JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يجب تعصيب العضيات المعوية البشرية لتلخيص بنية ووظيفة الأمعاء البشرية الأصلية بشكل أفضل. هنا ، نقدم طريقة واحدة لدمج الجهاز العصبي المعوي في هذه البنيات.

Abstract

يشكل تعقيد البنية الخلوية المعوية ووظيفتها تحديات كبيرة لإنشاء الأمعاء الدقيقة المعدلة بيولوجيا. تم الإبلاغ سابقا عن تقنيات توليد العضيات المعوية البشرية (HIOs) التي تشبه الأمعاء الدقيقة البشرية. تحتوي HIOs على الظهارة واللحمة المتوسطة ولكنها تفتقر إلى المكونات الهامة الأخرى للأمعاء الوظيفية مثل الجهاز العصبي المعوي (ENS) والخلايا المناعية والأوعية الدموية والميكروبيوم. نشرت مجموعتان بحثيتان مستقلتان طرقا مميزة لتعصيب HIOs باستخدام ENS. نناقش هنا طريقة فريدة لدمج ENS في الأمعاء الدقيقة المهندسة بيولوجيا المشتقة من HIO ، والتي تستخدم مكونات هذه التقارير السابقة لتحسين هوية الخلية السلفية بالإضافة إلى توقيت النمو.

يتم تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) لتوليد HIOs وخلايا القمة العصبية المعوية (ENCCs) بشكل مستقل عن طريق التنظيم الزمني لعلامات التمايز على مدى عدة أيام وفقا للبروتوكولات المنشورة. بمجرد أن تصل HIOs إلى المرحلة الكروية في منتصف المعاء الخلفي (اليوم 8 تقريبا) ، يتم فصل كرويات ENCC في اليوم 15-21 ، ويتم زراعتها بشكل مشترك مع HIOs ، ويتم تعليقها داخل قطرات مصفوفة غشاء القاعدي ثلاثية الأبعاد (3D). يتم الحفاظ على الثقافات المشتركة ل HIO + ENCC في المختبر لمدة 28-40 يوما قبل الزرع في الفئران التي تعاني من نقص المناعة البالغة من العمر >9 أسابيع لمزيد من التطور والنضج. يمكن حصاد HIOs المزروعة (tHIOs) مع ENS بعد 4-20 أسبوعا. تدمج هذه الطريقة عناصر من تقنيتين تم نشرهما مسبقا من خلال استخدام ENCCs التي تم إنشاؤها من hPSCs وزراعتها المشتركة مع HIOs في مرحلة مبكرة من التطوير لزيادة التعرض لإشارات النمو المبكرة التي من المحتمل أن تساهم في تكوين مورفولوجيا معوية أكثر نضجا.

Introduction

الأمعاء الدقيقة البشرية هي عضو معقد متعدد الطبقات يقوم بالعديد من الوظائف الأساسية مثل الهضم وامتصاص العناصر الغذائية وتنظيم السوائل ووظيفة الحاجز المناعي والحركة. تتميز العديد من الأمراض السريرية ، مثل متلازمة الأمعاء القصيرة أو اعتلال الأمعاء أو اضطرابات الحركة ، بانخفاض حاد في كتلة الأمعاء أو اضطرابات في علم وظائف الأعضاء الطبيعي مما يؤدي إلى مراضة ووفيات كبيرة1،2،3،4. غالبا ما تشمل خيارات العلاج الحالية جراحة لإزالة الأمعاء المختلة على حساب انخفاض طول الأمعاء ، وبالتالي القدرة الوظيفية للأمعاءالمتبقية 5. هناك حاجة للعلاجات التجديدية ذات الطابع المضاف ، وزيادة قدرة الأمعاء الوظيفية واستعادة وظيفة الأمعاء بطرق لا تستطيع النماذج العلاجية الحالية تحقيقها.

تعد الأمعاء الدقيقة المعدلة بيولوجيا حلا واعدا لهذه التحديات. العضيات المعوية البشرية (HIOs) المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) هي مادة أولية للأمعاء الدقيقة المعدلة بيولوجيا. في عام 2011 ، Spence et al. أبلغ لأول مرة عن الإنشاء الناجح ل HIOs الحديثة من خطوط hPSC ، بما في ذلك كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H1 و H9 (hESC) وخطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSC)6،7. تضمن بروتوكولهم سلسلة من الحضانات الموقوتة بعناية مع عوامل نمو محددة لتقليد نمو الأمعاء البشرية للجنين. Activin A ، جزيء إشارات TGFβ ، يدفع تمايز hPSC نحو مصير الأديم الباطن متبوعا بالزخرفة الخلفية الموجهة باستخدام Wnt / FGF. في ظل هذه الظروف ، تنظم hPSCs ذاتيا لتشكيل كرويات الأمعاء تحتوي على ظهارة مستقطبة ولحمة متوسطة. تسمح الثقافة ثلاثية الأبعاد داخل مصفوفة غشاء القاعدية بتطوير إضافي ينتج عنه عضويات ذات تجويف داخلي ، وتحريفات تشبه الزغابات من الظهارة ، ومنافذ خلايا سلف ذاتية التجديد داخل هياكل تشبه القبو.

في حين أن HIOs التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكول 2011 الأصلي هذا تشبه هيكليا الأمعاء الأصلية ، إلا أنها تفتقر إلى القدرة على توليد الخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية للجهاز العصبي المعوي (ENS). في عام 2017 ، وصفت ورقتان رئيسيتان طرقا متشابهة ولكنها متميزة لتعصيب HIOs. يمكن اشتقاق أسلاف ENS (خلايا القمة العصبية المعوية ، ENCCs) من hPSCs. في الثقافة ، تشكل ENCCs مجالات عصبية ثلاثية الأبعاد ، والتي يمكن أن تتمايز إلى خلايا عصبية معوية وخلايا دبقية في ظل ظروف مناسبة. قام Workman and Mahe et al. بتعديل بروتوكول موجود لاشتقاق ENCCs من hPSCs ومعالجتها بوسائط غنية ب FGF متبوعا بحمض الريتينويك لمدة يومين للتأخير وتعزيز المصير المبهم8،9. تم احتضان المجالات العصبية في اليوم السادس لمدة 4 أيام أخرى بدون التهاب المفاصل الروماتويدي ، ثم تم جمع الخلايا المهاجرة بعد الانفصال الأنزيمي. تم تجميع ما يقرب من 20,000-50,000 ENCCs مع كرويات الأمعاء الخلفية المبكرة ونمت هذه الأمعاء الكروية المصنفة في المختبر في مصفوفة غشاء أساسي ثلاثية الأبعاد واضحة لمدة 28 يوما حتى يتم النقش في الجسم الحي في كبسولة الكلى للفئران التي تعاني من نقص المناعة لمدة 6-10 أسابيع. أظهر HIO + ENS الناتج نضجا كبيرا للمكونات الظهارية واللحمة المتوسطة بالإضافة إلى الهياكل الدبقية العصبية المشابهة للعقد ، وإن كان ذلك مع كثافة جسم الخلية أقل من الأمعاء الأصلية ، وغياب بعض الأنواع الفرعية العصبية ذات الصلة سريريا (على سبيل المثال ، الخلايا العصبية الإيجابية CHAT في HIO + ENS بعد الزرع) ، والخصائص الشبيهة بالجنين بشكل عام.

في نفس العام ، Schlieve et al. نشر طريقة بديلة تتضمن مزيجا من 40-60 سليما ، اليوم 15 من المجالات العصبية ENCC مع HIOs أكثر نضجا في وقت الزرع في الجسم الحي في ثرب الفئران التي تعاني من نقص المناعة لمدة 3 أشهر دون زراعة مشتركة مسبقة في المختبر 10. يبدو أن تركيباتها ، المسماة ENCC-HIO-TESI (الأمعاء الدقيقة المصممة بالأنسجة) ، تحتوي على نمط ظاهري ENS أكثر نضجا من نمط Workman و Mahe's HIO + ENS مع تنوع أكبر في النوع الفرعي العصبي والوصلات المشبكية الظهارية العصبية غير المرئية في HIO + ENS. الأهم من ذلك ، أن ENCCs المستخدمة في تجارب Schlieve تم اشتقاقها من خلال طريقة مختلفة ، كما هو موضح سابقا من قبل Fattahi et al.11. باختصار ، خضعت hPSCs (كل من hESCs و hiPSCs) لتحريض القمة العصبية في الوسائط المخصبة ب FGF2. تم علاج هذه الخلايا أيضا بالتهاب المفاصل الروماتويدي لتحديد مصير المبهم المعوي ، ولكن لمدة 5 أيام (الأيام 6-11) ، بزيادة عن يومي Workman و Mahe (اليوم 4-5). في عام 2019 ، نشر Barber et al. نسخة منقحة من بروتوكول الفتحي بما في ذلك وصف أكثر شمولا لظروف الثقافة والانتقال إلى الوسائط القاعدية المحددة لتقليل التناقض وعكس تفضيلات زراعة الخلايا المتغيرة في ذلكالوقت 12.

تتضمن طريقتنا في تعصيب HIOs ، الموضحة بالتفصيل أدناه ، عناصر من بروتوكولات Workman / Mahe و Schlieve. في حين أن ENS في ENCC-HIO-TESI الخاص ب Schlieeve بدت أكثر نضجا مع تنوع أكبر للخلايا العصبية وتكامل الخلايا الدبقية العصبية ، نجحت كلتا الطريقتين في دمج ENS وظيفي في HIOs مع تغييرات مثبتة في التعبير النسخي المعدي المعوي. أدى HIO + ENS الخاص ب Workman و Mahe إلى زيادة التعبير عن العديد من الجينات المتعلقة بالخلايا الجذعية المعوية وتطور الخلايا الظهارية ، والتي لم يتم تغييرها في ENCC-HIO-TESI. أحد التفسيرات المحتملة لهذه الفروق هو النقاط الزمنية المختلفة عندما تم الجمع بين ENCCs و HIOs بين البروتوكولات. لاحظ مختبرنا أن الزراعة المشتركة المبكرة تؤدي إلى زيادة التعبير عن جينات متعددة تشارك في التمايز الظهاري واللحمة المتوسطة ، ويؤثر توقيت الزراعة المشتركة على تنوع الخلايا الظهارية (بيانات غير منشورة). من الممكن أن يوفر التعرض المبكر لسلائف ENS لتطوير HIOs والعكس صحيح وقتا للإشارة غير المحددة بعد والتي تعزز التنوع الظهاري وعمليات النمو المبكرة الأخرى.

Protocol

تم الحصول على خط H9 للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) من WiCell (ماديسون ، ويسكونسن) وتمت الموافقة على جميع التجارب التي تنطوي على hESCs من قبل لجنة UTHealth Houston Stem Research Research Researchs (SCRO) (البروتوكول #SCRO-23-01). بالنسبة لهذا البروتوكول ، تشير جميع الإشارات إلى الألواح أو الآبار المطلية إلى تلك المعدة باستخدام مصفوفة غشاء قاعدي ثلاثية الأبعاد مؤهلة من hESC.

1. تحضير ثقافة الخلايا

ملاحظة: يستخدم مختبرنا H9 hESCs ، ولكن تم استخدام العديد من خطوط hPSC بنجاح من قبل مختبرات أخرى لإنشاء HIOs و ENCCs ، بما في ذلك H9 hESCs9،10،12 ، و H1 hESCs9 ، وخط hESC UCSF412 ، وخطوط hiPSC متعددة مثل WTC1112 و WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f9 و WTC109،10 و WTC10 PHOX2B het (+ / Y14X) 9 ، و WTC10 PHOX2B فارغة (Y14X / Y14X) 9.

  1. قم بإعداد صفيحة مكونة من 6 آبار عن طريق طلاء كل بئر مرغوب فيه بمصفوفة غشاء قاعدية ثلاثية الأبعاد مخففة في وسط زراعة خلية مناسب (تم العثور على عامل التخفيف وتعليمات التحضير في ورقة بيانات المواد). قم بتغطية كل بئر مرغوب فيه ب 1 مل لكل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل أو بين عشية وضحاها لضبطها قبل خلايا الطلاء.
    ملاحظة: يمكن إكمال هذا البروتوكول بخلايا من بئر واحد فقط أو توسيع نطاقه حسب الحاجة. نوصي بطلاء ثلاثة آبار على الأقل للبدء في تسهيل المرور الإضافي وصيانة hPSCs غير المتمايزة.
    من المهم الحفاظ على مصفوفة الغشاء القاعدي باردة أثناء العمل حيث تبدأ معظم المصفوفات في البلمرة في درجة حرارة الغرفة. الآبار المطلية قابلة للاستخدام لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع عند تخزينها عند 37 درجة مئوية. يحفظ مع مخفف كاف لتغطية البئر بالكامل لمنع الطلاء من الجفاف.
  2. قم بإذابة hPSCs (من الناحية المثالية رقم مرور منخفض) عن طريق الدوران لفترة وجيزة في حمام ماء دافئ. تحت غطاء التدفق الصفحي ، أعد تعليق قارورة واحدة من الخلايا في 2 مل من وسائط الخلايا الجذعية (الجدول 1). قم بشفط المادة المخففة من بئر مطلي مسبقا في طبق مكون من 6 آبار مباشرة قبل خلايا الطلاء ، ثم انقل 2 مل بالكامل من الخلايا المعلقة إلى البئر المطلي. لصيانة hPSCs غير المتمايزة (يشار إليها باسم لوحات الصيانة) ، احتضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، وقم بتغيير الوسائط كل يومين باستخدام 2 مل من وسائط الخلايا الجذعية لكل بئر.
  3. قم بتمرير الخلايا عندما تصل إلى التقاء 70-80٪. استنشق الوسائط من جانب البئر دون إزعاج الخلايا. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا الجذعية بدرجة حرارة الغرفة إلى البئر وشفطه في غضون 1 دقيقة ، مع ترك طبقة رقيقة من السائل فوق الخلايا. احتضن الطبق لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد يتسبب الانتظار حتى تتجاوز الخلايا 80٪ من التقاء المرور في حدوث مشاكل في التمايز المبكر ، مما يقلل من العائد في الخطوات اللاحقة.
  4. أضف 1 مل لكل بئر من وسط الخلايا الجذعية الدافئة واضغط على جانب اللوحة لإخراج المستعمرات. قم بتعبئة وسائط الماصة برفق باستخدام ماصة دقيقة P1000 ذات طرف ماصة واسع الفم (انظر جدول المواد) لتفتيت المستعمرات مع تقليل تلف الخلايا.
    ملاحظة: عند تجربة تعليق الخلية ، يوصى بتفتيت كتل كبيرة من الخلايا مع السماح للمجموعات الأصغر بالبقاء سليمة. لا ينصح بالوصول إلى معلق أحادي الخلية ولكن بالأحرى استهداف عدد أقل من المستعمرات الأصغر المنتشرة بالتساوي في جميع أنحاء البئر.
  5. استنشق المادة المخففة من بئر مغلف مسبقا في طبق مكون من 6 آبار وأضف 2 مل من وسائط الخلايا الجذعية الدافئة. انقل الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى هذا البئر للحفاظ على مستعمرات hPSC ، وقم بتغيير الوسائط كل يومين باستخدام 2 مل من وسائط الخلايا الجذعية لكل بئر.
    ملاحظة: عادة ما ينقل مختبرنا أحجاما بين 50-150 ميكرولتر لتمكين مرور لوحات صيانة hPSC مرة واحدة في الأسبوع. قد يختلف هذا الحجم باختلاف خط hPSC المحدد ورقم المرور، وبالتالي قد يتطلب تعديلا. استخدم الخلايا المتبقية لبدء إنشاء ENCC (القسم 2) أو إنشاء HIO (القسم 3). يجب تمرير hPSCs المذابة حديثا مرتين على الأقل قبل التقدم إلى جيل ENCC أو توليد HIO.

2. جيل ENCC

ملاحظة: تتبع طريقتنا لتوليد ENCC عن كثب تلك التي وصفها مختبر Fattahi واستخدمها Schlieve et al.10. نستخدم نسخة معدلة قليلا من خيار البروتوكول B من خلال أقسام "تحريض القمة العصبية المعوية (ENC) (الأيام 0-12)" و "تكوين كروي ENCC (اليوم 12-15)" في Barber et al.10،12.

  1. قم بشفط المادة المخففة من بئر مغلفة مسبقا في طبق جديد مكون من 6 آبار وأضف 2 مل من وسائط الخلايا الجذعية الدافئة. انقل 850 ميكرولتر من تعليق خلية hPSC من الخطوة 1.5 إلى نفس البئر (عادة نسبة مرور 5: 6).
  2. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. قم بتغيير الوسائط كل يومين باستخدام 2 مل من وسائط الخلايا الجذعية لكل بئر حتى يصل التقاء إلى 60-80٪. بعد ذلك ، تكون اللوحة جاهزة لبدء تحريض ENC.
  3. تحريض ENC
    1. اليوم 0. استنشق الوسائط من جانب البئر وأضف 2 مل من وسائط الكوكتيل A الدافئة (الجدول 1). العودة إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة.
    2. اليوم 2. Aspirate Cocktail A Media من جانب البئر واستبدلها ب 2 مل من وسائط Cocktail B الدافئة (الجدول 1). العودة إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة.
    3. اليوم 4. قم بسحب وسائط كوكتيل B من جانب البئر واستبدلها ب 2 مل من وسائط كوكتيل B الطازجة والدافئة. العودة إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة.
    4. الأيام 6-12. قم بشفط وسائط كوكتيل B من جانب البئر واستبدلها ب 2 مل من وسائط Cocktail C الدافئة (الجدول 1). ارجع إلى الحاضنة واستبدل الوسائط ب 2 مل من كوكتيل C الطازج والدافئ كل 48 ساعة حتى الانتهاء من تحريض ENC في اليوم 12.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تأكيد سلالات ENC عن طريق تحليل التعبير الجيني كما هو موضح بواسطة Barber et al.12.
  4. تشكيل كروي ENCC
    1. اليوم 13. وسائط Aspirate Cocktail C من جانب البئر. أضف 1 مل من كاشف انفصال الخلية الأنزيمية الدافئ واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اضغط على جانب اللوحة لإخراج الخلايا ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة واسع الفم. اغسل البئر ب 1 مل من وسائط خلية القمة العصبية (NCC) (الجدول 1) وأضف الغسالات إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة. شفط المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات برفق في 2 مل من وسائط NCC الدافئة.
    3. أضف الخلايا المعلقة إلى بئر جديد غير مطلي من صفيحة منخفضة الارتباط للغاية واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة.
    4. الأيام 15-21. راقب نمو كروي ENCC واستبدل الوسائط ب 2 مل من وسائط NCC الطازجة والدافئة كل 48 ساعة.
      ملاحظة: يجب إجراء تغييرات الوسائط بعناية لتجنب إتلاف أو شفط كرويات ENCC. من الأفضل تحقيق ذلك عن طريق تدوير اللوحة في حركة دائرية لتركيز الكرات في منتصف البئر ، ثم شفط الوسائط من حافة البئر.
      عادة ما يكتمل تكوين كروي ENCC بحلول اليوم 15 على الرغم من أنه من المقبول استزراعها حتى اليوم 21 لاستيعاب التوقيت المثالي للزراعة المشتركة مع الكرات الكروية في منتصف المعاء الخلفي.

3. جيل HIO (المرحلة الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية)

ملاحظة: طريقتنا لتوليد HIO هي في الأساس نفس البروتوكول الأصلي الموصوف بالتفصيل بواسطة McCracken et al. وآخرين من مختبرات Spence and Wells6،7. تحدث العملية على مرحلتين: تحريض الأديم الباطن النهائي (DE) وتكوين كروي في منتصف المعاء الخلفي.

  1. التحضير لتوليد HIO
    1. قم بإعداد صفيحة 24 بئرا عن طريق طلاء كل بئر مرغوب فيه بمصفوفة غشاء قاعدية ثلاثية الأبعاد مخففة في وسط زراعة خلوي مناسب (تم العثور على عامل التخفيف وتعليمات التحضير في ورقة بيانات المواد). قم بتغطية كل بئر مرغوب فيه ب 500 ميكرولتر لكل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل أو طوال الليل لضبطه قبل خلايا الطلاء.
      ملاحظة: من المهم الحفاظ على مصفوفة الغشاء القاعدي باردة أثناء العمل حيث تبدأ معظم المصفوفات في البلمرة في درجة حرارة الغرفة. الآبار المطلية قابلة للاستخدام لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع عند تخزينها عند 37 درجة مئوية. يخزن مع كمية كافية من المخفف لتغطية البئر بالكامل لمنع الطلاء من الجفاف.
      خطط لطلاء 6 آبار من صفيحة 24 بئرا لكل بئر واحد من ألواح صيانة hPSC المكونة من 6 آبار الموضحة أعلاه. يمكن زيادة هذه النسبة حسب الرغبة.
    2. استنشق المخفف من جميع الآبار المطلية مسبقا في طبق مكون من 24 بئرا. إضافة وسائط كافية للخلايا الجذعية الدافئة إلى تعليق الخلية hPSC من الخطوة 1.5 وتوزيع 500 ميكرولتر في كل بئر (على سبيل المثال ، إذا ترك 850 ميكرولتر من معلق الخلية hPSC بعد تمرير لوحة صيانة hPSC ، فعندئذ ل 6 آبار من صفيحة 24 بئرا ، امزج 2,150 ميكرولتر من وسائط الخلايا الجذعية الدافئة مع 850 ميكرولتر من معلق الخلية hPSC من الخطوة 1.5 ، و 500 ميكرولتر موزعة في كل من 6 آبار).
      ملاحظة: نظرا لأننا عادة ما نمرر لوحات صيانة hPSC بأحجام تتراوح من 50 إلى 150 ميكرولتر ، فعادة ما يكون لدينا أحجام من 850-950 ميكرولتر متاحة لهذه الخطوة. وبالتالي ، فإن حجم hPSCs لكل بئر في الصفيحة المكونة من 24 بئرا يقترب من 150 ميكرولتر / بئر.
      بمجرد وضع الصفيحة المكونة من 24 بئرا المعدة حديثا في الحاضنة ، قم بتحريك اللوحة برفق ذهابا وإيابا (من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب) لتوزيع الخلايا بالتساوي قدر الإمكان عبر قاع البئر.
    3. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. قم بتغيير الوسائط كل يومين باستخدام 500 ميكرولتر من وسائط الخلايا الجذعية لكل بئر حتى يصل التقاء إلى 50-70٪. بعد ذلك ، تكون اللوحة جاهزة لبدء تحريض DE.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان ألا تصل الخلايا إلى التقاء >70٪ قبل تحريض DE ، حيث يؤثر التقاء أعلى سلبا على كثافة الأديم الباطن وتشكل الأمعاء الخلفية في المراحل اللاحقة. من الناحية المثالية ، تصل الخلايا إلى ما يقرب من 50-70٪ من التقاء بعد 24-48 ساعة بنسب المرور المحددة.
  2. DE الحث
    1. اليوم 1. بمجرد أن تصل hPSCs إلى التقاء 50-70٪ ، قم بشفط وسائط الخلايا الجذعية من كل بئر تماما واستبدلها ب 500 ميكرولتر من وسائط اليوم 1 DE الدافئة (الجدول 1) لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
    2. اليوم 2. استنشق اليوم 1 DE واستبدلها ب 500 ميكرولتر من وسائط اليوم 2 DE الدافئة (الجدول 1) لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
    3. اليوم 3. استنشق اليوم 2 DE واستبدلها ب 500 ميكرولتر من وسائط اليوم 3 DE الدافئة (الجدول 1) لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
  3. تكوين كروي منتصف الأمعاء الخلفية
    1. الأيام 4-8. استنشق الوسائط من كل بئر تماما واستبدلها ب 500 ميكرولتر من وسائط الأمعاء الوسطى الدافئة (MHGM ، الجدول 1) لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. كرر هذه الخطوة يوميا حتى اليوم 8 ، وفي ذلك الوقت تكون الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية جاهزة للجمع والزراعة المشتركة (القسم 4).

4. الثقافة المشتركة للكرويات في منتصف الأمعاء الخلفية مع ENCCs

ملاحظة: يتم توفير ملخص بياني لهذا القسم في الشكل 1.

  1. تحضير تعليق ENCC
    1. اجمع اليوم 15-21 من كرويات ENCC من الخطوة 2.4.4. عن طريق إزالة الوسائط بعناية من البئر ، وتجنب شفط الكرويات باستخدام طريقة الدوامة الموضحة في الملاحظة لتلك الخطوة.
    2. أضف 1 مل من كاشف انفصال الخلية الأنزيمية الدافئة إلى البئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. اضغط على جانب اللوحة لمواصلة فصل الكرات الكروية وقم بترتيبتيه باستخدام ماصة دقيقة P1000 ذات طرف واسع الفم عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل لتفتيت كتل الخلايا حتى يصبح الخليط متجانسا.
    4. انقل تعليق ENCC إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل البئر ب 1 مل من وسائط NCC الدافئة (انظر الجدول 1) لجمع أي خلايا متبقية وإضافتها إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
    5. جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة. شفط المادة الطافية بطرف ماصة معقمة.
    6. باستخدام طرف ماصة واسع الفم ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسائط NCC الدافئة. احسب تركيز تعليق ENCC باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلية.
  2. الجمع بين تعليق ENCC والكرويات في منتصف الأمعاء الخلفية
    1. اجمع الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية من جميع آبار صفيحة HIO باستخدام طرف ماصة واسع الفم وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    2. حدد عدد آبار الزراعة المشتركة التي سيتم استخدامها داخل صفيحة 24 بئرا. تهدف إلى صفيحة 10-30 من الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية و 50,000-100,000 ENCCs لكل بئر للزراعة المشتركة.
      ملاحظة: من الناحية العملية ، غالبا ما تكون هناك علاقة فردية بين عدد الآبار ذات الكرات الكروية السليمة والعدد النهائي للآبار التي ستكون مطلوبة للزراعة المشتركة. يمكن أيضا استخدام مقياس كثافة الدم لحساب تركيز الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية التي تم جمعها.
    3. أضف الحجم المحسوب لتعليق ENCC لتوصيل 50,000-100,000 ENCCs لكل بئر زراعة مشتركة مخطط لها إلى الأنبوب المخروطي مع الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية. قم بترتيتوري برفق باستخدام طرف ماصة واسع الفم لخلط الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية و ENCCs بشكل موحد.
    4. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة وشفط المادة الطافية بعناية بطرف ماصة معقمة. باستخدام طرف ماصة واسع الفم ، أعد تعليق حبيبات الخلية في حجم من المصفوفة الغشائية القاعدية الباردة والخالية من الفينول (الشفافة) والمخفضة بعامل النمو ، تساوي 30 ميكرولتر لكل بئر الزراعة المشتركة النهائية.
      ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات في مصفوفة الغشاء القاعدي الشفاف أثناء إعادة التعليق ، حيث يصعب إزالتها ، وستعيق التشريب المناسب للوسائط بواسطة المزارع المشتركة HIO + ENCC ، وستقلل من تصور الزراعة المشتركة HIO + ENCC أثناء نموها.
    5. إلى وسط كل بئر جاف ، قم بعمل ماصة قطرة 30 ميكرولتر من الأمعاء الكروية المعلقة في منتصف الأمعاء الخلفي + ENCCs في مصفوفة غشاء القاعدي الشفاف دون أي وسائط محيطة. بمجرد طلاء جميع القطرات في الآبار ، قم بتغطية اللوحة وقلبها. احتضان مقلوب عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تتيح هذه الخطوة الوقت للكبوتات الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية و ENCCs لتسقط بعيدا عن قاع اللوحة وتصبح معلقة أثناء بلمرة مصفوفة الغشاء القاعدي ثلاثية الأبعاد الواضحة.
  3. في المختبر الزراعة المشتركة HIO + ENS
    1. اليوم 0: بمجرد بلمرة مصفوفة الغشاء القاعدي الشفاف ، قم بتغطية كل قطرة في 500 ميكرولتر من وسائط HIO الدافئة اليوم 0-3 (انظر الجدول 1).
    2. اليوم 3: استنشق بعناية وسائط اليوم 0-3 HIO من جانب البئر ، دون إزعاج قطرة مصفوفة الغشاء القاعدي الشفافة. استبدل الوسائط ب 500 ميكرولتر من وسائط HIO الدافئة في اليوم 3-14 (انظر الجدول 1). أعد الطبق إلى الحاضنة. في هذه المرحلة ، قم بتغيير الوسائط كل 3-4 أيام.
    3. الأيام 7-14: استمر في استبدال وسائط اليوم 3-14 HIO حسب الحاجة كل 3-4 أيام ومراقبة النمو.
  4. تقسيم HIOs
    1. اليوم 14: افحص كل بئر بعناية تحت المجهر وقم بتقييم عدد HIO + ENS النامية في كل قطرة مصفوفة غشاء أساسي ثلاثية الأبعاد.
    2. قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل مع 30 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي الشفافة واحتفظ بها على الجليد.
    3. تحت غطاء التدفق الصفحي ، استخدم ملقطا دقيقا لإزالة قطرة مصفوفة الغشاء القاعدي ثلاثية الأبعاد الشفافة بعناية باستخدام HIO + ENS. قم بتمييز HIO + ENSالفردي برفق.
      ملاحظة: يمكن أن تكون العدسات الجراحية أو المجهر التشريحي مفيدة جدا في هذه المرحلة ولكنها ليست ضرورية تماما لأن الفتحات المرتفعة غالبا ما تكون مرئية بشكل كبير بالعين المجردة.
    4. ضع كل HIO + ENS معزولة في أحد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المحضرة التي تحتوي على 30 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي الشفافة باستخدام ملقط أو طرف ماصة واسع الفم.
      ملاحظة: لا تحتاج مصفوفة الغشاء القاعدي ثلاثية الأبعاد القديمة الواضحة إلى التسييل أو الذوبان في هذه المرحلة. تجنب تعطيل HIOs إن أمكن ، على الرغم من أنه إذا حدث ذلك ، فقد يظل ينمو خلال مراحل لاحقة.
    5. كرر الخطوة 4.2.5 للانقسام وإعادة طلاء HIO + ENS. بمجرد بلمرة قطرات الغشاء القاعدي ثلاثية الأبعاد الشفافة ، أضف 500 ميكرولتر من وسائط HIO الدافئة والطازجة في اليوم 3-14 إلى كل بئر واحتضانها طوال الليل.
  5. استمرت الزراعة المشتركة HIO + ENS
    1. اليوم 15: استنشق بعناية وسائط اليوم 3-14 HIO من جانب البئر. استبدل الوسائط بوسائط HIO دافئة من اليوم 15-28 500 ميكرولتر (انظر الجدول 1).
    2. اليوم 15-40: استمر في استبدال وسائط HIO في اليوم 15-28 حسب الحاجة كل 3-4 أيام ومراقبة نمو HIO + ENCC.

النتائج

ينظم ENS الوظائف الأساسية للأمعاء الدقيقة الناضجة ، بما في ذلك التمعج ، وامتصاص العناصر الغذائية ، ونقل السوائل ، وصيانة الحاجز الظهاري. وبالتالي ، فإن الهدف من تعصيب HIOs هو تزويد هذه التركيبات بالعناصر اللازمة لتطوير وظائف أكثر نضجا وأعلى مستوى. تحقيقا لهذه الغاية ، يدرس ...

Discussion

تم استخدام HIOs كنظام نموذجي لنمو الأمعاء البشرية منذ أوائل عام 2010 وأصبحت أكثر تعقيدا بشكل متزايد منذ ذلك الحين. أصبح من الممكن الآن تزويد هذه التركيبات ب ENS، مما يتيح فرصا جديدة في دراسة التطور الطبيعي التي يمكن تطبيقها لفهم وعلاج عدد من كيانات الجهاز الهضمي السريرية وعلا...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

شكرا للعديد من المتعاونين والموجهين لدينا ، بما في ذلك نوح شروير ومايكل هيلمراث وجيمس ويلز وفرانك فتاحي الذين سمحوا لنا بزيارة مختبراتهم وساعدونا في تحسين بروتوكولنا على مر السنين. نود أيضا أن نشكر كريس مايهيو وإيمي بيتستيك من مرفق الخلايا الجذعية متعددة القدرات ومركز الخلايا الجذعية والطب العضوي (CuSTOM) في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال على تزويد مختبرنا بالتدريب والتوجيه والمشورة في مجال الحقائق. تم تمويل هذا البحث من قبل جائزة منحة الجدوى / جائزة الجدوى التجريبية لمركز أمراض الجهاز الهضمي في مركز تكساس الطبي (الممولة جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK P30DK056338) (سبير) ، و NIDDK (NIH 1K08DK131326-01A1) (Speer) ، وجائزة الرجال المتميزين (Speer) ، وجائزة الانتقال من الجمعية الأمريكية لأمراض الجهاز الهضمي العصبي والحركة (ANMS) (Speer).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)ThermoFischer Scientific11140050
15 mL conical tubesThermo Scientific12565269
AccutaseSTEMCELL Technologies07920"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin AThermoFischer Scientific12587010For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum freeGibco17504044For HIO
Bright-Line HemacytometerHausser Scientific3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment MicroplatesFisher Scientific07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treatedVWR29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 wellVWR29442-042
Essential 6 MediaThermo FischerA1516401
Essential 8 MediaThermo FischerA2858501Alternative stem cell media, used for ENCC plates. 
Fine-tip forcepsDumont11223-20
Forma Steri-Cycle i160Thermo Scientific50145522
Gibco Advanced DMEM/F12ThermoFischer Scientific12634-010
Gibco HEPES 1 MThermoFischer Scientific15630-080
Gibco Neurobasal MediumThermoFischer Scientific21103-049
Glutagro, 200 mM, 100xCorning25-015-CI
GlutamaxThermoFischer Scientific35050061
H9 human ESCWicell International Stem Cell BankN/A
HyCloneTM FBS DefinedVWR16777-002
LabGard Biological Safety CabinetNuaireNu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-FreeCorning356231"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-FreeCorning354277"3D basement membrane matrix"
MicropipettesEppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)2231300008
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850"stem cell media"
Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance. 
N-2 Supplement (100x)Gibco17502048For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)Thermo FisherA1370701For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscopeNikonTS100
Noggin-conditioned mediaTexas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-coreN/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFischer Scientific15140-122
Recombinant Human Activin ACell Guidance SystemsGFH6-100
Recombinant Human BMP-4Fisher Scientific314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CFThermoFisher Scientific236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) ProteinThermoFischer Scientific233-FB-010
Recombinant Human FGF-4Peprotech100-31
ReLeSRSTEMCELL Technologies5872"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acidSIGMAR2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mLThermo ScientificAM12425
RPMI 1640 MediumThermoFischer Scientific11875093
R-Spondin conditioned mediaTexas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-coreN/A
SB 431542, Tocris BioscienceFisher Scientific16-141-0
Sorvall ST 16R CentrifugeThermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor TipsVWR89049-166
Stemolecule Chir99021 in SolutionStemgent04-0004-02
Sterile filter pipette tipsVWR (1000uL, 200uL, 10uL)76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XFStem Cell Technologies7180Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates. 

References

  1. Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Semin Pediatr Surg. 19 (1), 3-9 (2010).
  2. Spencer, A. U., et al. Pediatric short bowel syndrome: redefining predictors of success. Ann Surg. 242 (3), 403-409 (2005).
  3. Goulet, O., Pigneur, B., Charbit-Henrion, F. Congenital enteropathies involving defects in enterocyte structure or differentiation. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 56-57, 101784 (2022).
  4. Koglmeier, J., Lindley, K. J. Congenital diarrhoeas and enteropathies. Nutrients. 16 (17), 2971 (2024).
  5. Duggan, C. P., Jaksic, T. Pediatric intestinal failure. N Engl J Med. 377 (7), 666-675 (2017).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6 (12), 1920-1928 (2011).
  8. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  9. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23 (1), 49-59 (2017).
  10. Schlieve, C. R., et al. Neural crest cell implantation restores enteric nervous system function and alters the gastrointestinal transcriptome in human tissue-engineered small intestine. Stem Cell Rep. 9 (3), 883-896 (2017).
  11. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  12. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  13. Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Rep. 4 (6), 1140-1155 (2015).
  14. Boyle, M. A., et al. In vivo transplantation of human intestinal organoids enhances select tight junction gene expression. J Surg Res. 259, 500-508 (2021).
  15. Finkbeiner, S. R., et al. Generation of tissue-engineered small intestine using embryonic stem cell-derived human intestinal organoids. Biol Open. 4 (11), 1462-1472 (2015).
  16. Mahe, M. M., Brown, N. E., Poling, H. M., Helmrath, M. A. In vivo model of small intestine. Methods Mol Biol. 1597, 229-245 (2017).
  17. McNeill, E. P., Gupta, V. S., Sequeira, D. J., Shroyer, N. F., Speer, A. L. Evaluation of murine host sex as a biological variable in transplanted human intestinal organoid development. Dig Dis Sci. 67 (12), 5511-5521 (2022).
  18. Singh, A., et al. Evaluation of transplantation sites for human intestinal organoids. PLoS One. 15 (8), e0237885 (2020).
  19. Watson, C. L., et al. An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells. Nat Med. 20 (11), 1310-1314 (2014).
  20. Cortez, A. R., et al. Transplantation of human intestinal organoids into the mouse mesentery: A more physiologic and anatomic engraftment site. Surgery. 164 (4), 643-650 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215 ENS HPSCs ENCCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved