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Method Article
ヒト腸オルガノイドは、天然のヒト腸の構造と機能をよりよく再現するために神経支配されなければなりません。ここでは、これらの構築物に腸神経系を組み込むための1つの方法を紹介します。
腸の細胞構造と機能の複雑さは、バイオエンジニアリングされた小腸の創作に大きな課題をもたらします。ヒトの小腸に似たヒト腸オルガノイド(HIO)を生成する技術は、これまでに報告されています。HIOには上皮と間葉が含まれていますが、腸神経系(ENS)、免疫細胞、血管系、マイクロバイオームなど、機能的な腸の他の重要な構成要素が欠けています。2つの独立した研究グループが、ENSでHIOを神経支配する独自の方法を発表しました。ここでは、ENSをHIO由来のバイオエンジニアリング小腸に組み込む独自の方法について説明し、これらの先行報告のコンポーネントを利用して、前駆細胞の同一性と発生タイミングを最適化します。
ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、公開されたプロトコルごとに数日間にわたって分化マーカーの時間的調節により、HIOと腸管神経堤細胞(ENCC)を独立して生成するように分化されます。HIOが中後腸スフェロイド段階(約8日目)に達すると、15〜21日目のENCCスフェロイドは解離し、HIOと共培養され、透明な3次元(3D)基底膜マトリックス液滴内に浮遊します。HIO+ENCC共培養は、さらなる開発および成熟のために、>9週齢の免疫不全マウスに移植する前に、28〜40日間 in vitro で維持されます。ENSで移植されたHIO(tHIO)は、4〜20週間後に収穫できます。この方法は、hPSCから生成されたENCCを利用し、発生の初期段階でHIOと共培養することにより、以前に発表された2つの技術の要素を統合し、より成熟した腸の形態の形成に寄与する可能性のある初期の発生手がかりへの曝露を最大化します。
ヒトの小腸は、消化、栄養吸収、体液調節、免疫バリア機能、運動性など、数多くの重要な機能を担う複雑で多層的な器官です。短腸症候群、腸疾患、運動障害などの多くの臨床疾患は、腸の質量の重大な減少または正常な生理機能の混乱を特徴とし、重大な罹患率と死亡率につながります1,2,3,4。現在の治療選択肢には、腸の長さが短くなり、それによって残りの腸の機能的能力が減少する代わりに、機能不全の腸を切除する手術が含まれることがよくあります5。現在の治療パラダイムでは達成できない方法で、機能的な腸の能力を高め、腸の機能を回復させる、本質的に相加的な再生治療が必要です。
バイオエンジニアリングされた小腸は、これらの課題に対する有望な解決策です。ヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来するヒト腸オルガノイド(HIO)は、バイオエンジニアリングされた小腸の出発物質の1つです。2011年、Spenceらは、H1およびH9ヒト胚性幹細胞(hESC)および複数のヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)株を含むhPSC株からの最新のHIOの作成に成功したことを初めて報告しました6,7。彼らのプロトコルには、ヒト胎児の腸の発達を模倣するための特定の成長因子を用いた、慎重にタイミングを合わせた一連のインキュベーションが含まれていました。TGFβシグナル伝達分子であるアクチビンAは、hPSCの分化を内胚葉運命に向けて促進し、続いてWnt/FGFによる指向性後方パターニングを促進します。これらの条件下では、hPSCは自己組織化して、分極した上皮と間葉を含む腸内スフェロイドを形成します。基底膜マトリックス内での3D培養により、さらなる開発が可能になり、内部に内腔を持つオルガノイド、上皮の絨毛様退縮、および陰窩様構造内の自己再生前駆細胞ニッチが得られます。
このオリジナルの 2011 年のプロトコルを使用して生成された HIO は、構造的には天然の腸に似ていますが、腸神経系 (ENS) のニューロンまたはグリアを生成する能力が不足しています。2017年には、2つの主要な論文で、HIOを神経支配する類似しているが異なる方法が説明されました。ENS前駆細胞(腸管性神経堤細胞、ENCC)はhPSCに由来します。培養では、ENCCは3Dニューロスフェアを形成し、適切な条件下で腸内ニューロンとグリアに分化することができます。Workman氏とMaheらは、hPSCからENCCを誘導するように既存のプロトコルを変更し、それらをFGFが豊富な培地で処理し、続いてレチノイン酸で2日間処理して、迷走神経運命の事後化と促進を行いました8,9。6日目のニューロスフェアをRAなしでさらに4日間インキュベートし、その後、酵素的剥離後に遊走細胞を採取した。約20,000〜50,000のENCCを初期の中腸スフェロイドと凝集させ、これらのENCC播種腸スフェロイドを透明な3D基底膜マトリックスで28日間in vitroで増殖させ、免疫不全マウスの腎臓カプセルに6〜10週間in vivoで生着させました。得られたHIO+ENSは、上皮および間葉系成分、ならびに神経節に類似した神経膠構造の有意な成熟を示したが、これは天然腸よりも細胞体密度が低く、特定の臨床的に関連するニューロンサブタイプ(すなわち、移植後のHIO+ENSにおけるCHAT陽性ニューロン)の欠如、および全体的な胎児様特性を示すものであった。
同年、Schlieveらは、免疫不全マウスの大網に3ヶ月間in vivo移植した時点で、40〜60個の無傷の15日目ENCCニューロスフェアとより成熟したHIOsの混合物を含む代替方法を発表しました10。ENCC-HIO-TESI(組織改変小腸)と呼ばれる彼らの構築物は、WorkmanとMaheのHIO + ENSよりも成熟したENS表現型を含んでおり、HIO + ENSには見られないニューロンサブタイプの多様性と神経上皮シナプス接続が含まれているように見えました。重要なことに、Schlieveの実験で使用されたENCCは、Fattahi et al.11によって以前に説明したように、異なる方法で導出されました。簡単に説明すると、hPSC(hESCとhiPSCの両方)は、FGF2を濃縮した培地で神経堤誘導を受けました。これらの細胞もRAで治療して腸管迷走神経運命を確立しましたが、5日間(6〜11日目)は、ワークマンとマヘの2日間(4〜5日目)から増加しました。2019年、Barberらは、培養条件のより詳細な説明と、不一致を減らし、当時の細胞培養の好みの変化を反映するための定義された基礎培地への移行を含む、Fattahiプロトコルの改訂版を発表しました12。
以下で詳細に説明するHIOの神経支配方法は、Workman/MaheプロトコルとSchlieveプロトコルの両方の要素を組み込んでいます。SchlieveのENCC-HIO-TESIのENSは、ニューロンの多様性と神経膠細胞の統合が進んだため、より成熟しているように見えましたが、どちらの方法も機能的なENSをHIOに統合することに成功し、胃腸転写発現の変化が実証されました。Workman氏とMahe氏のHIO + ENSは、腸幹細胞および上皮細胞の発生に関連するいくつかの遺伝子の発現増加を誘導しましたが、これらはENCC-HIO-TESIでは変化しませんでした。これらの違いについて考えられる1つの説明は、プロトコル間でENCCとHIOが組み合わされた異なる時点です。当研究室では、早期の共培養では上皮分化や間葉分化に関与する複数の遺伝子の発現が増加し、共培養のタイミングが上皮細胞の多様性に影響を与えることが観察されています(未発表データ)。ENS前駆体がHIOsを発症する早期に曝露されたこと、 またはその逆 の曝露が、上皮の多様性やその他の初期発生過程を促進する未定義のシグナル伝達クロストークの時間を提供する可能性があります。
ヒト胚性幹細胞(hESC)株H9はWiCell(ウィスコンシン州マディソン)から供給され、hESCを含むすべての実験はUTHealth Houston Stem Cell Research Oversight(SCRO)委員会(プロトコル #SCRO-23-01)によって承認されました。このプロトコルでは、コーティングされたプレートまたはウェルへのすべての言及は、hESC認定の3D基底膜マトリックスで調製されたものを指します。
1. 細胞培養の準備
注:私たちのラボではH9 hESCを使用していますが、H9 hESCs9、10、12、H1 hESCs9、hESCラインUCSF412、WTC1112、WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f9、WTC10 9,10、WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)9、WTC10 PHOX2B null(Y14X / Y14X)9などの複数のhiPSCラインが他のラボでHIOおよびENCCSの生成に成功しています。
2. ENCCの生成
注:ENCC生成の方法は、Fattahi研究室によって説明され、Schlieveらによって使用された方法と密接に関連しています10。Barber et al.10,12 の「腸内神経堤 (ENC) 誘導 (0-12 日目)」および「ENCC スフェロイド形成 (12-15 日目)」のセクションを通じて、プロトコル オプション B のわずかに変更されたバージョンを利用します。
3. HIOの生成(中腸スフェロイド期)
注:HIO生成のための我々の方法は、基本的にMcCrackenらおよびSpence and Wells研究室の他によって詳細に説明された元のプロトコルと同じです6,7。このプロセスは、決定的内胚葉(DE)誘導と中腸スフェロイド形成の2つのフェーズで発生します。
4. 中腸スフェロイドとENCCの共培養
注: このセクションの図の概要を 図 1 に示します。
ENSは、蠕動運動、栄養吸収、体液輸送、上皮バリアの維持など、成熟した小腸の本質的な機能を調節します。したがって、HIOを神経支配する目標は、これらのコンストラクトに、より成熟した高レベルの機能を開発するために必要な要素を提供することです。この目的のために、私たちの研究室では、HIO内のENSの発達と、さまざまな段階での機能的結果を特に研究し...
HIOは、2010年代初頭からヒトの腸管発達のモデルシステムとして使用されてきましたが、それ以来、ますます複雑化しています。現在では、これらのコンストラクトにENSを提供することが可能になり、多くの臨床胃腸実体の理解とより良い治療に適用できる正常な発達の研究における新たな機会が可能になります。
体外 ?...
著者には、開示すべき利益相反はありません。
Noah Shroyer氏、Michael Helmrath氏、James Wells氏、Faranak Fattahi氏など、多くの共同研究者やメンターの方々に、彼らの研究室を訪問することを許可し、長年にわたって私たちのプロトコールを洗練させるのを助けていただき、ありがとうございました。また、シンシナティ小児病院医療センターの多能性幹細胞施設および幹細胞・オルガノイド医学センター(CuSTOM)のChris Mayhew氏とAmy Pitstick氏には、HIOのトレーニング、指導、アドバイスを提供していただいたことに感謝します。この研究は、Texas Medical Center Digestive Diseases Center Pilot/Feasibility grant Award(一部はNIH/NIDDK P30DK056338)(Speer)、NIDDK(NIH 1K08DK131326-01A1)(Speer)、Men of Distinction award(Speer)、American Neurogastroenterology and Motility Society(ANMS)Transition Award(Speer)から資金提供を受けました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA) | ThermoFischer Scientific | 11140050 | |
15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 12565269 | |
Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | "enzymatic cell detachment reagent" |
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | ThermoFischer Scientific | 12587010 | For ENCC |
B-27 Supplement (50x), serum free | Gibco | 17504044 | For HIO |
Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 3120 | |
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated | VWR | 29442-044 | |
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well | VWR | 29442-042 | |
Essential 6 Media | Thermo Fischer | A1516401 | |
Essential 8 Media | Thermo Fischer | A2858501 | Alternative stem cell media, used for ENCC plates. |
Fine-tip forceps | Dumont | 11223-20 | |
Forma Steri-Cycle i160 | Thermo Scientific | 50145522 | |
Gibco Advanced DMEM/F12 | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | |
Gibco HEPES 1 M | ThermoFischer Scientific | 15630-080 | |
Gibco Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103-049 | |
Glutagro, 200 mM, 100x | Corning | 25-015-CI | |
Glutamax | ThermoFischer Scientific | 35050061 | |
H9 human ESC | Wicell International Stem Cell Bank | N/A | |
HyCloneTM FBS Defined | VWR | 16777-002 | |
LabGard Biological Safety Cabinet | Nuaire | Nu-430-400 | |
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free | Corning | 356231 | "Clear 3D basement membrane matrix" |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free | Corning | 354277 | "3D basement membrane matrix" |
Micropipettes | Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL) | 2231300008 | |
mTeSR 1 | STEMCELL Technologies | 85850 | "stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance. |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | For HIO |
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems) | Thermo Fisher | A1370701 | For ENCC. Slightly different formulation. |
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope | Nikon | TS100 | |
Noggin-conditioned media | Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core | N/A | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFischer Scientific | 15140-122 | |
Recombinant Human Activin A | Cell Guidance Systems | GFH6-100 | |
Recombinant Human BMP-4 | Fisher Scientific | 314BP010 | |
Recombinant Human EGF Protein, CF | ThermoFisher Scientific | 236-EG-200 | |
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein | ThermoFischer Scientific | 233-FB-010 | |
Recombinant Human FGF-4 | Peprotech | 100-31 | |
ReLeSR | STEMCELL Technologies | 5872 | "Stem cell dissociation reagent" |
Retinoic acid | SIGMA | R2625-50MG | |
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL | Thermo Scientific | AM12425 | |
RPMI 1640 Medium | ThermoFischer Scientific | 11875093 | |
R-Spondin conditioned media | Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core | N/A | |
SB 431542, Tocris Bioscience | Fisher Scientific | 16-141-0 | |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | ||
Standard Wide Orifice Pipettor Tips | VWR | 89049-166 | |
Stemolecule Chir99021 in Solution | Stemgent | 04-0004-02 | |
Sterile filter pipette tips | VWR (1000uL, 200uL, 10uL) | 76322-154, 76322-150, 89174-520 | |
Vitronectin XF | Stem Cell Technologies | 7180 | Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates. |
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