人肠道类器官的神经支配

摘要

必须对人类肠道类器官进行神经支配，才能更好地概括天然人类肠道的结构和功能。在这里，我们提出了一种将肠道神经系统整合到这些结构中的方法。

摘要

肠道细胞结构和功能的复杂性对生物工程小肠的创建构成了重大挑战。以前已经报道了产生类似于人类小肠的人肠道类器官 （HIO） 的技术。HIO 包含上皮细胞和间充质，但缺乏功能性肠道的其他关键成分，例如肠道神经系统 （ENS）、免疫细胞、脉管系统和微生物组。两个独立的研究小组发表了用 ENS 支配 HIO 的不同方法。在这里，我们讨论了一种将 ENS 整合到 HIO 衍生的生物工程小肠中的独特方法，该方法利用这些先前报道的组成部分来优化祖细胞身份和发育时间。

人多能干细胞 （hPSC） 根据已发布的方案，通过分化标志物的时间调节，在几天内分化为独立产生 HIO 和肠神经嵴细胞 （ENCC）。一旦 HIO 达到后肠中球体阶段（大约第 8 天），第 15-21 天 ENCC 球体被解离，与 HIO 共培养，并悬浮在清晰的三维 （3D） 基底膜基质液滴中。在移植到>9周龄免疫缺陷小鼠中之前，将HIO + ENCC共培养物 在体外 维持28-40天，以进一步发育和成熟。带有 ENS 的移植 HIO （tHIO） 可以在 4-20 周后收获。该方法通过利用 hPSC 产生的 ENCC 并在发育的早期阶段将它们与 HIO 共培养，以最大限度地暴露于可能有助于形成更成熟肠道形态的早期发育线索，从而整合了两种先前发表的技术的元素。

引言

人体小肠是一个复杂的多层器官，执行许多基本功能，如消化、营养吸收、液体调节、免疫屏障功能和运动。许多临床疾病，如短肠综合征、肠病或动力障碍，其特征是肠道质量严重减少或正常生理机能中断，导致严重的发病率和死亡率 1,2,3,4。目前的治疗方案通常包括手术切除功能失调的肠道，代价是肠道长度减少，从而减少剩余肠道的功能容量⁵。需要本质上是附加性的再生疗法，以当前治疗范式无法实现的方式增加功能性肠道容量并恢复肠道功能。

生物工程小肠是应对这些挑战的一种很有前途的解决方案。源自人多能干细胞 （hPSC） 的人肠道类器官 （HIO） 是生物工程小肠的一种起始材料。2011 年，Spence 等人首次报道了从 hPSC 细胞系成功制备现代 HIO，包括 H1 和 H9 人胚胎干细胞 （hESC） 和多个人诱导多能干细胞 （hiPSC） 细胞系 ^6,7。他们的方案包括一系列精心定时的与特定生长因子的孵育，以模拟人类胎儿的肠道发育。激活素 A 是一种 TGFβ 信号分子，驱动 hPSC 分化向内胚层命运，然后用 Wnt/FGF 定向后向模式分化。在这些条件下，hPSC 自组织形成含有极化上皮和间充质的肠道球体。基底膜基质中的 3D 培养允许额外发育，从而产生具有内部腔的类器官、上皮绒毛状卷化和隐窝样结构内的自再生祖细胞生态位。

虽然使用这个 2011 年的原始方案生成的 HIO 在结构上类似于天然肠道，但它们缺乏产生肠道神经系统 （ENS） 神经元或神经胶质细胞的能力。2017 年，两篇主要论文描述了相似但不同的支配 HIO 的方法。ENS 祖细胞（肠神经嵴细胞，ENCCs）可来源于 hPSC。在培养中，ENCCs 形成 3D 神经球，在适当的条件下可以分化为肠道神经元和神经胶质细胞。Workman 和 Mahe 等人修改了从 hPSC 获得 ENCC 的现有方案，并用富含 FGF 的培养基处理它们，然后用视黄酸处理它们 2 天，用于后切和促进迷走神经命运 ^8,9。第 6 天神经球再孵育 4 天无 RA，然后在酶分离后收集迁移的细胞。大约 20,000-50,000 个 ENCCs 与早期中后肠球体聚集，这些 ENCC 种子的肠球体在透明的 3D 基底膜基质中体外生长 28 天，直到体内植入免疫缺陷小鼠的肾包膜 6-10 周。所得的 HIO + ENS 表现出上皮和间充质成分以及类似于神经节的神经胶质细胞结构的显着成熟，尽管细胞体密度低于天然肠道，缺乏某些临床相关的神经元亚型（即移植后 HIO + ENS 中的 CHAT 阳性神经元）和整体胎儿样特征。

同年，Schlieve 等人发表了一种替代方法，该方法涉及 40-60 个完整的第 15 天 ENCC 神经球与更成熟的 HIO 的混合物，在 体内移植到 免疫缺陷小鼠的网膜中 3 个月，无需事先 体外 共培养¹⁰。他们的构建体称为 ENCC-HIO-TESI（组织工程小肠），似乎包含比 Workman 和 Mahe 的 HIO + ENS 更成熟的 ENS 表型，具有更大的神经元亚型多样性和神经上皮突触连接，在 HIO + ENS 中看不到。重要的是，Schlieve 实验中使用的 ENCCs 是通过不同的方法得出的，如前所述 Fattahi 等人 ¹¹。简而言之，hPSC （hESCs 和 hiPSCs） 在富含 FGF2 的培养基中经历了神经嵴诱导。这些细胞也用 RA 处理以建立肠道迷走神经命运，但持续 5 天 （第 6-11 天），比 Workman 和 Mahe 的 2 天 （第 4-5 天） 有所增加。2019 年，Barber 等人发布了 Fattahi 方案的修订版，包括对培养条件的更详尽描述和向确定的基础培养基的过渡，以减少不一致并反映当时不断变化的细胞培养偏好¹²。

我们支配 HIO 的方法，如下所述，结合了 Workman/Mahe 和 Schlieve 方案的元素。虽然 Schlieve 的 ENCC-HIO-TESI 中的 ENS 看起来更成熟，神经元多样性和神经胶质细胞整合程度更高，但两种方法都成功地将功能性 ENS 整合到 HIO 中，并证明了胃肠道转录表达的变化。Workman 和 Mahe 的 HIO + ENS 诱导了与肠道干细胞和上皮细胞发育相关的几个基因的表达增加，这些基因在 ENCC-HIO-TESI 中没有改变。对这些差异的一种可能解释是 ENCC 和 HIO 在协议之间组合的不同时间点。我们的实验室观察到，早期共培养导致参与上皮和间充质分化的多个基因的表达增加，并且共培养的时间会影响上皮细胞多样性（未发表的数据）。ENS 前体早期暴露于发育中的 HIO（ 反之亦然 ）可能为尚未定义的信号转导串扰提供了时间，从而促进了上皮多样性和其他早期发育过程。

研究方案

人胚胎干细胞 （hESC） 系 H9 来源于 WiCell（威斯康星州麦迪逊），所有涉及 hESC 的实验均已获得 UTHealth 休斯顿干细胞研究监督 （SCRO） 委员会（协议 #SCRO-23-01）的批准。对于该协议，所有对涂层板或孔的引用均指用 hESC 合格的 3D 基底膜基质制备的板或孔。

1. 细胞培养制备

注：我们的实验室使用 H9 hESC，但其他实验室已成功使用多个 hPSC 系来生成 HIO 和 ENCC，包括 H9 hESC ^9,10,12、H1 hESCs⁹、hESC 系 UCSF4¹² 和多个 hiPSC 系，如 WTC11¹²、WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f⁹、WTC10 ^9,10、WTC10 PHOX2B het （+/Y14X）⁹ 和 WTC10 PHOX2B 无效 （Y14X/Y14X）⁹。

1. 通过在适当的细胞培养基中稀释 3D 基底膜基质包被每个所需的孔来制备 6 孔板（稀释因子和制备说明可在材料数据表中找到）。每个孔用 1 mL 包被每个所需的孔，并在 37 °C 下孵育至少 1 小时或过夜，以便在接种细胞之前凝固。
   注意：该方案可以仅用来自一个孔的细胞完成，也可以根据需要按比例放大。我们建议至少包被 3 个孔以开始包被，以促进未分化 hPSC 的额外传代和维持。
   工作时保持基底膜基质低温很重要，因为大多数基质在室温下开始聚合。包被孔在 37 °C 下可使用长达 2-3 周。 使用足够的稀释剂储存以覆盖整个孔，以防止涂层变干。
2. 通过在温水浴中短暂旋转来解冻 hPSC（最好是低传代数）。在层流罩下，将一小瓶细胞重悬于 2 mL 干细胞培养基中（表 1）。在铺板细胞之前，立即从 6 孔培养皿中的一个先前包被的孔中吸出稀释剂，然后将整个 2 mL 重悬的细胞转移到包被的孔中。为了维持未分化的 hPSC（称为维持板），在 37 °C、5% CO₂ 下孵育，并每隔一天更换一次培养基，每孔 2 mL 干细胞培养基。
3. 当细胞达到 70-80% 汇合时传代。从孔的侧面吸出培养基，而不会干扰细胞。向孔中加入 1 mL 室温干细胞解离试剂，并在 1 分钟内吸出，在细胞上留下一层薄薄的液体膜。将板在 37 °C 下孵育 5 分钟。
   注：等到细胞汇合度超过 80% 才能传代可能会导致过早分化问题，从而降低后续步骤的产量。
4. 每孔加入 1 mL 温热的干细胞培养基，并敲击板的侧面以去除集落。使用带有广口移液器吸头的 P1000 微量移液器轻轻移液培养基（参见 材料表），以打碎菌落，同时最大限度地减少细胞损伤。
   注：研磨细胞悬液时，建议打碎大块细胞，但让较小的细胞簇保持完整。不建议达到单细胞悬液，而是瞄准均匀分布在整个孔中的较少、较小的菌落。
5. 从 6 孔培养皿中先前包被的孔中吸出稀释剂，并加入 2 mL 温热的干细胞培养基。将所需体积的细胞悬液转移到该孔中以维持 hPSC 集落，每隔一天更换一次培养基，每孔 2 mL 干细胞培养基。
   注意：我们的实验室通常转移 50-150 μL 的体积，以便每周一次对 hPSC 维持板进行传代。该体积可能因特定的 hPSC 细胞系和传代次数而异，因此可能需要调整。使用剩余的单元格启动 ENCC 生成（第 2 节）或 HIO 生成（第 3 节）。新解冻的 hPSC 应在进入 ENCC 生成或 HIO 生成之前至少传代两次。

2. ENCC 生成

注意：我们的 ENCC 生成方法与 Fattahi 实验室描述的和 Schlieve 等人使用的方法非常相似¹⁰。我们通过 Barber 等人 ^10,12 中的“肠神经嵴 （ENC） 诱导（第 0-12 天）”和“ENCC 球体形成（第 12-15 天）”部分使用方案选项 B 的略微修改版本。

1. 从新的 6 孔培养皿中先前包被的孔中吸出稀释剂，并加入 2 mL 温热的干细胞培养基。将 850 μL 的 hPSC 细胞悬液从步骤 1.5 转移到同一孔中（通常为 5：6 的传代比例）。
2. 将细胞维持在 37 °C，5% CO₂ 中。每隔一天更换一次培养基，每孔加入 2 mL 干细胞培养基，直到汇合度达到 60-80%。然后，板已准备好开始 ENC 诱导。
3. ENC 感应
   1. 第 0 天。从孔的侧面吸出培养基，并加入 2 mL 温热的 Cocktail A 培养基（表 1）。返回培养箱 48 小时。
   2. 第 2 天。从孔侧面吸出 Cocktail A 培养基，并用 2 mL 温热的 Cocktail B 培养基替换（表 1）。返回培养箱 48 小时。
   3. 第 4 天。从孔侧面吸出 Cocktail B 培养基，并更换为 2 mL 新鲜、温暖的 Cocktail B 培养基。返回培养箱 48 小时。
   4. 第 6-12 天。从孔侧面吸出 Cocktail B 培养基，并替换为 2 mL 温热的 Cocktail C 培养基（表 1）。返回培养箱，每 48 小时用 2 mL 新鲜、温暖的混合物 C 更换培养基，直到第 12 天完成 ENC 诱导。
      注：在此阶段，ENC 谱系可以通过 Barber 等人 ¹² 描述的基因表达分析来确认。
4. ENCC 球体形成
   1. 第 13 天.从孔的侧面吸出 Cocktail C 培养基。加入 1 mL 温热的酶细胞分离试剂，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。轻敲板的侧面以去除细胞，并使用广口移液器吸头将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。用 1 mL 的 Neural Crest Cell （NCC） 培养基（表 1）清洗孔，并将洗涤液添加到 15 mL 锥形管中。
   2. 将 15 mL 锥形管中的细胞悬液以 300 × g 离心 1 分钟。吸出上清液。将沉淀轻轻重悬于 2 mL 温热的 NCC 培养基中。
   3. 将重悬的细胞添加到超低结合板的新的未包被孔中，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 48 小时。
   4. 第 15 至 21 天。监测 ENCC 球状体的生长，每 48 小时用 2 mL 新鲜、温暖的 NCC 培养基更换培养基。
      注意：更换培养基时应小心，以避免损坏或吸入 ENCC 球状体。最好通过以圆周运动旋转板以将球体聚焦在孔中间，然后从孔边缘吸出介质来实现。
      ENCC 球体的形成通常在第 15 天完成，但可以将它们培养到第 21 天，以适应与中后肠球体共培养的理想时间。

3. HIO 生成（中后肠球体期）

注意：我们的 HIO 生成方法与 McCracken 等人以及 Spence 和 Wells 实验室的其他人详细描述的原始方案基本相同 ^6,7。该过程分为两个阶段：确定性内胚层 （DE） 诱导和中后肠球体形成。

1. HIO 生成准备
   1. 通过在适当的细胞培养基中稀释 3D 基底膜基质包被每个所需的孔来制备 24 孔板（稀释因子和制备说明可在材料数据表中找到）。用每孔 500 μL 包被每个所需的孔，并在 37 °C 下孵育至少 1 小时或过夜，以便在接种细胞之前凝固。
      注：工作时保持基底膜基质低温很重要，因为大多数基质在室温下开始聚合。包被孔在 37 °C 下可使用长达 2-3 周。 用足够的稀释剂覆盖整个孔储存，以防止涂层变干。
      计划从上述 6 孔 hPSC 维持板中每 1 孔涂覆 24 孔板的 6 个孔。此比率可以根据需要按比例放大。
   2. 从 24 孔培养皿中所有先前包被的孔中吸出稀释剂。从步骤 1.5 开始，向 hPSC 细胞悬液中加入足够的温干细胞培养基，并将 500 μL 分配到每个孔中（例如，如果在传代 hPSC 维持板后还剩下 850 μL 的 hPSC 细胞悬液，那么对于 24 孔板的 6 个孔，将 2,150 μL 温干细胞培养基与步骤 1.5 中的 850 μL hPSC 细胞悬液混合， 和 500 μL，分布在 6 个孔中）。
      注：由于我们通常传代体积为 50-150 μL 的 hPSC 维持板，因此我们通常有 850-950 μL 的体积可用于此步骤。因此，24 孔板中每孔的 hPSC 体积约为 150 μL/孔。
      将新制备的 24 孔板放入培养箱中后，轻轻地来回摇动板（从北到南和从东到西），以使细胞尽可能均匀地分布在孔的底部。
   3. 将细胞维持在 37 °C，5% CO₂ 中。每隔一天更换一次培养基，每孔 500 μL 干细胞培养基，直到汇合度达到 50-70%。然后，板准备开始 DE 诱导。
      注意：在 DE 诱导之前，细胞不能达到 >70% 的汇合度至关重要，因为较高的汇合度会对后续阶段的内胚层密度和后肠形态发生产生不利影响。理想情况下，细胞在 24-48 小时后以指定的传代率达到约 50-70% 的汇合度。
2. DE 诱导
   1. 第 1 天。一旦 hPSC 达到 50-70% 汇合，从每个孔中完全吸出干细胞培养基，并用每孔 500 μL 温热的第 1 天 DE 培养基（表 1）替换。在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 24 小时。
   2. 第 2 天。吸出第 1 天 DE 并用每孔 500 μL 温热的第 2 天 DE（表 1）培养基替换。在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 24 小时。
   3. 第 3 天。吸出第 2 天 DE 并用每孔 500 μL 温暖的第 3 天 DE（表 1）培养基替换。在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 24 小时。
3. 中后肠球状体形成
   1. 第 4-8 天。从每个孔中完全吸出培养基，并用每孔 500 μL 温热的中后肠培养基（MHGM， 表 1）替换。在 37 °C、5% CO₂ 下孵育。每天重复此步骤，直到第 8 天，此时中后肠球体已准备好进行收集和共培养（第 4 节）。

4. 中后肠球体与 ENCC 的共培养

注意： 图 1 提供了本节的图形摘要。

1. ENCC 混悬液的制备
   1. 从步骤 2.4.4 收集第 15-21 天 ENCC 球体。小心地从孔中取出介质，避免使用该步骤的说明中描述的漩涡方法吸出球状体。
   2. 向孔中加入 1 mL 温热的酶细胞分离试剂，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   3. 轻敲板的侧面以继续解离球体，并用带有广口尖端的 P1000 微量移液器轻轻上下移液以分解细胞团块，直到混合物均匀。
   4. 将 ENCC 悬浮液转移至 15 mL 锥形管中。用 1 mL 温热的 NCC 培养基（见 表 1）清洗孔以收集任何剩余的细胞，并将其添加到 15 mL 锥形管中。
   5. 将细胞悬液以 300 × g 离心 1 分钟。用无菌移液器吸头吸出上清液。
   6. 使用广口移液器吸头，将细胞沉淀重悬于 1 mL 温热的 NCC 培养基中。使用血细胞计数器或细胞计数器计算 ENCC 悬浮液的浓度。
2. 将 ENCC 悬吊与中后肠球体相结合
   1. 使用广口移液器吸头从 HIO 板的所有孔中收集中后肠球体，并转移到 15 mL 锥形管中。
   2. 确定 24 孔板内将使用的共培养孔的数量。目标是每孔接种 10-30 个中后肠球体和 50,000-100,000 个 ENCC 用于共培养。
      注意：在实践中，具有健康球体的孔数与共培养所需的最终孔数之间通常存在一一的关系。血细胞计数器也可用于计算收集的中后肠球体的浓度。
   3. 加入计算体积的 ENCC 悬浮液，将每个计划的共培养孔输送 50,000-100,000 个 ENCC，到具有中后肠球体的锥形管中。用广口移液器吸头轻轻研磨，以均匀混合中后肠球体和 ENSC。
   4. 以 300 × g 离心 1 分钟，然后用无菌移液器吸头小心吸出上清液。使用广口移液器吸头，将细胞沉淀重悬于一定体积的冷、无酚（透明）、低生长因子的基底膜基质中，相当于每个最终共培养孔 30 μL。
      注意：在重悬过程中避免在透明的基底膜基质中形成气泡，因为这些气泡难以去除，会阻碍 HIO + ENCC 共培养物对培养基的适当吸收，并且会随着 HIO + ENCC 共培养物的生长而减少它们的可视化。
   5. 在每个干井的中心，将 30 μL 重悬的中后肠球体 + ENCCs 液滴移入透明的基底膜基质中，无需任何周围介质。将所有液滴接种到孔中后，盖上并倒置板。在 37 °C、5% CO₂ 下倒置孵育 30 分钟。
      注意：此步骤允许中后肠球体和 ENCC 有时间从板底部脱落，并在透明 3D 基底膜基质聚合过程中悬浮。
3. 体外研究 HIO+ENS 共培养
   1. 第 0 天：一旦透明的基底膜基质聚合，将每个液滴覆盖在 500 μL 温暖的第 0-3 天 HIO 培养基中（见 表 1）。
   2. 第 3 天：从孔侧面小心吸出第 0-3 天的 HIO 培养基，不要打扰透明的基底膜基质液滴。用 500 μL 温暖的第 3-14 天 HIO 培养基更换培养基（见 表 1）。将板放回培养箱中。在此阶段，每 3-4 天更换一次媒体。
   3. 第 7-14 天：根据需要继续每 3-4 天更换一次第 3-14 天的 HIO 培养基，并监测增长情况。
4. 拆分 HIO
   1. 第 14 天：在显微镜下仔细检查每个孔，并评估每个透明的 3D 基底膜基质液滴中有多少正在发生的 HIO + ENS。
   2. 制备 2 mL 微量离心管，加入 30 μL 透明基底膜基质，并将其保存在冰上。
   3. 在层流罩下，使用细镊子小心地去除带有悬浮 HIO + ENS 的透明 3D 基底膜基质液滴。轻轻梳理分离单个 HIO+ENS。
      注意：手术放大镜或解剖显微镜在这个阶段可能非常有帮助，但并不是绝对必要的，因为 HIO 通常是肉眼可见的。
   4. 使用镊子或广口移液器吸头，将每个分离的 HIO + ENS 放入装有 30 μL 透明基底膜基质的准备好的微量离心管之一中。
      注：旧的透明 3D 基底膜基质在此阶段不需要液化或溶解。如果可能，请避免破坏 HIO，但如果发生这种情况，它仍可能在后期阶段增长。
   5. 对拆分和重新电镀的 HIO + ENS 重复步骤 4.2.5。一旦透明的 3D 基底膜液滴聚合，向每个孔中加入 500 μL 温暖、新鲜的第 3-14 天 HIO 培养基并孵育过夜。
5. HIO+ENS 共培养继续
   1. 第 15 天：从孔侧面小心吸出第 3-14 天的 HIO 培养基。用 500 μL 温暖的第 15-28 天 HIO 培养基替换培养基（见 表 1）。
   2. 第 15-40 天：根据需要继续每 3-4 天更换一次第 15-28 天的 HIO 培养基，并监测 HIO + ENCC 的增长。

结果

ENS 调节成熟小肠的基本功能，包括蠕动、营养吸收、液体运输和上皮屏障维持。因此，支配 HIO 的目标是为这些结构提供开发更成熟、更高级别功能所需的元素。为此，我们实验室专门研究了 HIO 中 ENS 的发展以及不同阶段的功能结果。

监测细胞生长、分化和形态发生随时间的变化非常重要，以确保在进入下一阶段之前每个步骤都按预期进行。ENCC 分?...

讨论

自 2010 年代初以来，HIO 一直被用作人类肠道发育的模型系统，并且从那时起变得越来越复杂。现在可以为这些结构提供 ENS，从而为正常发育的研究提供新的机会，这些机会可能应用于理解和更好地治疗许多临床胃肠道实体。

体内 移植
ENCCs 整合到中后肠球体中，并在体外共培养阶段形成 ENS。然而，包括我们?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)	ThermoFischer Scientific	11140050
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	12565269
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	ThermoFischer Scientific	12587010	For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	17504044	For HIO
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific	3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated	VWR	29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well	VWR	29442-042
Essential 6 Media	Thermo Fischer	A1516401
Essential 8 Media	Thermo Fischer	A2858501	Alternative stem cell media, used for ENCC plates.
Fine-tip forceps	Dumont	11223-20
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific	50145522
Gibco Advanced DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010
Gibco HEPES 1 M	ThermoFischer Scientific	15630-080
Gibco Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103-049
Glutagro, 200 mM, 100x	Corning	25-015-CI
Glutamax	ThermoFischer Scientific	35050061
H9 human ESC	Wicell International Stem Cell Bank	N/A
HyCloneTM FBS Defined	VWR	16777-002
LabGard Biological Safety Cabinet	Nuaire	Nu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356231	"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	"3D basement membrane matrix"
Micropipettes	Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)	2231300008
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	"stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance.
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048	For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)	Thermo Fisher	A1370701	For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope	Nikon	TS100
Noggin-conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFischer Scientific	15140-122
Recombinant Human Activin A	Cell Guidance Systems	GFH6-100
Recombinant Human BMP-4	Fisher Scientific	314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CF	ThermoFisher Scientific	236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein	ThermoFischer Scientific	233-FB-010
Recombinant Human FGF-4	Peprotech	100-31
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872	"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acid	SIGMA	R2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL	Thermo Scientific	AM12425
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer Scientific	11875093
R-Spondin conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
SB 431542, Tocris Bioscience	Fisher Scientific	16-141-0
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor Tips	VWR	89049-166
Stemolecule Chir99021 in Solution	Stemgent	04-0004-02
Sterile filter pipette tips	VWR (1000uL, 200uL, 10uL)	76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XF	Stem Cell Technologies	7180	Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates.