Живая визуализация рециркуляции синаптических везикул в нервно-мышечном соединении расчлененных личинок данио-рерио

Резюме

Нервно-мышечное соединение личинки данио-рерио является привлекательной моделью для изучения синаптической физиологии. Он поддается многим экспериментальным методикам, включая электрофизиологию и оптическую визуализацию. В этой статье мы опишем протокол визуализации синаптической передачи с помощью зонда на основе pHluorin под вертикальным эпифлуоресцентным микроскопом.

Аннотация

Нейронная коммуникация опосредована синаптической передачей, которая зависит в первую очередь от высвобождения нейротрансмиттеров, хранящихся в синаптических везикулах (SV), в ответ на потенциал действия (AP). Поскольку SV рециркулируются локально в пресинаптической окончании, координация экзоцитоза SV и эндоцитоза важна для устойчивой синаптической передачи. pH-чувствительный зеленый флуоресцентный белок, называемый pHluorin, является мощным инструментом для мониторинга экзо/эндоцитоза SV, нацеливаясь на просвет SV. Тем не менее, отслеживание рециркуляции SV, управляемой AP, с помощью зондов на основе pHluorin по-прежнему в значительной степени ограничено препаратами культур in vitro , поскольку введение генетически кодируемых зондов и последующая оптическая визуализация в целом технически сложны для животных моделей или препаратов тканей in vivo . Рыбки данио-рерио — это модельная система, обладающая ценными характеристиками, включая простоту генетических манипуляций, оптическую прозрачность и быстрое внешнее развитие. Недавно мы создали трансгенную рыбку данио, которая высоко экспрессирует меченный pHluorin зонд в окончаниях моторных нейронов, и разработали протокол для мониторинга AP-управляемого SV-экзо/эндоцитоза в нервно-мышечном соединении (NMJ), хорошо зарекомендовавшей себя модели синапсов, которая формируется in vivo. В этой статье мы покажем, как приготовить препарат NMJ для личинок данио-рерио, подходящий для визуализации pHluorin. Мы также показываем, что препарат позволяет проводить покадровую визуализацию под обычным вертикальным эпифлуоресцентным микроскопом, обеспечивая экономически эффективную платформу для анализа функции NMJ.

Введение

Синаптическая передача, опосредованная высвобождением нейромедиаторов из синаптических везикул (СВ) в пресинаптической окончании, является фундаментальным процессом, лежащим в основе нервной функции¹. В ранних исследованиях синаптическая передача измерялась в основном с помощью электрофизиологических методов, которые обнаруживают постсинаптическую реакцию, вызванную нейротрансмиттерами и их рецепторами. Однако за последние несколько десятилетий было разработано несколько типов методов визуализации, которые непосредственно визуализируют пресинаптическую функцию^. Одним из наиболее широко используемых зондов является pH-чувствительный зеленый флуоресцентный белок под названием pHluorin ^3,4.

Рециркуляция синаптических везикул (СО) в пресинаптических окончаниях является важнейшим процессом для устойчивой передачи нейротрансмиттеров⁵. После высвобождения нейротрансмиттеров в результате экзоцитоза SV, просвет которых обычно поддерживается на кислом pH ^6,7, мембрана и белки SV немедленно извлекаются из плазматической мембраны посредством эндоцитоза. Вновь образованные SV затем повторно подкисляются, а нейротрансмиттеры перезагружаются. Когда pHluorin нацеливается на SV-просвет путем слияния его с SV-белком, он проявляет минимальную флуоресценцию в состоянии покоя. Однако при экзоцитозе SV он подвергается воздействию нейтрального pH во внеклеточном пространстве, что приводит к яркой флуоресценции. Впоследствии флуоресценция постепенно снижается после повторного закисления SV. Таким образом, флуоресценция pHluorin позволяет контролировать процессы переработки SV.

В новаторских исследованиях синаптобревин/VAMP 2, везикулярный белок SNARE (растворимый рецептор белка прикрепления NSF), ответственный за слияние синаптических везикул в синапсах переднего мозга⁸ и наиболее распространенный среди белков SV⁹, был выбран в качестве партнера по слиянию для pHluorin, а полученный белок слияния был обозначен как synaptopHluorin (SpH)^3,4. Тем не менее, SpH демонстрирует низкое отношение сигнал/шум (S/N) из-за значительной поверхностной экспрессии зонда. Таким образом, другие белки SV были протестированы в качестве партнеров-носителей 10,11,12. На сегодняшний день доказано, что везикулярные транспортеры демонстрируют самую низкую поверхностную экспрессию 13,14,15. Использование этих зондов было первоначально установлено в культивируемых нейронах млекопитающих для отслеживания АР-управляемой рециркуляции SV 8,9,10,11,12,13 и было распространено на другие препараты, включая препарированные ткани и животных in vivo 16,17,18,19,20.^21,22.

Личинки данио-рерио представляют собой модельную систему с ценными характеристиками, включая простоту генетических манипуляций, оптическую прозрачность и быстрое внешнее развитие. Трансгенные рыбки данио-рерио, экспрессирующие pHluorin, слитые с синаптофизином, называемые SypHy, были получены и применены в нескольких экспериментальных установках, например, для мониторинга спонтанного SV-слияния спинномозговых нейронов in vivo²¹, AP-независимой рециркуляции SV в синапсах ленточного типа in vivo ^20,22 или в изолированных клетках 23,24,25. Тем не менее, применение визуализации pHluorin для рециркуляции SV, вызванной AP, в модели рыбок данио все еще ограничено.

Нервно-мышечное соединение (NMJ) служит привлекательной моделью для изучения синаптической физиологии²⁶, и в нескольких исследованиях была успешно выполнена визуализация рециркуляции SV, вызванной AP, с SpH у мышей ^18,19. Использование NMJ для переработки SV у рыбок данио было впервые предложено Wen et ^al.16. Недавно мы создали рыбок данио Tg, которые высоко экспрессируют pHluorin, помеченный везикулярным транспортером GABA (VGAT), в частности, в моторных нейронах²⁷. Этот зонд также содержит HaloTag в тандеме с pHluorin в люминальном хвосте VGAT и, следовательно, называется VpHalo. Несмотря на то, что VGAT эндогенно не экспрессируется в холинергических мотонейронах, мы подтвердили, что VpHalo локализуется во всех пулах SV и должным образом рециркулируется в ответ на AP путем комбинации электрофизиологической записи, зависимого от активности мечения SV лигандами HaloTag и визуализации pHluorin²⁷ в реальном времени. Благодаря высокому уровню экспрессии и минимальной поверхностной фракции VpHalo, препарат NMJ из этой рыбы Tg позволил контролировать рециркуляцию SV, вызванную AP, с хорошим соотношением S/N. Кроме того, разреженное распределение NMJ в прозрачном теле делает конфокальную лазерную сканирующую микроскопию ненужной для этой цели. Несмотря на то, что мониторинг рециркуляции SV, вызванного AP, у неповрежденных рыбок данио рерио является желательным направлением в будущем, первостепенное значение имеет разработка препарата NMJ, пригодного для валидации использования зонда на основе pHluorin в хорошо контролируемых условиях, как это было сделано в культивируемых препаратах 3,4,10,11,12,13,14,15 . В этой статье мы описываем протокол вскрытия для подготовки образца NMJ личинки данио-рерио, который может быть использован для нескольких типов экспериментов, например, для записи токов на торцевой пластине с помощью патч-хомута, маркировки HaloTag переработанных SV и визуализации pHluorin в реальном времени, как обсуждалось выше. Кроме того, мы сосредоточились на подробном протоколе визуализации пХлуорина в реальном времени с использованием этого препарата NMJ и предоставили его на обычном эпифлуоресцентном микроскопе, оснащенном устройством для электрической стимуляции и системой перфузии раствора.

протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию животных в Осакском медицинском и фармацевтическом университете. Рыбок данио выращивали и содержали в темном цикле от 14 до 10 часов. Эмбрионы и личинки содержались при температуре 28-30 °C в яичной воде, содержащей 0,006% морской соли и 0,01% метиленового синего. Эксперименты проводили через 4-7 дней после оплодотворения (dpf). Рекомендуется кормить рыб два раза в день, начиная с 5 dpf, когда эксперименты проводятся после 6 dpf. Среду необходимо менять перед каждым кормлением.

1. Приготовление растворов

1. Приготовьте 200 мл внеклеточного раствора (112 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, pH 7,3-7,4). Смешайте 6,4 мл 3,5 М NaCl, 0,4 мл 1 М KCl, 1 мл 1 М HEPES (pH 7,5), 0,4 мл 1 М CaCl₂, 0,2 мл 1 М MgCl₂ и 360 мг глюкозы и добавьте 200 мл сверхчистой воды. Если pH находится за пределами диапазона 7,3-7,4, отрегулируйте его с помощью 1 М NaOH. Для каждого эксперимента используйте свежеприготовленный внеклеточный раствор.
2. Приготовьте 100 мл внеклеточного раствора, содержащего 3 мкМ D-тубокурарина (D-TBC). Добавьте 20 мкл 15 мМ стокового раствора D-TBC в 100 мл внеклеточного раствора.
   Примечание: Исходный раствор D-TBC готовится в воде и хранится при температуре -20 °C.
   ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки и делайте приготовления в капюшоне при работе с порошком D-TBC. При работе с раствором D-TBC также рекомендуется надевать перчатки.
3. Приготовьте 25 мл внеклеточного раствора, содержащего 0,02% трикаина (MS-222). Добавьте 0,5 мл 1% стокового раствора трикаина к 25 мл внеклеточного раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый раствор трикаина готовится в воде и хранится при температуре 4 °C. Трикаин используется только для вскрытия, а не во время визуализации.

2. Препарирование биполярного электрода из тетастеклянного капилляра

1. Потяните капилляры тета-стекла с помощью съемника микропипетки так, чтобы диаметр наконечника был в диапазоне 3-10 мкм (рис. 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем протокол с двумя или более этапами для вытягивания капилляра.
2. Подсоедините пипетку из тета-стекла (внутренний диаметр 1,17 мм и толщина перегородки 0,165 мм) к изолятору стимулов. Наполните пипетку внеклеточным раствором. Вставьте тонкую платиновую проволоку (диаметром 0,1 мм) в каждое отверстие капилляра тетастекла и подсоедините задний конец провода к изолятору стимулов (рис. 1B). Будьте осторожны, чтобы не закоротить два платиновых провода.

3. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол был оптимизирован для использования с личинками²⁷ данио-рерио Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo), у которых следующие два белка, связанные пептидом расщепления P2A, бицистронно экспрессировались специфически в моторных нейронах: репортерный красный флуоресцентный белок TagRFP и сенсорный белок VpHalo, представляющий собой слияние белка pHluorin и HaloTag с люминальной частью VGAT (рисунок 2A). Промотор hb9 управляет экспрессией tTAad (тетрациклин-контролируемый трансактиватор-продвинутый), который, в свою очередь, индуцирует экспрессию генов под составным промотором тетрациклинового элемента ответа (TRE). Индуцируемая Tet система экспрессии повышает уровень экспрессии белка. pHluorin позволяет в режиме реального времени отслеживать рециркуляцию SV, зависящую от активности, в то время как HaloTag визуализирует SV, переработанные в течение определенного периода, путем ковалентной маркировки слитого белка (рис. 2A). Хотя оба метода имеют уникальные преимущества, в этой статье мы сосредоточимся на визуализации pHluorin.

1. В стеклянную чашку Петри налить 25 мл внеклеточного раствора, содержащего 0,02% трикана.
2. Для вскрытия перенесите личинку в чашку Петри. Снимите кожу личинки с помощью двух тонких щипцов. Используйте первые щипцы, чтобы удержать личинку на месте, и сожмите кожу на тыльной стороне плавательного пузыря другими щипцами (рисунок 3A).
3. Удалите плавательный пузырь, внутренние органы и голову с помощью скальпелей. Кожа с обеих сторон тела рыбы часто может быть удалена одновременно, см. Видео 1.

4. Помещение образца в камеру визуализации и введение стимулирующего электрода

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку рН просвета в покое у SV ниже pH 6,0, флуоресценция pHluorin в NMJ у живых рыб едва заметна (Рисунок 2B). Однако, когда просвет SV был подщелачен, наблюдалась ограниченная локализация VpHalo до NMJ (рис. 2C). Примечательно, что конфокальное изображение z-стека NMJ показало, что они не перекрывают друг друга в плоскости xy, за исключением краев сегментов тела (рис. 2C). Основываясь на этом наблюдении, мы предположили, что эпифлуоресцентный микроскоп применим для визуализации VpHalo в реальном времени у личинок рыбок данио, что было подтверждено, как подробно описано в следующем протоколе.

1. Перенесите образец в камеру для визуализации (рис. 3B) с помощью стеклянной пастеровской пипетки с отполированным огнем наконечником. Механически зафиксируйте образец капроновой нитью, приклеенной к С-образной платиновой проволоке так, чтобы она была ориентирована под углом, примерно параллельным стимулирующему электроду. (Рисунок 3В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: С-образная платиновая проволока с нейлоновой нитью была изготовлена в лаборатории. Примерно 1 см платиновой проволоки диаметром 0,5 мм формировали в С-образную форму и постукивали молотком для ее расплющивания. Капроновую нить можно получить из предметов быта. Мы приклеили капроновую нить, которую мы получили, разобрав кухонную сушилку, доступную в продуктовом магазине. Подобное устройство фиксации обычно используется в эксперименте²⁸ со срезом мозга.
2. Непрерывно перфузируйте образец внеклеточным раствором, содержащим 3 мкМ D-TBC со скоростью приблизительно 1,0 мл/мин, используя систему перфузии с гравитационным потоком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется контролировать температуру в камере с помощью встроенного нагревателя раствора.
3. Введите электрод стимуляции в спинной мозг. Держите электрод, приготовленный из пипетки из тета-стекла в шаге 2, на держателе пипетки, оснащенном моторизованным микроманипулятором. Вставьте электрод в образец так, чтобы кончик находился рядом со спинальными моторными нейронами, которые расположены на вентральной стороне спинного мозга и могут быть идентифицированы как TagRFP-положительные нейроны в этом образце (рис. 3D). Переместите электрод под косым углом от соседнего сегмента в целевое положение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Граница между сегментами тела плотная и труднопроницаемая, поэтому необходимо медленно нажимать на электрод. Положение наконечника электрода очень важно. Если он удален от спинного мозга, он стимулирует соседние мышцы напрямую, что приводит к большому дрейфу изображения при последующей покадровой съемке.

5. Получение изображения

1. Выберите область изображения. На основе изображения флуоресценции TagRFP в реальном времени выберите область визуализации, которая включает более нескольких бутонов и исключает те, которые находятся на границе сегмента тела (рис. 2C и рис. 4A). Выберите область в пределах одного и того же сегмента тела стимулирующего электрода, поскольку иннервация моторных нейронов ограничена в пределах одного сегмента тела^29,30. Переключите блок флуоресцентного фильтра на флуоресценцию GFP/pHluorin.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой экспериментальной установке pHluorin был визуализирован с фильтрами возбуждения 470/40 нм и эмиссионными фильтрами 510/20 нм. Изображение TagRFP проводилось с фильтрами возбуждения 555/20 нм и эмиссионными фильтрами 595/44 нм. Программное обеспечение Micro-Manager используется для одновременного управления получением изображения с помощью научной камеры cMOS и TTL-затвора светодиодного источника света. Для синхронизации получения изображений и электрической стимуляции Arduino используется в качестве цифрового устройства ввода-вывода. Еще один вариант, который не требует скрипта, — использовать Digidata и ее программное обеспечение от Molecular Devices.
2. Определите настройку программного обеспечения для получения изображений и цифрового устройства ввода-вывода, чтобы синхронизировать получение изображений и электрическую стимуляцию. Оптимизируйте экспозицию и интенсивность источника света для получения достаточно яркого изображения в режиме интервальной съемки 1 Гц без насыщения и введите время экспозиции в поле Экспозиция [мс] главного окна Micro-Manager.
3. Определите частоту стимуляции, количество потенциалов действия (AP) и время между началом получения изображения и доставкой стимуляции, закодировав их в скрипте Arduino. В зависимости от параметров определите количество полученных изображений, соответствующее общей длине получения изображения, и введите его в поле «Количество» окна «Многомерное получение» микроменеджера. Установите значение 1 с в поле Интервал, чтобы получить интервальную съемку с частотой 1 Гц. Для электрической стимуляции подайте импульсы постоянного напряжения продолжительностью 1 мс (70 мВ) через изолятор стимулов.
4. Выполнение получения изображений. Выполните команду дигитайзера и выполните получение изображения. Убедитесь в отсутствии недопустимого дрейфа изображения и в том, что можно наблюдать реакцию pHluorin. В противном случае положение электродов будет неправильным. Вернитесь к шагу 4.2.
   Повреждение тканей, которое потенциально может повлиять на реакцию pHluorin, может быть легко идентифицировано с помощью DIC-изображения мышечных волокон. Если при отсутствии такого повреждения не наблюдается реакции на пХлуорин, расположение электродов может быть неправильным. Это можно определить как большой дрейф изображения, потому что неправильное расположение электродов вызывает сокращение мышц, как описано в шаге 4.2. Другая проблема, которая иногда приводит к невозможности вызвать реакцию pHluorin, — это попадание воздуха в капилляр тета-стекла, что приводит к электрической изоляции электрода. Сокращение мышц из-за неправильного расположения электродов приводит к смещению изображения по оси Z, которое не может быть скорректировано при последующем анализе изображений (см. шаг 6.5). Поэтому рекомендуется выявлять данные с большими дрейфами изображения во время получения изображений и исключать их.
5. В зависимости от цели эксперимента изменяйте интенсивность стимуляции (т.е. частоту и количество импульсов) и/или температуру. Сохраните покадровые изображения в виде стопки временных рядов изображений в формате TIFF. Смотрите видео 2.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Fiji для выполнения следующей обработки и анализа изображений. Используйте Microsoft Excel или аналогичное программное обеспечение для работы с электронными таблицами для расчета результатов измерений. Используйте Igor Pro для выполнения подгонки кривой по полученному результату.

1. Создайте разностное изображение, которое выделяет активные синапсы, как описано ниже.
   1. Откройте стек изображений временных рядов на Фиджи, выбрав «Файл» > «Открыть». Если отображаемые изображения тусклые, выберите Изображение >Настроить >Яркость/Контрастность >Авто. Не нажимайте кнопку «Применить», так как это приведет к изменению интенсивности сигнала, что сделает дальнейший анализ невозможным. Выберите «Анализ» > «Задать масштаб » и введите коэффициент калибровки, определенный в условиях изображения.
   2. Создайте стопку из пяти изображений, сделанных в период до стимулирования, выбрав «Изображение > Дублировать » и введя соответствующее число, обозначающее диапазон последовательности изображений (например, 11–15 для эксперимента с периодом до стимуляции 15 с).
   3. Выберите «Изображение > стеки > проекте Z» и выберите «Средняя интенсивность» в раскрывающемся меню «Тип проекции». Нажмите OK, чтобы создать репрезентативное изображение периода, предшествующего стимулированию (рисунок 4B). Процесс усреднения важен для уменьшения влияния колебаний сигнала.
   4. Создайте усредненное изображение периода после стимулирования, используя аналогичную обработку (рисунок 4B). Продублируйте стопку из пяти изображений сразу после окончания стимуляции (например, 26-30-е изображение для эксперимента с 15 с до стимуляции и 10 с для периода стимуляции). Выберите «Калькулятор обработки > изображений» и установите усредненное изображение до стимула и усредненное изображение после стимула как Изображение 1 и Изображение 2 в раскрывающихся меню соответственно.
   5. Выберите «Вычесть » в раскрывающемся меню «Операция» и нажмите OK , чтобы создать разностное изображение, выделяющее активные синапсы (рис. 4B).
2. Определите области интереса (ROI) для анализа.
   1. Выберите «Правка» > «Выделение» > Укажите и создайте круговую ROI диаметром 7 мкм на изображении разницы, созданном на шаге 6.1. Поместите ROI на выделенный активный синапс и нажмите T, чтобы добавить ROI в Менеджере ROI. В репрезентативном результате, показанном на рисунке 4C-D, вокруг бутонов было расположено 6 ROI.
   2. Разместите еще 5 ROI того же размера в регионах, где не наблюдается увеличения сигнала. Используйте их среднюю флуоресценцию в качестве фонового сигнала на следующем шаге. Сохраните ROI, выбрав Еще >Сохранить » в меню Диспетчер окупаемости инвестиций.
3. Измерьте интенсивность сигнала и рассчитайте существенное изменение флуоресценции.
   1. Выберите исходный стек временных рядов и перенесите ROI, сохраненные на шаге 6.2, в стек. Выберите Анализ > Задать измерения и установите только флажок Среднее значение серого. Измерьте среднюю интенсивность флуоресценции в ROI за все временные точки, выбрав «Больше > Мультимер» в меню «Менеджер ROI».
   2. Скопируйте все значения в окне «Результаты» и вставьте их в программу для работы с электронными таблицами. Рассчитайте средний фоновый сигнал из 5 фоновых ROI и вычтите его из каждого синаптического ROI, который обеспечивает существенное изменение флуоресценции в каждом бутоне (рис. 4D). Усредняем все данные с одного представления (в данном случае 6 бутонов), считая n = 1 эксперимент. На рисунке 4E каждая трасса, полученная путем усреднения, представлена как F/F₀ путем деления значения во всех временных точках на среднее значение в течение начального базового периода.
4. Оцените постоянную времени затухания флуоресценции (тау) с помощью аппроксимации кривой.
   1. Откройте новую таблицу данных в Igor Pro, выбрав «Окно» > «Новая таблица». Скопируйте данные временной точки и F/F₀ из таблицы и вставьте их в таблицу в другую строку. Выберите «Окно» > «Новый график», выберите данные F/F₀ как Y Wave и данные временных точек как X Wave, и нажмите Do It , чтобы создать график.
   2. Выберите «Окно» > «Показать информацию» и определите диапазон данных для анализа, поместив один курсор на пик сигнала, а другой — на конец трассы. Выберите Анализ > Аппроксимация кривой» и выберите exp_XOffset в раскрывающемся меню Функция и соответствующие волны X и Y в раскрывающемся меню Волна.
   3. Щелкните Параметры данных и нажмите кнопку Курсоры, чтобы задать диапазон подгонки кривой. Нажмите «Коэффициенты», введите 1 для Y0 и нажмите «Выполнить». Аппроксимация кривой с помощью этой процедуры дает значение тау, представляющее скорость распада флуоресценции, которая отражает скорость эндоцитоза SV и повторного закисления.
5. Выполните ручную коррекцию дрейфа (необязательно), как описано ниже.
   1. Если в период получения изображения происходит смещение изображения и выбранное пятно выходит за пределы ROI диаметром 7 мкм, запустите плагин Manual Drift Correction. Откройте стек изображений временных рядов на Фиджи, выбрав Файл > Открыть. Выберите инструмент «Точка », щелкнув по панели инструментов «Точка».
   2. Найдите самый яркий бутон в качестве ориентира и поставьте точку в его центре. Нажмите T, чтобы добавить точку в менеджер ROI. Повторите этот процесс для всей последовательности изображений. Отобразите первое изображение и выберите Плагины > Регистрация > Ручная коррекция дрейфа. Сохраните исправленный стек серий изображений в виде нового файла и используйте его для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя дрейф по оси X-Y можно исправить, чрезмерный дрейф по оси Z не может быть исправлен с помощью этого метода.

Результаты

Если препарированный образец подготовлен без серьезного повреждения тканей и стимулирующий электрод правильно введен в спинной мозг, то с помощью высокочастотной электрической стимуляции можно вызвать устойчивый ответ pHluorin (рис. 4D, E). Фонов...

Обсуждение

Личинки данио-рерио NMJ являются новой модельной системой для изучения синаптической физиологии и патологии^26,31. Трансгенная рыбка данио-рерио, экспрессирующая SpH нейрон-специфичным образом, уже была получена и использована для анализа ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x water immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion system	ALA	VCPlus-4G
5x objective	Olympus	NPLN5X
Custum made imaging chamber	Physiotech	custum made	A black acrylic plate (10.7 cm diameter, 3 mm thick) with a well (1 cm diameter at the bottom, 1.5 cm diameter at the top) holding approximately 0.5 ml of perfusate.
Digital I/O device	Arduino	Uno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrate	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJ	https://imagej.net/	imageJ 1.54f
Fine forceps	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipette	IWAKI	IK-PAS-5P	The tip should be trimmed and fire-polished until the final diameter is 1.5–2 mm.
Glass Petri dish	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
Inline solution heater	Warner Instruments	SF-28
LED illumination system	X-cyte	XYLIS
Methylen blue	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tube	Warner Instruments	64-1553
Motorized micromanipulator	Scientifica	PatchStar
Motorized movable sample plate	Scientifica	MMSP
Pipette holder	Narishige	H-13
Pipette puller	Narishige	PC-100
Platinum wire (φ0.1mm)	Nilaco	PT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)	Niaco	PT-351381
Scalpel	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS camera	Thorlabs	CC215MU
Sea salt	NAPQO	Instant Ocean
Stereo microscope	Olympus	SZX7
Stimulus isolater	AMPI	ISO-FLEX
Suction tube	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Theta glass capillary	Sutter Instrument	BT-150-10
Tricaine (MS-222)	TCI	T0941
Upright microscope	Olympus	BX51WI