עצבנות של אורגנואידים במעי האנושי

Summary

יש לעצב אורגנואידים במעי האנושי כדי לסכם טוב יותר את המבנה והתפקוד של המעי האנושי הילידי. כאן, אנו מציגים שיטה אחת לשילוב מערכת עצבים מעי במבנים אלה.

Abstract

המורכבות של הציטו-ארכיטקטורה והתפקוד של המעי מציבה אתגרים משמעותיים ליצירת המעי הדק המהונדס ביולוגית. טכניקות ליצירת אורגנואידים במעי אנושי (HIOs) הדומים למעי הדק האנושי דווחו בעבר. HIO מכילים אפיתל ומזנכימה אך חסרים מרכיבים קריטיים אחרים של המעי התפקודי כגון מערכת העצבים המעי (ENS), תאי חיסון, כלי דם ומיקרוביום. שתי קבוצות מחקר עצמאיות פרסמו שיטות שונות לעצבוב HIO עם ENS. כאן אנו דנים בשיטה ייחודית לשילוב ה-ENS במעי דק מהונדס ביולוגית שמקורו ב-HIO, המשתמשת ברכיבים של דוחות קודמים אלה כדי לייעל את זהות תאי האב כמו גם את תזמון ההתפתחות.

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מתמיינים ליצירת HIOs ותאי פסגה עצבית מעיים (ENCCs) באופן עצמאי על ידי ויסות זמני של סמני התמיינות לאורך תקופה של מספר ימים לפי פרוטוקולים שפורסמו. ברגע ש-HIOs מגיעים לשלב הספרואיד של המעי האחורי האמצעי (בערך יום 8), ספרואידים של ENCC ביום 15-21 מנותקים, מתורבתים במשותף עם HIOs, ותלויים בתוך טיפות מטריצת ממברנת בסיס תלת מימדית (3D). תרביות משותפות של HIO + ENCC נשמרות במבחנה במשך 28-40 יום לפני ההשתלה בעכברים חסרי חיסון בני >9 שבועות להמשך התפתחות והתבגרות. ניתן לקצור HIO מושתלים (tHIOs) עם ENS 4-20 שבועות לאחר מכן. שיטה זו משלבת אלמנטים משתי טכניקות שפורסמו בעבר על ידי שימוש ב-ENCCs שנוצרו מ-hPSCs ותרבית משותפת שלהם עם HIO בשלב מוקדם של הפיתוח כדי למקסם את החשיפה לרמזים התפתחותיים מוקדמים שככל הנראה תורמים להיווצרות מורפולוגיה בוגרת יותר של המעיים.

Introduction

המעי הדק האנושי הוא איבר מורכב ורב-שכבתי המבצע פונקציות חיוניות רבות כגון עיכול, ספיגת חומרים מזינים, ויסות נוזלים, תפקוד מחסום חיסוני ותנועתיות. מחלות קליניות רבות, כגון תסמונת המעי הקצר, אנטרופתיה או הפרעות תנועתיות, מאופיינות בהפחתה קריטית של מסת המעי או שיבושים בפיזיולוגיה תקינה המובילים לתחלואה ותמותה משמעותיים 1,2,3,4. אפשרויות הטיפול הנוכחיות כוללות לרוב ניתוח להסרת המעי הלא מתפקד במחיר של ירידה באורך המעי וכתוצאה מכך, היכולת התפקודית של המעי^{הנותר 5}. יש צורך בטיפולים רגנרטיביים שהם תוספים באופיים, מגבירים את יכולת המעיים התפקודית ומשקמים את תפקוד המעיים בדרכים שפרדיגמות הטיפול הנוכחיות אינן מסוגלות להשיג.

מעי דק מהונדס ביולוגית הוא פתרון מבטיח לאתגרים אלה. אורגנואידים במעי אנושי (HIOs) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) הם חומר מוצא אחד למעי הדק המהונדס ביולוגית. בשנת 2011, ספנס ועמיתיו דיווחו לראשונה על יצירה מוצלחת של HIO מודרניים מקווי hPSC, כולל תאי גזע עובריים אנושיים H1 ו-H9 (hESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מרובים (hiPSC) קווים ^6,7. הפרוטוקול שלהם כלל סדרה מתוזמנת בקפידה של דגירות עם גורמי גדילה ספציפיים כדי לחקות את התפתחות המעיים של העובר האנושי. Activin A, מולקולת איתות TGFβ, מניע התמיינות hPSC לעבר גורל אנדודרמלי ואחריו דפוס אחורי מכוון עם Wnt/FGF. בתנאים אלה, hPSCs מתארגנים בעצמם ליצירת ספרואידים במעיים המכילים אפיתל מקוטב ומזנכימה. תרבית תלת מימדית בתוך מטריצת ממברנה בסיסית מאפשרת פיתוח נוסף וכתוצאה מכך אורגנואידים עם לומן פנימי, התפתחויות דמויות וילוס של אפיתל ונישות תאי אב המתחדשות מעצמן בתוך מבנים דמויי קריפטה.

בעוד ש-HIOs שנוצרו באמצעות פרוטוקול מקורי זה משנת 2011 דומים מבחינה מבנית למעי הטבעי, הם חסרים את היכולת ליצור את הנוירונים או הגליה של מערכת העצבים המעי (ENS). ב-2017, שני מאמרים מרכזיים תיארו שיטות דומות אך נפרדות לעצבנות HIOs. ניתן לגזור אבות ENS (תאי פסגה עצבית אנטרית, ENCCs) מ-hPSCs. בתרבית, ENCCs יוצרים נוירוספרות תלת מימדיות, שיכולות להתמיין לנוירונים מעיים וגליה בתנאים מתאימים. וורקמן ומאהה ואחרים שינו פרוטוקול קיים כדי להפיק ENCCs מ-hPSCs וטיפלו בהם במדיה מועשרת ב-FGF ואחריה חומצה רטינואית למשך יומיים לפוסטריוריזציה וקידום גורל הנרתיק ^8,9. נוירוספרות יום 6 הודגרו במשך 4 ימים נוספים ללא דלקת מפרקים מפרקים שגרונית, ולאחר מכן נאספו תאים נודדים לאחר ניתוק אנזימטי. כ-20,000-50,000 ENCCs הצטברו עם ספרואידים מוקדמים באמצע המעי האחורי וספרואידים אלה שזרעו ב-ENCC גודלו במבחנה במטריצת קרום בסיס תלת-ממדית שקופה למשך 28 ימים עד להשתלה in vivo לתוך קפסולת הכליה של עכברים חסרי חיסון למשך 6-10 שבועות. HIO + ENS שהתקבל הראה התבגרות משמעותית של רכיבי אפיתל ומזנכימליים כמו גם מבנים נוירוגליאליים הדומים לגרעיניה, אם כי עם צפיפות גוף תאים נמוכה יותר מאשר המעי הטבעי, היעדר תת-סוגים עצביים רלוונטיים קלינית (כלומר, נוירונים חיוביים ל-CHAT ב-HIO + ENS לאחר ההשתלה), ומאפיינים כלליים דמויי עובר.

באותה שנה, Schlieve et al. פרסמו שיטה חלופית הכוללת תערובת של 40-60 נוירוספרות ENCC שלמות ביום 15 עם HIO בוגרים יותר בזמן ההשתלה in vivo לתוך האומנטום של עכברים חסרי חיסון למשך 3 חודשים ללא תרבית משותפת קודמת במבחנה ¹⁰. נראה כי המבנים שלהם, הנקראים ENCC-HIO-TESI (מעי דק מהונדס רקמות), מכילים פנוטיפ ENS בוגר יותר מזה של HIO + ENS של וורקמן ומאהה עם מגוון גדול יותר של תת-סוגים עצביים וקשרים סינפטיים נוירו-אפיתליים שלא נראו ב-HIO + ENS. חשוב לציין, ה-ENCCs ששימשו בניסויים של שלייב נגזרו בשיטה שונה, כפי שתואר קודם לכן על ידי Fattahi et ^al.11. בקצרה, hPSCs (הן hESCs והן hiPSCs) עברו אינדוקציה של פסגה עצבית במדיה מועשרת ב-FGF2. תאים אלה טופלו גם בדלקת מפרקים שגרונית כדי לקבוע גורל נרתיקי אנטרי, אך במשך 5 ימים (ימים 6-11), עלייה מהיומיים של וורקמן ומאהה (יום 4-5). בשנת 2019, Barber et al. פרסמו גרסה מתוקנת של פרוטוקול Fattahi הכוללת תיאור מעמיק יותר של תנאי התרבית ומעבר למדיה בסיסית מוגדרת כדי להפחית את חוסר העקביות ולשקף את העדפות תרבית התאים המשתנות באותה תקופה¹².

השיטה שלנו לעצבנות HIOs, המתוארת בפירוט להלן, משלבת אלמנטים של פרוטוקולי Workman/Mahe ו-Schlieve. בעוד שה-ENS ב-ENCC-HIO-TESI של שלייב נראה בוגר יותר עם מגוון עצבי גדול יותר ואינטגרציה נוירוגליאלית, שתי השיטות שילבו בהצלחה ENS פונקציונלי ב-HIOs עם שינויים מוכחים בביטוי שעתוק במערכת העיכול. HIO + ENS של וורקמן ומאהה גרם לביטוי מוגבר של מספר גנים הקשורים לתאי גזע במעי ולהתפתחות תאי אפיתל, שלא השתנו ב-ENCC-HIO-TESI. הסבר אפשרי אחד להבדלים אלה הוא נקודות הזמן השונות שבהן ENCCs ו-HIO שולבו בין הפרוטוקולים. המעבדה שלנו הבחינה כי קוקולטורה מוקדמת מביאה לביטוי מוגבר של גנים מרובים המעורבים בהתמיינות אפיתל ומזנכימלית, ותזמון הקוקולטורציה משפיע על מגוון תאי האפיתל (נתונים שלא פורסמו). ייתכן שחשיפה מוקדמת יותר של מבשרי ENS להתפתחות HIO ולהיפך מספקת זמן לדיבור צולב איתות שעדיין לא מוגדר המקדם גיוון אפיתל ותהליכים התפתחותיים מוקדמים אחרים.

Protocol

קו H9 של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) מקורו ב-WiCell (מדיסון, ויסקונסין) וכל הניסויים הכוללים hESCs אושרו על ידי ועדת הפיקוח על מחקר תאי הגזע של יוסטון (SCRO) של UTHealth Houston (פרוטוקול #SCRO-23-01). עבור פרוטוקול זה, כל ההתייחסויות לצלחות או בארות מצופות מתייחסות לאלה שהוכנו עם מטריצת ממברנת בסיס תלת מימדית מוסמכת hESC.

1. הכנת תרבית תאים

הערה: המעבדה שלנו משתמשת ב-H9 hESCs, אך מספר קווי hPSC שימשו בהצלחה על ידי מעבדות אחרות ליצירת HIO ו-ENCCs, כולל H9 hESCs ^9,10,12, H1 hESCs⁹, קו hESC UCSF4¹², וקווי hiPSC מרובים כגון WTC11¹², WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f⁹, WTC10 ^9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)⁹ ו-WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)⁹.

1. הכן צלחת של 6 בארות על ידי ציפוי כל באר רצויה במטריצת קרום מרתף תלת מימדית מדוללת במדיום תרבית תאים מתאים (גורם דילול והוראות הכנה נמצאים בגיליון נתוני החומר). מצפים כל באר רצויה ב-1 מ"ל לבאר ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות או לילה להתייצבות לפני תאי הציפוי.
   הערה: ניתן להשלים פרוטוקול זה עם תאים מבאר אחת בלבד או להגדיל אותו לפי הצורך. אנו ממליצים לצפות לפחות שלוש בארות כדי להתחיל כדי להקל על מעבר ותחזוקה נוספים של hPSCs לא מובחנים.
   חשוב לשמור על מטריצת קרום המרתף קרה בזמן העבודה מכיוון שרוב המטריצות מתחילות להתפלמר בטמפרטורת החדר. בארות מצופות ניתנות לשימוש עד 2-3 שבועות כאשר הן מאוחסנות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אחסן עם מדלל מתאים כדי לכסות את כל הבאר כדי למנוע את התייבשות הציפוי.
2. הפשירו את ה-hPSCs (באופן אידיאלי מספר מעבר נמוך) על ידי סיבוב קצר באמבט מים חמים. מתחת למכסה זרימה למינרית, השעו בקבוקון אחד של תאים ב-2 מ"ל של מדיה של תאי גזע (טבלה 1). שאפו את המדלל מבאר אחת שצופה בעבר בצלחת של 6 בארות מיד לפני הציפוי ואז העבירו את כל 2 מ"ל התאים התלויים לבאר המצופה. לתחזוקה של hPSCs לא מובחנים (המכונים לוחות תחזוקה), דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, והחליפו את המדיה כל יומיים עם 2 מ"ל של מדיה של תאי גזע לבאר.
3. עוברים את התאים כשהם מגיעים למפגש של 70-80%. שאפו את המדיה מצד הבאר מבלי להפריע לתאים. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאי גזע בטמפרטורת החדר לבאר ושאף אותו תוך דקה אחת, והשאיר סרט דק של נוזל על התאים. דגרו את הצלחת למשך 5 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: המתנה עד שהתאים יעברו את המפגש של 80% למעבר עלולה לגרום לבעיות בהתמיינות מוקדמת, מה שיפחית את התשואה בשלבים הבאים.
4. הוסף 1 מ"ל לכל באר של מדיום תאי גזע חם והקש על צד הצלחת כדי לעקור מושבות. השתמש בעדינות במדיית פיפטה באמצעות מיקרו-פיפטה P1000 עם קצה פיפטה רחב פה (ראה טבלת החומרים) כדי לפרק את המושבות תוך מזעור נזק לתאים.
   הערה: בעת טריטורציה של תרחיף התאים, מומלץ לפרק גושי תאים גדולים אך לאפשר לאשכולות קטנים יותר להישאר שלמים. לא מומלץ להגיע לתרחיף חד תאי אלא לכוון למושבות קטנות וקטנות יותר המפוזרות באופן שווה ברחבי הבאר.
5. שאפו את המדלל מבאר שצופה בעבר בכלי של 6 בארות והוסיפו 2 מ"ל של מדיה חמה של תאי גזע. העבירו את הנפח הרצוי של תרחיף התאים לבאר זו כדי לשמור על מושבות hPSC, והחליפו את המדיה כל יומיים עם 2 מ"ל של מדיה של תאי גזע לבאר.
   הערה: המעבדה שלנו מעבירה בדרך כלל נפחים בין 50-150 מיקרוליטר כדי לאפשר מעבר של לוחות תחזוקה של hPSC פעם בשבוע. נפח זה עשוי להשתנות בהתאם לקו ה-hPSC הספציפי ולמספר המעבר ולכן עשוי לדרוש התאמה. השתמש בתאים הנותרים כדי להתחיל יצירת ENCC (סעיף 2) או יצירת HIO (סעיף 3). יש לעבור hPSCs שהופשרו לאחרונה לפחות פעמיים לפני ההתקדמות לדור ENCC או לדור HIO.

2. דור ENCC

הערה: השיטה שלנו ליצירת ENCC עוקבת מקרוב אחר זו שתוארה על ידי מעבדת Fattahi ושימשה את Schlieve et ^al.10. אנו משתמשים בגרסה שונה מעט של אפשרות הפרוטוקול B באמצעות הסעיפים "אינדוקציה של פסגה עצבית אנטרית (ENC) (ימים 0-12)" ו"היווצרות ספרואידים של ENCC (יום 12-15)" ב-Barber et ^al.10,12.

1. שאפו את המדלל מבאר שצופה בעבר בכלי חדש של 6 בארות והוסיפו 2 מ"ל של מדיה חמה של תאי גזע. העבר 850 מיקרוליטר של תרחיף תאי hPSC משלב 1.5 לאותה באר (בדרך כלל יחס מעבר של 5:6).
2. שמור על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. החלף את המדיה כל יומיים עם 2 מ"ל של מדיה של תאי גזע לכל באר עד שהמפגש מגיע ל-60-80%. לאחר מכן, הצלחת מוכנה להתחיל באינדוקציה של ENC.
3. אינדוקציה של ENC
   1. יום 0. שאפו מדיה מצד הבאר והוסיפו 2 מ"ל של קוקטייל A חם (טבלה 1). חזור לחממה למשך 48 שעות.
   2. יום 2. שאפו קוקטייל A מהצד של הבאר והחליפו ב-2 מ"ל של קוקטייל B חם (טבלה 1). חזור לחממה למשך 48 שעות.
   3. יום 4. שאפו את מדיית קוקטייל B מצד הבאר והחליפו ב-2 מ"ל של מדיה קוקטייל B טרייה וחמה. חזור לחממה למשך 48 שעות.
   4. ימים 6-12. שאפו את מדיית קוקטייל B מצד הבאר והחליפו ב-2 מ"ל של מדיה קוקטייל C חמה (טבלה 1). חזור לחממה והחלף את המדיה ב-2 מ"ל קוקטייל C טרי וחם כל 48 שעות עד להשלמת השראת ENC ביום ה-12.
      הערה: בשלב זה, שושלות ENC עשויות להיות מאושרות על ידי ניתוח ביטוי גנים כפי שמתואר על ידי Barber et ^al.12.
4. היווצרות ספרואידים ENCC
   1. יום 13. שאפו מדיה קוקטייל C מצד הבאר. הוסף 1 מ"ל של מגיב ניתוק תאים אנזימטי חם ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הקש על צד הצלחת כדי לעקור תאים ולהעביר את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה רחב פה. שטפו את הבאר עם 1 מ"ל של מדיה של Neural Crest Cell (NCC) (טבלה 1) והוסיפו את השטיפות לצינור החרוטי של 15 מ"ל.
   2. צנטריפוגה את מתלה התאים בצינור החרוטי של 15 מ"ל ב -300 × גרם למשך דקה אחת. שאפו את הסופרנטנט. השהה בעדינות את הגלולה ב-2 מ"ל של מדיה NCC חמה.
   3. הוסף את התאים המרחפים לבאר חדשה ולא מצופה של צלחת קשירה נמוכה במיוחד ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 48 שעות.
   4. ימים 15-21. נטר את צמיחת הכדורים של ENCC והחלף את המדיה ב-2 מ"ל של מדיית NCC טרייה וחמה כל 48 שעות.
      הערה: יש לבצע שינויי מדיה בזהירות כדי למנוע נזק או שאיבת ספרואידים של ENCC. הדבר מושג בצורה הטובה ביותר על ידי סיבוב הצלחת בתנועה סיבובית כדי למקד את הכדורים באמצע הבאר, ולאחר מכן שאיבת המדיה מקצה הבאר.
      היווצרות הספרואידים של ENCC מסתיימת בדרך כלל עד היום ה-15, אם כי מקובל לתרבית אותם עד היום ה-21 כדי להתאים לתזמון אידיאלי של קוקולטורה עם ספרואידים באמצע המעי האחורי.

3. יצירת HIO (שלב ספרואיד באמצע המעי האחורי)

הערה: השיטה שלנו ליצירת HIO זהה ביסודה לפרוטוקול המקורי שתואר בפירוט על ידי McCracken et al. ואחרים ממעבדות Spence and Wells ^6,7. התהליך מתרחש בשני שלבים: אינדוקציה אנדודרמית סופית (DE) והיווצרות ספרואידים באמצע המעי האחורי.

1. הכנה ליצירת HIO
   1. הכן צלחת של 24 בארות על ידי ציפוי כל באר רצויה במטריצת קרום מרתף תלת מימדית מדוללת במדיום תרבית תאים מתאים (גורם דילול והוראות הכנה נמצאים בגיליון נתוני החומר). מצפים כל באר רצויה ב-500 מיקרוליטר לבאר ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות או לילה להתייצבות לפני הציפוי של התאים.
      הערה: חשוב לשמור על מטריצת קרום המרתף קרה בזמן העבודה מכיוון שרוב המטריצות מתחילות להתפלמר בטמפרטורת החדר. בארות מצופות ניתנות לשימוש עד 2-3 שבועות כאשר הן מאוחסנות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אחסן עם מספיק מדלל כדי לכסות את כל הבאר כדי למנוע את התייבשות הציפוי.
      תכנן לצפות 6 בארות של צלחת 24 בארות לכל באר אחת מלוחות התחזוקה של hPSC עם 6 בארות שתוארו לעיל. ניתן להגדיל את היחס הזה כרצונך.
   2. שואבים את המדלל מכל הבארות שצופו בעבר בכלי של 24 בארות. הוסף מספיק מדיה של תאי גזע חמים לתרחיף תאי ה-hPSC משלב 1.5 והפיץ 500 מיקרוליטר לכל באר (למשל, אם נותרו 850 מיקרוליטר של תרחיף תאי hPSC לאחר מעבר לוחית התחזוקה של hPSC, אז עבור 6 בארות של צלחת של 24 בארות, ערבב 2,150 מיקרוליטר של מדיה של תאי גזע חמים עם 850 מיקרוליטר של תרחיף תאי hPSC משלב 1.5, ו-500 מיקרוליטר מופצים בכל אחת מ-6 הבארות).
      הערה: מכיוון שאנו בדרך כלל מעבירים לוחות תחזוקה hPSC בנפחים של 50-150 מיקרוליטר, בדרך כלל יש לנו נפחים של 850-950 מיקרוליטר זמינים לשלב זה. לפיכך, נפח ה-hPSCs לבאר בלוח של 24 בארות מתקרב ל-150 מיקרוליטר לבאר.
      לאחר שהצלחת החדשה שהוכנה בת 24 בארות הונחה בחממה, ערבבו בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה (מצפון לדרום וממזרח למערב) כדי לפזר את התאים באופן שווה ככל האפשר על פני קרקעית הבאר.
   3. שמור על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. החלף את המדיה כל יומיים עם 500 מיקרוליטר של מדיה של תאי גזע לכל באר עד שהמפגש מגיע ל-50-70%. לאחר מכן, הצלחת מוכנה להתחיל באינדוקציה DE.
      הערה: זה קריטי שהתאים לא יגיעו למפגש של >70% לפני השראת DE, שכן מפגש גבוה יותר משפיע לרעה על צפיפות האנדודרם ומורפוגנזה של המעי האחורי בשלבים הבאים. באופן אידיאלי, תאים מגיעים לכ- 50-70% מפגש לאחר 24-48 שעות ביחסי המעבר שצוינו.
2. אינדוקציה DE
   1. יום 1. לאחר ש-hPSCs הגיעו למפגש של 50-70%, שאפו את מדיית תאי הגזע מכל באר לחלוטין והחליפו ב-500 מיקרוליטר של מדיה חמה של יום 1 DE (טבלה 1) לכל באר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
   2. יום 2. שאפו את היום 1 DE והחליפו ב-500 מיקרוליטר של מדיה חמה של יום 2 DE (טבלה 1) לכל באר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
   3. יום 3. שאפו את ה-DE של היום השני והחליפו ב-500 מיקרוליטר של מדיה חמה של יום 3 DE (טבלה 1) לכל באר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
3. היווצרות ספרואידים באמצע המעי האחורי
   1. ימים 4-8. שאפו את המדיה מכל באר לחלוטין והחליפו ב-500 מיקרוליטר של מדיה חמה באמצע המעי האחורי (MHGM, טבלה 1) לבאר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. חזור על שלב זה מדי יום עד ליום 8, ואז הספרואידים באמצע המעי האחורי מוכנים לאיסוף וקוקולטורה (סעיף 4).

4. תרבית משותפת של ספרואידים באמצע המעי האחורי עם ENCCs

הערה: סיכום גרפי של סעיף זה מסופק באיור 1.

1. הכנת השעיית ENCC
   1. אסוף ספרואידים של יום 15-21 ENCC משלב 2.4.4. על ידי הוצאה זהירה של המדיה מהבאר, הימנעות משאיבת הספרואידים בשיטת המערבולת המתוארת בהערה לשלב זה.
   2. הוסף 1 מ"ל של מגיב ניתוק תאים אנזימטי חם לבאר ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   3. הקש על צד הצלחת כדי להמשיך להפריד את הספרואידים ולשלש עם מיקרופיפטה P1000 עם קצה פה רחב על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה כדי לפרק גושי תאים עד שהתערובת הומוגנית.
   4. העבר את מתלה ENCC לצינור חרוטי של 15 מ"ל. שטפו את הבאר עם 1 מ"ל של מדיה NCC חמה (ראה טבלה 1) כדי לאסוף את כל התאים שנותרו ולהוסיף זאת לצינור החרוטי של 15 מ"ל.
   5. צנטריפוגה את מתלה התאים ב -300 × גרם למשך דקה. שאפו את הסופרנטנט עם קצה פיפטה סטרילי.
   6. בעזרת קצה פיפטה רחב פה, השעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מדיה NCC חמה. חשב את ריכוז תרחיף ה- ENCC באמצעות המציטומטר או מונה תאים.
2. שילוב מתלי ENCC עם ספרואידים באמצע המעי האחורי
   1. אסוף את הספרואידים באמצע המעי האחורי מכל הבארות של צלחת HIO באמצעות קצה פיפטה רחב פה והעביר לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
   2. קבע את מספר בארות הקוקולטורה שישמשו בתוך צלחת של 24 בארות. שאפו לצלחת 10-30 ספרואידים באמצע המעי האחורי ו-50,000-100,000 ENCCs לבאר לצורך קוקולטורה.
      הערה: בפועל, לעתים קרובות יש קשר של אחד לאחד בין מספר הבארות עם ספרואידים בריאים לבין המספר הסופי של הבארות שיידרשו לקוקולטורה. ניתן להשתמש בהמוציטומטר גם כדי לחשב את ריכוז הספרואידים באמצע המעי האחורי שנאספו.
   3. הוסף את הנפח המחושב של תרחיף ENCC כדי לספק 50,000-100,000 ENCCs לכל באר קוקולטורה מתוכננת לצינור החרוטי עם הספרואידים באמצע המעי האחורי. יש למשוך בעדינות עם קצה פיפטה רחב פה כדי לערבב את הספרואידים באמצע המעי האחורי ואת ה-ENCCs באופן אחיד.
   4. צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך דקה אחת ושואבים בזהירות את הסופרנטנט עם קצה פיפטה סטרילי. בעזרת קצה פיפטה רחב פה, השעו מחדש את כדור התא בנפח של מטריצת קרום בסיסי קרה, נטולת פנולים (שקופה), מופחתת גורם גדילה, השווה ל-30 מיקרוליטר לכל באר קוקולטורה סופית.
      הערה: הימנע מהיווצרות בועות במטריצת קרום הבסיס השקוף במהלך ההשעיה מחדש, מכיוון שהן מאתגרות להסרה, יעכב את ההטמעה התקינה של המדיה על ידי תרבויות הקו-תרבויות HIO+ENCC, ויפחית את ההדמיה של תרבויות ה-HIO+ENCC ככל שהן גדלות.
   5. למרכז כל באר יבשה, פיפטה טיפה של 30 מיקרוליטר של ספרואידים תלויים באמצע המעי האחורי + ENCCs במטריצת קרום מרתף שקופה ללא כל מדיה מסביב. לאחר שכל הטיפות מצופות בבארות, מכסים והופכים את הצלחת. דגירה הפוכה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 30 דקות.
      הערה: שלב זה מאפשר זמן לספרואידים ול-ENCCs באמצע המעי האחורי ליפול מתחתית הצלחת ולהיות תלויים במהלך פילמור של מטריצת קרום הבסיס התלת-ממדית השקופה.
3. במבחנה קוקולטורה HIO+ENS
   1. יום 0: לאחר שמטריצת ממברנת הבסיס השקופה התפלמרה, כסו כל טיפה ב-500 מיקרוליטר של מדיה חמה של יום 0-3 HIO (ראה טבלה 1).
   2. יום 3: שאפו בזהירות את אמצעי ה-HIO של יום 0-3 מצד הבאר, מבלי להפריע לטיפה השקופה של מטריצת קרום המרתף. החלף את המדיה ב-500 מיקרוליטר של מדיה HIO חמה של יום 3-14 (ראה טבלה 1). החזירו את הצלחת לחממה. בשלב זה, החלף את המדיה כל 3-4 ימים.
   3. ימים 7-14: המשך להחליף מדיה HIO ביום 3-14 לפי הצורך כל 3-4 ימים ועקוב אחר הגידול.
4. פיצול HIO
   1. יום 14: בחנו כל באר בקפידה תחת מיקרוסקופ והעריכו כמה HIO + ENS מתפתחים נמצאים בכל טיפת מטריצת קרום מרתף תלת מימדית שקופה.
   2. הכן צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל עם 30 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף שקופה ושמור אותם על קרח.
   3. מתחת למכסה זרימה למינר, השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר בזהירות את טיפת מטריצת קרום הבסיס התלת-ממדית השקופה עם ה-HIO+ES התלוי. הקניטו בעדינות את ה-HIO+ENS.
      הערה: זכוכית מגדלת כירורגית או מיקרוסקופ מנתח יכולים להיות מועילים מאוד בשלב זה אך אינם נחוצים לחלוטין מכיוון ש-HIO נראים לעתים קרובות באופן גס לעין בלתי.
   4. הנח כל HIO + ENS מבודד לתוך אחד מצינורות המיקרו-צנטריפוגה המוכנים המכילים 30 מיקרוליטר של מטריצת קרום בסיס שקופה באמצעות מלקחיים או קצה פיפטה רחב פה.
      הערה: אין צורך להנזיל או להמיס מטריצת קרום מרתף תלת מימדית שקופה בשלב זה. הימנע מהפרעה ל-HIO במידת האפשר, אם כי אם זה קורה הוא עדיין עלול לגדול בשלבים מאוחרים יותר.
   5. חזור על שלב 4.2.5 עבור ה-HIO+ENS. לאחר שטיפות קרום הבסיס התלת-ממדיות השקופות עוברות פולימר, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה HIO חמה וטרייה ליום 3-14 לכל באר ודגירה למשך הלילה.
5. המשך התרבות המשותפת של HIO+ENS
   1. יום 15: שאפו בזהירות את אמצעי התקשורת של יום 3-14 מהצד של הבאר. החלף את המדיה במדיה חמה של 500 מיקרוליטר ליום 15-28 HIO (ראה טבלה 1).
   2. יום 15-40: המשך להחליף מדיה HIO ביום 15-28 לפי הצורך כל 3-4 ימים ולעקוב אחר צמיחת HIO + ENCC.

תוצאות

מערכת העצבים הלאומית מווסתת את התפקודים החיוניים של המעי הדק הבוגר, כולל פריסטלטיקה, ספיגת חומרים מזינים, הובלת נוזלים ותחזוקת מחסום האפיתל. לפיכך, המטרה של עצבנות HIOs היא לספק למבנים אלה את האלמנטים הדרושים לפיתוח פונקציונליות בוגרת יותר ברמה גבוהה יותר. לשם כך, המעבדה ש...

Discussion

HIOs שימשו כמערכת מודל להתפתחות המעיים האנושיים מאז תחילת שנות ה-2010 והפכו מורכבים יותר ויותר מאז. כעת ניתן לספק למבנים אלה ENS, המאפשר הזדמנויות חדשות בחקר התפתחות תקינה שניתן ליישם להבנה וטיפול טוב יותר במספר ישויות קליניות במערכת העיכול.

השתלת <...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)	ThermoFischer Scientific	11140050
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	12565269
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	ThermoFischer Scientific	12587010	For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	17504044	For HIO
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific	3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated	VWR	29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well	VWR	29442-042
Essential 6 Media	Thermo Fischer	A1516401
Essential 8 Media	Thermo Fischer	A2858501	Alternative stem cell media, used for ENCC plates.
Fine-tip forceps	Dumont	11223-20
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific	50145522
Gibco Advanced DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010
Gibco HEPES 1 M	ThermoFischer Scientific	15630-080
Gibco Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103-049
Glutagro, 200 mM, 100x	Corning	25-015-CI
Glutamax	ThermoFischer Scientific	35050061
H9 human ESC	Wicell International Stem Cell Bank	N/A
HyCloneTM FBS Defined	VWR	16777-002
LabGard Biological Safety Cabinet	Nuaire	Nu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356231	"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	"3D basement membrane matrix"
Micropipettes	Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)	2231300008
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	"stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance.
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048	For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)	Thermo Fisher	A1370701	For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope	Nikon	TS100
Noggin-conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFischer Scientific	15140-122
Recombinant Human Activin A	Cell Guidance Systems	GFH6-100
Recombinant Human BMP-4	Fisher Scientific	314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CF	ThermoFisher Scientific	236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein	ThermoFischer Scientific	233-FB-010
Recombinant Human FGF-4	Peprotech	100-31
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872	"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acid	SIGMA	R2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL	Thermo Scientific	AM12425
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer Scientific	11875093
R-Spondin conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
SB 431542, Tocris Bioscience	Fisher Scientific	16-141-0
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor Tips	VWR	89049-166
Stemolecule Chir99021 in Solution	Stemgent	04-0004-02
Sterile filter pipette tips	VWR (1000uL, 200uL, 10uL)	76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XF	Stem Cell Technologies	7180	Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates.