Inervación de organoides intestinales humanos

Resumen

Los organoides intestinales humanos deben ser inervados para recapitular mejor la estructura y función del intestino humano nativo. Aquí, presentamos un método para incorporar un sistema nervioso entérico en estas construcciones.

Resumen

La complejidad de la citoarquitectura y la función intestinal plantea desafíos significativos para la creación del intestino delgado de bioingeniería. Se han descrito previamente técnicas para generar organoides intestinales humanos (HIO) que se asemejan al intestino delgado humano. Las HIO contienen epitelio y mesénquima, pero carecen de otros componentes críticos del intestino funcional, como el sistema nervioso entérico (SNE), las células inmunitarias, la vasculatura y el microbioma. Dos grupos de investigación independientes han publicado métodos distintos para inervar HIOs con un ENS. Aquí discutimos un método único para incorporar el ENS en un intestino delgado de bioingeniería derivado de HIO, que utiliza componentes de estos informes previos para optimizar la identidad de la célula progenitora, así como el momento del desarrollo.

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) se diferencian para generar de forma independiente HIOs y células de cresta neural entérica (ENCCs) mediante la regulación temporal de los marcadores de diferenciación durante un período de varios días según los protocolos publicados. Una vez que los HIO alcanzan la etapa de esferoide del intestino posterior medio (aproximadamente el día 8), los esferoides ENCC del día 15 al 21 se disocian, se cultivan conjuntamente con los OHIO y se suspenden dentro de gotas de matriz de membrana basal tridimensionales (3D) transparentes. Los cocultivos HIO + ENCC se mantienen in vitro durante 28-40 días antes del trasplante en ratones inmunodeficientes de >9 semanas de edad para su posterior desarrollo y maduración. Las HIOs trasplantadas (tHIOs) con ENS se pueden cosechar entre 4 y 20 semanas después. Este método integra elementos de dos técnicas publicadas anteriormente mediante la utilización de ENCC generadas a partir de hPSC y su cocultivo con HIO en una etapa temprana de desarrollo para maximizar la exposición a señales de desarrollo temprano que probablemente contribuyan a la formación de una morfología intestinal más madura.

Introducción

El intestino delgado humano es un órgano complejo y de múltiples capas que lleva a cabo numerosas funciones esenciales como la digestión, la absorción de nutrientes, la regulación de líquidos, la función de barrera inmunitaria y la motilidad. Numerosas enfermedades clínicas, como el síndrome del intestino corto, las enteropatías o los trastornos de la motilidad, se caracterizan por una reducción crítica de la masa intestinal o alteraciones de la fisiología normal que conducen a una morbilidad y mortalidad significativas 1,2,3,4. Las opciones de tratamiento actuales a menudo incluyen la cirugía para extirpar el intestino disfuncional a costa de la disminución de la longitud intestinal y, por lo tanto, de la capacidad funcional del intestino restante^. Existe la necesidad de terapias regenerativas que sean de naturaleza aditiva, que aumenten la capacidad funcional del intestino y restauren la función intestinal de una manera que los paradigmas terapéuticos actuales no pueden lograr.

El intestino delgado de bioingeniería es una solución prometedora a estos desafíos. Los organoides intestinales humanos (HIO, por sus siglas en inglés) derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC, por sus siglas en inglés) son un material de partida para el intestino delgado de bioingeniería. En 2011, Spence et al. informaron por primera vez de la creación exitosa de HIOs modernas a partir de líneas de hPSC, incluyendo las líneas de células madre embrionarias humanas (hESC) H1 y H9 y múltiples líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) ^6,7. Su protocolo incluía una serie de incubaciones cuidadosamente programadas con factores de crecimiento específicos para imitar el desarrollo intestinal del feto humano. La activina A, una molécula de señalización de TGFβ, impulsa la diferenciación de hPSC hacia el destino endodérmico seguido de un patrón posterior dirigido con Wnt/FGF. En estas condiciones, las hPSC se autoorganizan para formar esferoides intestinales que contienen epitelio polarizado y mesénquima. El cultivo en 3D dentro de una matriz de membrana basal permite un desarrollo adicional que da como resultado organoides con un lumen interno, involuciones del epitelio en forma de vellosidades y nichos de células progenitoras que se regeneran automáticamente dentro de estructuras similares a criptas.

Si bien las HIO generadas con este protocolo original de 2011 se parecen estructuralmente al intestino nativo, carecen de la capacidad de generar las neuronas o la glía del sistema nervioso entérico (ENS). En 2017, dos artículos importantes describieron métodos similares pero distintos para inervar las HIO. Los progenitores de ENS (células de la cresta neural entérica, ENCCs) pueden derivarse de las hPSCs. En cultivo, las ENCC forman neuroesferas 3D, que pueden diferenciarse en neuronas entéricas y glía en condiciones adecuadas. Workman y Mahe et al. modificaron un protocolo existente para derivar ENCCs a partir de hPSCs y las trataron con medios enriquecidos con FGF seguidos de ácido retinoico durante 2 días para la posteriorización y promoción del destino vagal ^8,9. Las neuroesferas del día 6 se incubaron durante otros 4 días sin AR, y luego se recolectaron las células migradas después del desprendimiento enzimático. Aproximadamente 20.000-50.000 ENCC se agregaron con esferoides tempranos del intestino medio posterior y estos esferoides intestinales sembrados con ENCC se cultivaron in vitro en una matriz clara de membrana basal 3D durante 28 días hasta el injerto in vivo en la cápsula renal de ratones inmunodeficientes durante 6-10 semanas. El resultado de HIO + ENS demostró una maduración significativa de los componentes epiteliales y mesenquimales, así como de estructuras neurogliales similares a los ganglios, aunque con una densidad celular corporal más baja que el intestino nativo, ausencia de ciertos subtipos neuronales clínicamente relevantes (es decir, neuronas CHAT positivas en HIO + ENS después del trasplante) y características generales similares a las fetales.

El mismo año, Schlieve et al. publicaron un método alternativo que involucraba una mezcla de 40-60 neuroesferas ENCC intactas del día 15 con HIOs más maduras en el momento del trasplante in vivo en el epiplón de ratones inmunodeficientes durante 3 meses sin cocultivo in vitro previo¹⁰. Sus construcciones, llamadas ENCC-HIO-TESI (intestino delgado diseñado por tejidos), parecían contener un fenotipo ENS más maduro que el de HIO + ENS de Workman y Mahe, con una mayor diversidad de subtipos neuronales y conexiones sinápticas neuroepiteliales que no se ven en HIO + ENS. Es importante destacar que las ENCC utilizadas en los experimentos de Schliever se derivaron a través de un método diferente, como lo describieron previamente Fattahi et ^al.11. Brevemente, las hPSCs (tanto hESCs como hiPSCs) se sometieron a la inducción de la cresta neural en medios enriquecidos con FGF2. Estas células también se trataron con AR para establecer un destino vagal entérico, pero durante 5 días (días 6-11), un aumento con respecto a los 2 días de Workman y Mahe (día 4-5). En 2019, Barber et al. publicaron una versión revisada del protocolo de Fattahi que incluía una descripción más exhaustiva de las condiciones de cultivo y una transición a medios basales definidos para reducir la inconsistencia y reflejar los cambios en las preferencias de cultivo celular en ese momento¹².

Nuestro método para inervar HIOs, descrito en detalle a continuación, incorpora elementos de los protocolos de Workman/Mahe y Schlieve. Mientras que el ENS en el ENCC-HIO-TESI de Schlieve parecía más maduro con mayor diversidad neuronal e integración neuroglial, ambos métodos integraron con éxito un ENS funcional en los OHIOs con cambios demostrados en la expresión transcripcional gastrointestinal. El HIO + ENS de Workman y Mahe indujo un aumento de la expresión de varios genes relacionados con las células madre intestinales y el desarrollo de células epiteliales, que no se alteraron en el ENCC-HIO-TESI. Una posible explicación para estas distinciones son los diferentes puntos de tiempo en los que se combinaron ENCC y HIO entre los protocolos. Nuestro laboratorio ha observado que el cocultivo temprano da como resultado una mayor expresión de múltiples genes involucrados en la diferenciación epitelial y mesenquimatosa, y el momento del cocultivo influye en la diversidad de células epiteliales (datos no publicados). Es posible que la exposición temprana de los precursores del ENS a las HIOs en desarrollo y viceversa proporcione tiempo para la diafonía de señalización aún no definida que promueve la diversidad epitelial y otros procesos de desarrollo temprano.

Protocolo

La línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC) se obtuvo de WiCell (Madison, WI) y todos los experimentos que involucraron hESC fueron aprobados por el Comité de Supervisión de la Investigación de Células Madre (SCRO) de UTHealth Houston (protocolo #SCRO-23-01). Para este protocolo, todas las referencias a placas o pocillos recubiertos se refieren a aquellos preparados con matriz de membrana basal 3D calificada por hESC.

1. Preparación de cultivos celulares

NOTA: Nuestro laboratorio utiliza hESCs H9, pero múltiples líneas de hPSC han sido utilizadas con éxito por otros laboratorios para generar HIOs y ENCCs, incluyendo H9 hESCs ^9,10,12, H1 hESCs⁹, hESC line UCSF4¹² y múltiples líneas hiPSC como WTC11¹², WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f⁹, WTC10 ^9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)⁹ y WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)⁹.

1. Prepare una placa de 6 pocillos recubriendo cada pocillo deseado con una matriz de membrana basal 3D diluida en un medio de cultivo celular apropiado (el factor de dilución y las instrucciones para la preparación se encuentran en la hoja de datos del material). Cubra cada pocillo deseado con 1 mL por pocillo e incube a 37 °C durante al menos 1 h o toda la noche para que cuaje antes de las celdas de siembra.
   NOTA: Este protocolo puede completarse con celdas de un solo pocillo o ampliarse según sea necesario. Recomendamos recubrir al menos tres pozos para comenzar a facilitar el paso adicional y el mantenimiento de las hPSC indiferenciadas.
   Es importante mantener fría la matriz de la membrana basal mientras se trabaja, ya que la mayoría de las matrices comienzan a polimerizar a temperatura ambiente. Los pocillos recubiertos pueden utilizarse hasta 2-3 semanas cuando se almacenan a 37 °C. Almacene con un diluyente adecuado para cubrir todo el pozo y evitar que el recubrimiento se seque.
2. Descongele las hPSC (idealmente un número de paso bajo) agitándolas brevemente en un baño de agua tibia. Bajo una campana de flujo laminar, resuspenda un vial de células en 2 mL de medio de células madre (Tabla 1). Aspire el diluyente de un pocillo previamente recubierto en un plato de 6 pocillos inmediatamente antes de colocar las celdas y luego transfiera los 2 ml completos de celdas resuspendidas al pocillo recubierto. Para el mantenimiento de hPSC indiferenciadas (denominadas placas de mantenimiento), incubar a 37 °C, 5% de CO₂ y cambiar el medio cada dos días con 2 mL de medio de células madre por pocillo.
3. Pasa las celdas cuando alcancen el 70-80% de confluencia. Aspire el medio desde el costado del pocillo sin alterar las células. Agregue 1 mL de reactivo de disociación de células madre a temperatura ambiente al pocillo y aspire dentro de 1 minuto, dejando una película delgada de líquido sobre las células. Incubar la placa durante 5 min a 37 °C.
   NOTA: Esperar hasta que las celdas superen el 80% de confluencia al paso puede causar problemas con la diferenciación prematura, lo que reducirá el rendimiento en los pasos siguientes.
4. Agregue 1 ml por pocillo de medio caliente de células madre y golpee el costado de la placa para desalojar las colonias. Pipetee suavemente los medios con una micropipeta P1000 con una punta de pipeta de boca ancha (consulte la Tabla de materiales) para romper las colonias y minimizar el daño celular.
   NOTA: Al triturar la suspensión de células, se recomienda romper grandes grupos de células, pero permitir que los grupos más pequeños permanezcan intactos. No se recomienda llegar a una suspensión de una sola célula, sino más bien apuntar a menos colonias más pequeñas distribuidas uniformemente por todo el pozo.
5. Aspire el diluyente de un pocillo previamente recubierto en un plato de 6 pocillos y agregue 2 mL de medio de células madre tibio. Transfiera el volumen deseado de la suspensión celular a este pocillo para mantener las colonias de hPSC, cambiando el medio cada dos días con 2 mL de medio de células madre por pocillo.
   NOTA: Nuestro laboratorio generalmente transfiere volúmenes entre 50 y 150 μL para permitir el paso de las placas de mantenimiento de hPSC una vez por semana. Este volumen puede variar con la línea hPSC específica y el número de paso y, por lo tanto, puede requerir ajuste. Utilice las celdas restantes para iniciar la generación de ENCC (Sección 2) o la generación de HIO (Sección 3). Las hPSC recién descongeladas deben pasar al menos dos veces antes de avanzar a la generación ENCC o a la generación HIO.

2. Generación de ENCC

NOTA: Nuestro método para la generación de ENCC sigue de cerca el descrito por el laboratorio de Fattahi y utilizado por Schlieve et ^al.10. Utilizamos una versión ligeramente modificada de la opción B del protocolo a través de las secciones "Inducción de la cresta neural entérica (ENC) (días 0-12)" y "Formación de esferoides ENCC (días 12-15)" en Barber et ^al.10,12.

1. Aspire el diluyente de un pocillo previamente recubierto en una nueva placa de 6 pocillos y agregue 2 mL de medio de células madre tibio. Transfiera 850 μL de suspensión de celda hPSC desde el paso 1.5 al mismo pocillo (normalmente una relación de paso de 5:6).
2. Mantener las celdas a 37 °C, 5% de CO₂. Cambie el medio cada dos días con 2 mL de medio de células madre por pocillo hasta que la confluencia alcance el 60-80%. Luego, la placa está lista para comenzar la inducción de ENC.
3. Inducción ENC
   1. Día 0. Aspire el medio desde el costado del pocillo y agregue 2 mL de medio Cocktail A tibio (Tabla 1). Regreso a la incubadora durante 48 h.
   2. Día 2. Aspire el medio Cocktail A desde el costado del pocillo y reemplácelo con 2 mL de medio Cocktail B tibio (Tabla 1). Regreso a la incubadora durante 48 h.
   3. Día 4. Aspire los medios Cocktail B desde el costado del pozo y reemplácelos con 2 ml de medios Cocktail B frescos y calientes. Regreso a la incubadora durante 48 h.
   4. Días 6-12. Aspire el medio Cocktail B desde el costado del pocillo y reemplácelo con 2 mL de medio Cocktail C tibio (Tabla 1). Regrese a la incubadora y reemplace los medios con 2 mL de Cocktail C fresco y tibio cada 48 h hasta la finalización de la inducción de ENC el día 12.
      NOTA: En esta etapa, los linajes de ENC pueden confirmarse mediante el análisis de expresión génica descrito por Barber et ^al.12.
4. Formación de esferoides ENCC
   1. Día 13. Aspire los medios Cocktail C desde el costado del pozo. Añadir 1 mL de un reactivo de desprendimiento de células enzimáticas caliente e incubar a 37 °C durante 30 min. Golpee el costado de la placa para desalojar las células y transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml con una punta de pipeta de boca ancha. Lave el pocillo con 1 mL de medio Neural Crest Cell (NCC) (Tabla 1) y agregue los lavados al tubo cónico de 15 mL.
   2. Centrifugar la suspensión celular en el tubo cónico de 15 mL a 300 × g durante 1 min. Aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender suavemente el pellet en 2 ml de medios NCC tibios.
   3. Añadir las células resuspendidas a un nuevo pocillo sin recubrimiento de una placa de unión ultrabaja e incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 48 h.
   4. Días 15-21. Controle el crecimiento de los esferoides ENCC y sustituya los medios por 2 ml de medios NCC frescos y calientes cada 48 h.
      NOTA: Los cambios de medios deben realizarse con cuidado para evitar dañar o aspirar los esferoides ENCC. Esto se logra mejor girando la placa en un movimiento circular para enfocar los esferoides en el centro del pozo, luego aspirando el medio desde el borde del pozo.
      La formación de esferoides ENCC suele completarse para el día 15, aunque es aceptable cultivarlos hasta el día 21 para adaptarse al momento ideal de cocultivo con los esferoides del intestino posterior medio.

3. Generación de HIO (fase esferoide del intestino medio posterior)

NOTA: Nuestro método para la generación de HIO es fundamentalmente el mismo que el protocolo original descrito en detalle por McCracken et al. y otros de los laboratorios de Spence y Wells ^6,7. El proceso ocurre en dos fases: la inducción definitiva del endodermo (DE) y la formación de esferoides en el intestino medio posterior.

1. Preparación para la generación de HIO
   1. Prepare una placa de 24 pocillos recubriendo cada pocillo deseado con una matriz de membrana basal 3D diluida en un medio de cultivo celular apropiado (el factor de dilución y las instrucciones para la preparación se encuentran en la hoja de datos del material). Cubra cada pocillo deseado con 500 μL por pocillo e incube a 37 °C durante al menos 1 h o toda la noche para que cuaje antes de las celdas de siembra.
      NOTA: Es importante mantener fría la matriz de la membrana basal mientras se trabaja, ya que la mayoría de las matrices comienzan a polimerizar a temperatura ambiente. Los pocillos recubiertos pueden utilizarse hasta 2-3 semanas cuando se almacenan a 37 °C. Almacene con suficiente diluyente para cubrir todo el pozo y evitar que el recubrimiento se seque.
      Planifique recubrir 6 pocillos de una placa de 24 pocillos por cada 1 pocillo de las placas de mantenimiento de hPSC de 6 pocillos descritas anteriormente. Esta relación puede ampliarse según se desee.
   2. Aspire el diluyente de todos los pocillos previamente recubiertos en un plato de 24 pocillos. Agregue suficientes medios de células madre calientes a la suspensión de células hPSC del paso 1.5 y distribuya 500 μL en cada pocillo (por ejemplo, si quedan 850 μL de suspensión de células hPSC después de pasar la placa de mantenimiento de hPSC, entonces para 6 pocillos de una placa de 24 pocillos, mezcle 2.150 μL de medios de células madre calientes con 850 μL de la suspensión de células hPSC del paso 1.5, y 500 μL distribuidos en cada uno de los 6 pocillos).
      NOTA: Como normalmente pasamos placas de mantenimiento de hPSC con volúmenes de 50-150 μL, normalmente tenemos volúmenes de 850-950 μL disponibles para este paso. Por lo tanto, el volumen de hPSCs por pocillo en la placa de 24 pocillos se aproxima a 150 μL/pocillo.
      Una vez que la placa de 24 pocillos recién preparada se haya colocado en la incubadora, agite suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás (de norte a sur y de este a oeste) para distribuir las celdas de la manera más uniforme posible por el fondo del pocillo.
   3. Mantener las celdas a 37 °C, 5% de CO₂. Cambie el medio cada dos días con 500 μL de medio de células madre por pocillo hasta que la confluencia alcance el 50-70%. Luego, la placa está lista para comenzar la inducción de DE.
      NOTA: Es fundamental que las células no alcancen una confluencia del >70% antes de la inducción de DE, ya que una mayor confluencia afecta negativamente a la densidad del endodermo y a la morfogénesis del intestino posterior en las etapas posteriores. Idealmente, las células alcanzan aproximadamente el 50-70% de confluencia después de 24-48 h en las proporciones de paso especificadas.
2. Inducción DE
   1. Día 1. Una vez que las hPSC hayan alcanzado el 50-70% de confluencia, aspire completamente los medios de células madre de cada pocillo y reemplácelos con 500 μL de medios DE calientes del Día 1 (Tabla 1) por pocillo. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h.
   2. Día 2. Aspire el DE del día 1 y reemplácelo con 500 μl de medio DE caliente del día 2 (Tabla 1) por pocillo. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h.
   3. Día 3. Aspire el DE del día 2 y reemplácelo con 500 μl de medio DE caliente del día 3 (Tabla 1) por pocillo. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h.
3. Formación de esferoides en el intestino medio posterior
   1. Días 4-8. Aspire completamente el medio de cada pocillo y reemplácelo con 500 μL de medio tibio del intestino medio posterior (MHGM, Tabla 1) por pocillo. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂. Repita este paso diariamente hasta el día 8, momento en el que los esferoides del intestino medio posterior están listos para la recolección y el cocultivo (Sección 4).

4. Cocultivo de esferoides del intestino medio posterior con ENCCs

NOTA: En la Figura 1 se proporciona un resumen gráfico de esta sección.

1. Preparación de la suspensión ENCC
   1. Recoja los esferoides ENCC de los días 15-21 del paso 2.4.4. retirando cuidadosamente el medio del pocillo, evitando aspirar los esferoides utilizando el método de remolino descrito en la nota para ese paso.
   2. Añada 1 mL de un reactivo de desprendimiento de células enzimáticas caliente al pocillo e incube a 37 °C durante 30 min.
   3. Golpee el lado de la placa para continuar disociando los esferoides y triture con una micropipeta P1000 con una punta de boca ancha pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper los grupos de células hasta que la mezcla sea homogénea.
   4. Transfiera la suspensión ENCC a un tubo cónico de 15 mL. Lave el pocillo con 1 mL de medio NCC tibio (ver Tabla 1) para recoger las células restantes y agréguelas al tubo cónico de 15 mL.
   5. Centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 1 min. Aspire el sobrenadante con una punta de pipeta estéril.
   6. Con una punta de pipeta de boca ancha, vuelva a suspender el pellet de celda en 1 ml de medio NCC tibio. Calcule la concentración de la suspensión de ENCC utilizando un hematitómetro o un contador de células.
2. Combinación de suspensión ENCC con esferoides del intestino medio posterior
   1. Recoja los esferoides del intestino medio posterior de todos los pocillos de una placa HIO con una punta de pipeta de boca ancha y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mL.
   2. Determine el número de pocillos de cocultivo que se utilizarán dentro de una placa de 24 pocillos. El objetivo es sembrar entre 10 y 30 esferoides del intestino medio posterior y entre 50.000 y 100.000 ENCC por pocillo para el cocultivo.
      NOTA: En la práctica, a menudo existe una relación uno a uno entre el número de pocillos con esferoides sanos y el número final de pocillos que se necesitarán para el cocultivo. También se puede utilizar un hemocitómetro para calcular la concentración de esferoides del intestino medio posterior recolectados.
   3. Agregue el volumen calculado de suspensión de ENCC para entregar 50,000-100,000 ENCC por pozo de cocultivo planificado al tubo cónico con los esferoides del intestino medio posterior. Triture suavemente con una punta de pipeta de boca ancha para mezclar uniformemente los esferoides del intestino medio posterior y los ENCC.
   4. Centrifugar a 300 × g durante 1 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una punta de pipeta estéril. Con una punta de pipeta de boca ancha, vuelva a suspender el pellet de celda en un volumen de matriz de membrana basal fría, sin fenol (transparente) y reducida en factor de crecimiento, igual a 30 μL por pocillo de cocultivo final.
      NOTA: Evite la formación de burbujas en la matriz transparente de la membrana basal durante la resuspensión, ya que son difíciles de eliminar, impedirán la imbibición adecuada de los medios por parte de los cocultivos HIO+ENCC y reducirán la visualización de los cocultivos HIO+ENCC a medida que crecen.
   5. En el centro de cada pozo seco, pipetear una gota de 30 μL de esferoides resuspendidos del intestino medio posterior + ENCC en una matriz de membrana basal clara sin ningún medio circundante. Una vez que todas las gotas estén depositadas en los pocillos, cubra e invierta la placa. Incubar invertido a 37 °C, 5% CO₂ durante 30 min.
      NOTA: Este paso da tiempo para que los esferoides del intestino posterior medio y los ENCC se desprendan de la parte inferior de la placa y se suspendan durante la polimerización de la matriz de membrana basal 3D clara.
3. In vitro Cocultura HIO+ENS
   1. Día 0: Una vez que la matriz transparente de la membrana basal se haya polimerizado, cubra cada gota con 500 μL de medio HIO cálido de día 0-3 (ver Tabla 1).
   2. Día 3: Aspire cuidadosamente el medio HIO de día 0-3 desde el costado del pocillo, sin alterar la gota clara de la matriz de la membrana basal. Sustituya el medio por 500 μL de medio HIO cálido de los días 3-14 (consulte la Tabla 1). Regrese la placa a la incubadora. En esta etapa, cambie los medios cada 3-4 días.
   3. Días 7-14: Continúe reemplazando los medios HIO de los días 3-14 según sea necesario cada 3-4 días y controle el crecimiento.
4. División de HIOs
   1. Día 14: Examine cada pocillo cuidadosamente bajo un microscopio y evalúe cuántos HIO + ENS en desarrollo hay en cada gota clara de la matriz de membrana basal en 3D.
   2. Prepare tubos de microcentrífuga de 2 ml con 30 μl de matriz de membrana basal transparente y manténgalos en hielo.
   3. Bajo una campana de flujo laminar, utilice pinzas finas para eliminar con cuidado la gota transparente de la matriz de la membrana basal 3D con el HIO+ENS suspendido. Separe suavemente HIO+ENS individuales.
      NOTA: Las lupas quirúrgicas o un microscopio de disección pueden ser muy útiles en esta etapa, pero no son estrictamente necesarios, ya que las HIO a menudo son muy visibles a simple vista.
   4. Coloque cada HIO + ENS aislado en uno de los tubos de microcentrífuga preparados que contengan 30 μL de matriz de membrana basal transparente utilizando pinzas o una punta de pipeta de boca ancha.
      NOTA: La matriz de membrana basal 3D clara y antigua no necesita licuarse ni disolverse en esta etapa. Evite interrumpir las HIO si es posible, aunque si esto ocurre, aún puede crecer en etapas posteriores.
   5. Repita el paso 4.2.5 para el HIO+ENS dividido y rechapado. Una vez polimerizadas las gotas transparentes de la membrana basal en 3D, agregue 500 μL de medios HIO de día 3-14 calientes y frescos a cada pocillo e incube durante la noche.
5. Continuación de la cocultura HIO+ENS
   1. Día 15: Aspire cuidadosamente los medios HIO de los días 3-14 desde el costado del pozo. Sustituya el medio por un medio HIO de 500 μL tibio para el día 15-28 (consulte la tabla 1).
   2. Día 15-40: Continúe reemplazando los medios HIO del día 15-28 según sea necesario cada 3-4 días y monitoree el crecimiento de HIO + ENCC.

Resultados

El SNE regula las funciones esenciales del intestino delgado maduro, incluida la peristalsis, la absorción de nutrientes, el transporte de líquidos y el mantenimiento de la barrera epitelial. Por lo tanto, el objetivo de inervar las IO es proporcionar a estas construcciones los elementos necesarios para desarrollar una funcionalidad más madura y de mayor nivel. Con este fin, nuestro laboratorio estudia específicamente el desarrollo del ENS dentro de las HIO, así como los resultados ...

Discusión

Las HIO se han utilizado como un sistema modelo para el desarrollo intestinal humano desde principios de la década de 2010 y se han vuelto cada vez más complejas desde entonces. Ahora es posible dotar a estos constructos de un ENS, lo que permite nuevas oportunidades en el estudio del desarrollo normal que pueden aplicarse a la comprensión y al tratamiento mejor de una serie de entidades gastrointestinales clínicas.

Trasplante in vivo<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)	ThermoFischer Scientific	11140050
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	12565269
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	ThermoFischer Scientific	12587010	For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	17504044	For HIO
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific	3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated	VWR	29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well	VWR	29442-042
Essential 6 Media	Thermo Fischer	A1516401
Essential 8 Media	Thermo Fischer	A2858501	Alternative stem cell media, used for ENCC plates.
Fine-tip forceps	Dumont	11223-20
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific	50145522
Gibco Advanced DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010
Gibco HEPES 1 M	ThermoFischer Scientific	15630-080
Gibco Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103-049
Glutagro, 200 mM, 100x	Corning	25-015-CI
Glutamax	ThermoFischer Scientific	35050061
H9 human ESC	Wicell International Stem Cell Bank	N/A
HyCloneTM FBS Defined	VWR	16777-002
LabGard Biological Safety Cabinet	Nuaire	Nu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356231	"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	"3D basement membrane matrix"
Micropipettes	Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)	2231300008
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	"stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance.
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048	For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)	Thermo Fisher	A1370701	For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope	Nikon	TS100
Noggin-conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFischer Scientific	15140-122
Recombinant Human Activin A	Cell Guidance Systems	GFH6-100
Recombinant Human BMP-4	Fisher Scientific	314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CF	ThermoFisher Scientific	236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein	ThermoFischer Scientific	233-FB-010
Recombinant Human FGF-4	Peprotech	100-31
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872	"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acid	SIGMA	R2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL	Thermo Scientific	AM12425
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer Scientific	11875093
R-Spondin conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
SB 431542, Tocris Bioscience	Fisher Scientific	16-141-0
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor Tips	VWR	89049-166
Stemolecule Chir99021 in Solution	Stemgent	04-0004-02
Sterile filter pipette tips	VWR (1000uL, 200uL, 10uL)	76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XF	Stem Cell Technologies	7180	Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates.