteur de vidrio con punta pulida al fuego. Fije mecánicamente la muestra con un hilo de nailon pegado a un alambre de platino en forma de C de modo que quede orientado en un ángulo aproximadamente paralelo al electrodo estimulante. (Figura 3C).
   NOTA: En el laboratorio se fabricó un alambre de platino en forma de C con un hilo de nylon. Se formó aproximadamente 1 cm de alambre de platino de 0,5 mm de diámetro en forma de C y se golpeó con un martillo para aplanarlo. El hilo de nailon se puede obtener de artículos domésticos. Pegamos el hilo de nylon, que se obtuvo desmontando un escurridor de cocina disponible en una tienda de comestibles. Un dispositivo de fijación similar se utiliza rutinariamente en el experimento del corte de cerebro²⁸.
2. Perfundir continuamente la muestra con una solución extracelular que contenga 3 μM D-TBC a una velocidad de aproximadamente 1,0 mL/min utilizando un sistema de perfusión de flujo por gravedad.
   NOTA: Se recomienda que la temperatura de la cámara se controle mediante el uso de un calentador de solución en línea.
3. Inserte el electrodo de estimulación en la médula espinal. Sostenga el electrodo preparado a partir de la pipeta de vidrio theta en el paso 2 en el soporte de pipeta equipado con el micromanipulador motorizado. Inserte el electrodo en la muestra de modo que la punta esté cerca de las neuronas motoras espinales, que se encuentran en el lado ventral de la médula espinal y se pueden identificar como neuronas TagRFP positivas en este espécimen (Figura 3D). Haga avanzar el electrodo en un ángulo oblicuo desde el segmento adyacente hasta la posición objetivo.
   NOTA: El límite entre los segmentos del cuerpo es denso y difícil de penetrar, por lo que es necesario presionar el electrodo lentamente. La posición de la punta del electrodo es muy importante. Si está lejos de la médula espinal, estimula directamente los músculos adyacentes, lo que da como resultado una imagen grande a la deriva en las imágenes de lapso de tiempo posteriores.

5. Adquisición de imágenes

1. Seleccione la región de imagen. En función de la imagen en vivo de la fluorescencia de TagRFP, seleccione una región de imagen que incluya más de unos pocos botones y excluya aquellos en el límite del segmento corporal (Figura 2C y Figura 4A). Elija la región dentro del mismo segmento corporal del electrodo de estimulación porque la inervación de las neuronas motoras está limitada dentro de un solo segmento corporal^29,30. Cambie la unidad de filtro de fluorescencia para fluorescencia GFP/pHluorin.
   NOTA: En esta configuración experimental, se obtuvieron imágenes de pHluorin con filtros de excitación de 470/40 nm y de emisión de 510/20 nm. TagRFP se fotografió con filtros de excitación de 555/20 nm y de emisión de 595/44 nm. El software Micro-Manager se utiliza para controlar simultáneamente la adquisición de imágenes con una cámara cMOS científica y el obturador TTL de la fuente de luz LED. Para sincronizar la adquisición de imágenes y la estimulación eléctrica, Arduino se utiliza como un dispositivo de E/S digital. Otra opción que no requiere un script es utilizar Digidata y su software de Molecular Devices.
2. Determine la configuración del software de adquisición de imágenes y el dispositivo de E/S digital para que la adquisición de imágenes y la estimulación eléctrica estén sincronizadas. Optimice la exposición y la intensidad de la fuente de luz para adquirir una imagen suficientemente brillante en un modo time-lapse de 1 Hz sin saturación e introduzca el tiempo de exposición en el campo Exposición [ms] de la ventana principal del Micro-Manager.
3. Determine la frecuencia de estimulación, el número de potenciales de acción (AP) y el tiempo entre el inicio de la adquisición de imágenes y la entrega de la estimulación, codificándolos en el script Arduino. En función de los parámetros, determine el número de imágenes adquiridas correspondiente a la duración total de la adquisición de imágenes e introdúzcalo en el campo Recuento de la ventana Adquisición multidimensional del Micro-Manager. Establezca 1 s en el campo Intervalo para lograr imágenes de lapso de tiempo de 1 Hz. Para la estimulación eléctrica, administre pulsos de voltaje constante de 1 ms (70 mV) a través del aislador de estímulos.
4. Realizar la adquisición de imágenes. Ejecute el comando del digitalizador y realice la adquisición de imágenes. Verifique que no haya una deriva inaceptable de la imagen y que se puedan observar las respuestas de pHluorin. De lo contrario, la posición del electrodo es incorrecta. Vuelva al paso 4.2.
   NOTA: El daño tisular que puede afectar potencialmente la respuesta de la pHluorin se puede identificar fácilmente mediante la imagen DIC de las fibras musculares. Si no se observa una respuesta de pHluorin en ausencia de dicho daño, la colocación del electrodo puede ser incorrecta. Esto se puede identificar como una gran deriva de la imagen porque la colocación incorrecta del electrodo provoca la contracción muscular, como se describe en el paso 4.2. El otro problema que a veces resulta en la falla para provocar la respuesta de pHluorin es el aire atrapado en el capilar de vidrio theta, lo que conduce al aislamiento eléctrico del electrodo. La contracción muscular debida a una posición incorrecta de los electrodos provoca un desplazamiento de la imagen en el eje Z, que no se puede corregir en los análisis de imagen posteriores (véase el paso 6.5). Por lo tanto, se recomienda identificar los datos con grandes desviaciones de imagen durante la adquisición de imágenes y excluirlos.
5. Dependiendo del propósito del experimento, cambie la intensidad de la estimulación (es decir, la frecuencia y el número de pulsos) y/o la temperatura. Guarde las imágenes de lapso de tiempo como una pila de series temporales de imágenes TIFF. Ver video 2.

6. Análisis de imágenes

NOTA: Utilice Fiji para realizar el siguiente procesamiento y análisis de imágenes. Utilice Microsoft Excel o un software de hoja de cálculo similar para calcular los resultados de la medición. Utilice Igor Pro para realizar el ajuste de curvas en el resultado obtenido.

1. Cree una imagen de diferencia que resalte las sinapsis activas como se describe a continuación.
   1. Abra la pila de imágenes de series temporales en Fiyi eligiendo Archivo > Abrir. Si las imágenes mostradas son tenues, seleccione Imagen >Ajustar >Brillo/Contraste >Automático. No haga clic en Aplicar, ya que esto reescalará la intensidad de la señal, lo que imposibilitará un análisis más detallado. Elija Analizar > Establecer escala e introduzca el factor de calibración definido en la condición de imagen.
   2. Cree una pila de cinco imágenes tomadas durante el período previo al estímulo seleccionando Duplicar > imagen e ingresando un número apropiado que indique el rango de la secuencia de imágenes (por ejemplo, 11-15 para el experimento con un período previo al estímulo de 15 s).
   3. Seleccione Imagen > pilas > Proyecto Z y seleccione Intensidad media en el menú desplegable Tipo de proyección. Presione OK para crear una imagen representativa del período previo al estímulo (Figura 4B). El proceso de promediación es importante para reducir el efecto de las fluctuaciones de la señal.
   4. Cree una imagen promedio del período posterior al estímulo utilizando un procesamiento similar (Figura 4B). Duplique una pila de cinco imágenes inmediatamente después del final de la estimulación (por ejemplo,^{la imagen} 26-30 para el período previo al estímulo de 15 s y el experimento del período de estímulo de 10 s). Seleccione Procesar > Calculadora de imágenes y establezca la imagen promediada antes del estímulo y la imagen promediada después del estímulo como Imagen 1 e Imagen 2 en los menús desplegables, respectivamente.
   5. Seleccione Restar en el menú desplegable Operación y presione OK para crear una imagen de diferencia que resalte las sinapsis activas (Figura 4B).
2. Definir las regiones de interés (ROI) que se van a analizar.
   1. Seleccione Editar > Selección > Especificar y crear un ROI circular de 7 μm de diámetro en la imagen de diferencia creada en el paso 6.1. Coloque el ROI en la sinapsis activa resaltada y presione T para agregar el ROI en el Administrador de ROI. En el resultado representativo que se muestra en la Figura 4C-D, se colocaron 6 ROIs alrededor de los botones.
   2. Coloque otros 5 ROI del mismo tamaño en regiones donde no se observe un aumento de la señal. Utilice su fluorescencia media como señal de fondo en el siguiente paso. Guarde el ROI seleccionando Más >Guardar en el menú Administrador de ROI.
3. Mida la intensidad de la señal y calcule el cambio sustancial en la fluorescencia.
   1. Seleccione la pila de series temporales original y transfiera los ROI guardados en el paso 6.2 a la pila. Seleccione Analizar > establecer medidas y active solo la casilla de verificación Valor medio de gris. Mida la intensidad de fluorescencia promedio en los ROI en todos los puntos de tiempo seleccionando Más > Multi Measure en el menú Administrador de ROI.
   2. Copie todos los valores de la ventana Resultados y péguelos en un programa de hoja de cálculo. Calcule la señal de fondo promedio de los 5 ROI de fondo y réstela de cada ROI sináptico, lo que proporciona un cambio sustancial de fluorescencia en cada botón (Figura 4D). Promedio de todos los datos de una sola vista (en este caso, 6 botones), contados como n = 1 experimento. En la Figura 4E, cada traza obtenida por el promedio se representa como F/F₀ dividiendo el valor en todos los puntos de tiempo por el valor promedio durante el período de referencia inicial.
4. Estime la constante de tiempo de decaimiento de fluorescencia (tau) mediante el ajuste de la curva.
   1. Abra una nueva tabla de datos en Igor Pro seleccionando Ventana > Nueva tabla. Copie el punto de tiempo y los datos F/F₀ de la hoja de cálculo y péguelos en la tabla en una fila diferente. Elija Ventana > Nuevo gráfico, seleccione los datos F/F₀ como Onda Y y los datos de punto de tiempo como Onda X, y presione Hacerlo para crear un gráfico.
   2. Elija Ventana > Mostrar información y defina el rango de datos que se analizarán colocando un cursor en el pico de señal y el otro en el extremo de la traza. Elija Análisis > Ajuste de curva y seleccione exp_XOffset en el menú desplegable Función y las Ondas X e Y apropiadas en el menú desplegable Onda.
   3. Haga clic en Opciones de datos y pulse el botón Cursores para establecer el rango de ajuste de curvas. Haga clic en Coeficientes, escriba 1 para Y0 y presione Hacerlo. El ajuste de la curva mediante este procedimiento proporciona un valor tau que representa la tasa de decaimiento de la fluorescencia, que refleja las tasas de endocitosis y reacidificación del SV.
5. Realice la corrección manual de la deriva (opcional) como se describe a continuación.
   1. Si se produce un desviamiento de la imagen y el punto seleccionado se mueve fuera del ROI de 7 μm de diámetro durante el período de adquisición de la imagen, ejecute el complemento Corrección manual de desviación. Abra la pila de imágenes de series temporales en Fiyi seleccionando Archivo > Abrir. Seleccione la herramienta Punto haciendo clic en la barra de herramientas Punto.
   2. Encuentra el botón más brillante como punto de referencia y coloca un punto en el centro del mismo. Presione T para agregar el punto al administrador de ROI. Repita este proceso para toda la secuencia de imágenes. Muestre la primera imagen y seleccione Plugins > Registro > Corrección manual de desviación. Guarde la pila de series de imágenes corregidas como un archivo nuevo y utilícela para el análisis.
      NOTA: Aunque la deriva X-Y se puede corregir, la deriva Z excesiva no se puede corregir con este método.

Resultados

Si la muestra diseccionada se prepara sin daños tisulares graves y el electrodo de estimulación se inserta correctamente en la médula espinal, se puede obtener una respuesta robusta de pHluorin mediante estimulación eléctrica de alta frecuencia (Figura 4D, E). Es probable que la fluorescencia basal previa al estímulo se debiera a la sonda presente en la superficie de la presinapsis. El aumento de la fluorescencia durante la estimulaci?...

Discusión

Las larvas de pez cebra NMJ son un sistema modelo emergente para el estudio de la fisiología y patología sináptica^26,31. Ya se ha generado y empleado un pez cebra transgénico que expresa SpH de una manera específica para neuronas para el análisis de un mutante que presenta un defecto locomotor¹⁷. Wen et ^al.17 demostraron un aumento de aproximadamente 2 veces en la fluorescenci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion system	ALA	VCPlus-4G
5x objective	Olympus	NPLN5X
Custum made imaging chamber	Physiotech	custum made	A black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate.
Digital I/O device	Arduino	Uno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrate	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJ	https://imagej.net/	imageJ 1.54f
Fine forceps	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipette	IWAKI	IK-PAS-5P	The tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm.
Glass Petri dish	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
Inline solution heater	Warner Instruments	SF-28
LED illumination system	X-cyte	XYLIS
Methylen blue	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tube	Warner Instruments	64-1553
Motorized micromanipulator	Scientifica	PatchStar
Motorized movable sample plate	Scientifica	MMSP
Pipette holder	Narishige	H-13
Pipette puller	Narishige	PC-100
Platinum wire (φ0.1mm)	Nilaco	PT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)	Niaco	PT-351381
Scalpel	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS camera	Thorlabs	CC215MU
Sea salt	NAPQO	Instant Ocean
Stereo microscope	Olympus	SZX7
Stimulus isolater	AMPI	ISO-FLEX
Suction tube	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Theta glass capillary	Sutter Instrument	BT-150-10
Tricaine (MS-222)	TCI	T0941
Upright microscope	Olympus	BX51WI