Inervação de organoides intestinais humanos

Resumo

Os organoides intestinais humanos devem ser inervados para melhor recapitular a estrutura e a função do intestino humano nativo. Aqui, apresentamos um método para incorporar um sistema nervoso entérico a essas construções.

Resumo

A complexidade da citoarquitetura e função intestinal apresenta desafios significativos para a criação do intestino delgado de bioengenharia. Técnicas para gerar organoides intestinais humanos (HIOs) semelhantes ao intestino delgado humano foram relatadas anteriormente. Os HIOs contêm epitélio e mesênquima, mas carecem de outros componentes críticos do intestino funcional, como o sistema nervoso entérico (SNE), células imunológicas, vasculatura e microbioma. Dois grupos de pesquisa independentes publicaram métodos distintos para inervar HIOs com um ENS. Aqui, discutimos um método único de incorporar o ENS em um intestino delgado de bioengenharia derivado de HIO, que utiliza componentes desses relatórios anteriores para otimizar a identidade da célula progenitora, bem como o tempo de desenvolvimento.

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são diferenciadas para gerar independentemente HIOs e células da crista neural entérica (ENCCs) por regulação temporal de marcadores de diferenciação durante um período de vários dias de acordo com os protocolos publicados. Uma vez que os HIOs atingem o estágio esferóide do intestino grosso médio (aproximadamente no dia 8), os esferoides ENCC do dia 15-21 são dissociados, co-cultivados com HIOs e suspensos em gotículas claras da matriz da membrana basal tridimensional (3D). As coculturas HIO + ENCC são mantidas in vitro por 28-40 dias antes do transplante em camundongos imunodeficientes de >9 semanas de idade para posterior desenvolvimento e maturação. Os HIOs transplantados (tHIOs) com ENS podem ser colhidos 4-20 semanas depois. Este método integra elementos de duas técnicas publicadas anteriormente, utilizando ENCCs gerados a partir de hPSCs e co-cultivando-os com HIOs em um estágio inicial de desenvolvimento para maximizar a exposição a pistas de desenvolvimento iniciais que provavelmente contribuem para a formação de uma morfologia intestinal mais madura.

Introdução

O intestino delgado humano é um órgão complexo e multicamadas que realiza inúmeras funções essenciais, como digestão, absorção de nutrientes, regulação de fluidos, função de barreira imunológica e motilidade. Numerosas doenças clínicas, como síndrome do intestino curto, enteropatias ou distúrbios de motilidade, são caracterizadas por redução crítica da massa intestinal ou interrupções da fisiologia normal, levando a morbidade e mortalidade significativas 1,2,3,4. As opções de tratamento atuais geralmente incluem cirurgia para remover o intestino disfuncional ao custo da diminuição do comprimento intestinal e, portanto, da capacidade funcional do intestino remanescente⁵. Há uma necessidade de terapias regenerativas de natureza aditiva, aumentando a capacidade intestinal funcional e restaurando a função intestinal de maneiras que os paradigmas terapêuticos atuais são incapazes de alcançar.

O intestino delgado de bioengenharia é uma solução promissora para esses desafios. Os organoides intestinais humanos (HIOs) derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são um material de partida para o intestino delgado de bioengenharia. Em 2011, Spence et al. relataram pela primeira vez a criação bem-sucedida de HIOs modernos a partir de linhas de hPSC, incluindo células-tronco embrionárias humanas H1 e H9 (hESC) e múltiplas linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) ^6,7. Seu protocolo incluiu uma série cuidadosamente cronometrada de incubações com fatores de crescimento específicos para imitar o desenvolvimento intestinal fetal humano. A ativina A, uma molécula de sinalização de TGFβ, impulsiona a diferenciação de hPSC em direção ao destino endodérmico, seguida por padronização posterior direcionada com Wnt / FGF. Nessas condições, as hPSCs se auto-organizam para formar esferoides intestinais contendo epitélio polarizado e mesênquima. A cultura 3D dentro de uma matriz de membrana basal permite o desenvolvimento adicional, resultando em organoides com lúmen interno, involuções de epitélio semelhantes a vilosidades e nichos de células progenitoras auto-regeneradoras dentro de estruturas semelhantes a criptas.

Embora os HIOs gerados usando este protocolo original de 2011 se assemelhem estruturalmente ao intestino nativo, eles não têm a capacidade de gerar os neurônios ou glia do sistema nervoso entérico (ENS). Em 2017, dois artigos importantes descreveram métodos semelhantes, mas distintos, de inervação de HIOs. Os progenitores ENS (células da crista neural entérica, ENCCs) podem ser derivados de hPSCs. Em cultura, os ENCCs formam neuroesferas 3D, que podem se diferenciar em neurônios entéricos e glia sob condições apropriadas. Workman e Mahe et al. modificaram um protocolo existente para derivar ENCCs de hPSCs e os trataram com meio enriquecido com FGF seguido de ácido retinóico por 2 dias para posterior As neuroesferas do dia 6 foram incubadas por mais 4 dias sem AR, e então as células migradas foram coletadas após o descolamento enzimático. Aproximadamente 20.000-50.000 ENCCs foram agregados com esferóides iniciais do intestino médio e esses esferóides intestinais semeados por ENCC foram cultivados in vitro em uma matriz de membrana basal 3D transparente por 28 dias até o enxerto in vivo na cápsula renal de camundongos imunodeficientes por 6-10 semanas. O HIO + ENS resultante demonstrou maturação significativa dos componentes epiteliais e mesenquimais, bem como estruturas neurogliais semelhantes aos gânglios, embora com menor densidade do corpo celular do que o intestino nativo, ausência de certos subtipos neuronais clinicamente relevantes (ou seja, neurônios positivos para CHAT em HIO + ENS após o transplante) e características gerais semelhantes às fetais.

No mesmo ano, Schlieve et al. publicaram um método alternativo envolvendo uma mistura de 40-60 neuroesferas ENCC intactas do dia 15 com HIOs mais maduras no momento do transplante in vivo no omento de camundongos imunodeficientes por 3 meses sem co-cultura in vitro prévia¹⁰. Suas construções, chamadas ENCC-HIO-TESI (intestino delgado de engenharia de tecidos), pareciam conter um fenótipo ENS mais maduro do que o HIO + ENS de Workman e Mahe, com maior diversidade de subtipos neuronais e conexões sinápticas neuroepiteliais não vistas em HIO + ENS. É importante ressaltar que os ENCCs usados nos experimentos de Schlieve foram derivados por meio de um método diferente, conforme descrito anteriormente por Fattahi et ^al.11. Resumidamente, as hPSCs (hESCs e hiPSCs) foram submetidas à indução da crista neural em meio enriquecido com FGF2. Essas células também foram tratadas com AR para estabelecer um destino vagal entérico, mas por 5 dias (dias 6-11), um aumento em relação aos 2 dias de Workman e Mahe (dia 4-5). Em 2019, Barber et al. publicaram uma versão revisada do protocolo de Fattahi, incluindo uma descrição mais completa das condições de cultura e uma transição para meios basais definidos para reduzir a inconsistência e refletir as mudanças nas preferências de cultura de células na época¹².

Nosso método para inervar HIOs, descrito em detalhes abaixo, incorpora elementos dos protocolos Workman/Mahe e Schlieve. Enquanto o ENS no ENCC-HIO-TESI de Schlieve parecia mais maduro com maior diversidade neuronal e integração neuroglial, ambos os métodos integraram com sucesso um ENS funcional nos HIOs com alterações demonstradas na expressão transcricional gastrointestinal. O HIO + ENS de Workman e Mahe induziu aumento da expressão de vários genes relacionados às células-tronco intestinais e ao desenvolvimento de células epiteliais, que não foram alterados no ENCC-HIO-TESI. Uma possível explicação para essas distinções são os diferentes pontos de tempo em que ENCCs e HIOs foram combinados entre os protocolos. Nosso laboratório observou que a cocultura precoce resulta no aumento da expressão de vários genes envolvidos na diferenciação epitelial e mesenquimal, e o tempo da cocultura influencia a diversidade de células epiteliais (dados não publicados). É possível que a exposição precoce de precursores do ENS ao desenvolvimento de HIOs e vice-versa forneça tempo para diafonia de sinalização ainda indefinida que promove a diversidade epitelial e outros processos iniciais de desenvolvimento.

Protocolo

A linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC) foi obtida da WiCell (Madison, WI) e todos os experimentos envolvendo hESCs foram aprovados pelo Comitê de Supervisão de Pesquisa de Células-Tronco (SCRO) da UTHealth Houston (protocolo #SCRO-23-01). Para este protocolo, todas as referências a placas ou poços revestidos referem-se àqueles preparados com matriz de membrana basal 3D qualificada para hESC.

1. Preparação da cultura celular

NOTA: Nosso laboratório usa hESCs H9, mas várias linhas de hPSC foram usadas com sucesso por outros laboratórios para gerar HIOs e ENCCs, incluindo H9 hESCs ^9,10,12, H1 hESCs⁹, linha hESC UCSF4¹² e várias linhas hiPSC, como WTC11¹², WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f⁹, WTC10 ^9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)⁹ e WTC10 PHOX2B nulo (Y14X/Y14X)⁹.

1. Prepare uma placa de 6 poços revestindo cada poço desejado com uma matriz de membrana basal 3D diluída em um meio de cultura celular apropriado (o fator de diluição e as instruções de preparação são encontrados na folha de dados do material). Cubra cada poço desejado com 1 mL por poço e incube a 37 ° C por pelo menos 1 h ou durante a noite para endurecer antes de plaquear as células.
   NOTA: Este protocolo pode ser concluído com células de apenas um poço ou ampliado conforme necessário. Recomendamos revestir pelo menos três poços para começar a facilitar a passagem adicional e a manutenção de hPSCs indiferenciadas.
   É importante manter a matriz da membrana basal fria durante o trabalho, pois a maioria das matrizes começa a polimerizar à temperatura ambiente. Os poços revestidos podem ser usados por até 2-3 semanas quando armazenados a 37 °C. Armazene com diluente adequado para cobrir todo o poço para evitar que o revestimento seque.
2. Descongele os hPSCs (idealmente um número de passagem baixo) girando brevemente em um banho de água morna. Sob uma capela de fluxo laminar, ressuspenda um frasco de células em 2 mL de meio de células-tronco (Tabela 1). Aspire o diluente de um poço previamente revestido em um prato de 6 poços imediatamente antes de plaquear as células e, em seguida, transfira todos os 2 mL de células ressuspensas para o poço revestido. Para manutenção de hPSCs indiferenciados (chamados de placas de manutenção), incube a 37 ° C, 5% de CO₂ e troque o meio a cada dois dias com 2 mL de meio de células-tronco por poço.
3. Passe as células quando atingirem 70-80% de confluência. Aspire o meio do lado do poço sem perturbar as células. Adicione 1 mL de reagente de dissociação de células-tronco em temperatura ambiente ao poço e aspire-o em 1 min, deixando uma fina película de líquido sobre as células. Incubar a placa durante 5 min a 37 °C.
   NOTA: Esperar até que as células ultrapassem 80% da confluência para a passagem pode causar problemas de diferenciação prematura, o que reduzirá o rendimento nas etapas subsequentes.
4. Adicione 1 mL por poço de meio de células-tronco quente e bata na lateral da placa para desalojar as colônias. Pipete suavemente o meio usando uma micropipeta P1000 com uma ponta de pipeta de boca larga (consulte a Tabela de Materiais) para quebrar as colônias e minimizar os danos às células.
   NOTA: Ao triturar a suspensão celular, recomenda-se quebrar grandes aglomerados de células, mas permitir que aglomerados menores permaneçam intactos. Não é recomendado alcançar uma suspensão unicelular, mas sim buscar menos colônias menores espalhadas uniformemente por todo o poço.
5. Aspire o diluente de um poço previamente revestido em uma placa de 6 poços e adicione 2 mL de meio de células-tronco quente. Transfira o volume desejado da suspensão celular para este poço para manter as colônias de hPSC, trocando o meio a cada dois dias com 2 mL de meio de células-tronco por poço.
   NOTA: Nosso laboratório normalmente transfere volumes entre 50-150 μL para permitir a passagem de placas de manutenção de hPSC uma vez por semana. Esse volume pode variar com a linha específica de hPSC e o número de passagem e, portanto, pode exigir ajuste. Use as células restantes para iniciar a geração de ENCC (Seção 2) ou HIO (Seção 3). Os hPSCs recém-descongelados devem ser passados pelo menos duas vezes antes de avançar para a geração de ENCC ou HIO.

2. Geração ENCC

NOTA: Nosso método para geração de ENCC segue de perto o descrito pelo laboratório de Fattahi e usado por Schlieve et ^al.10. Utilizamos uma versão ligeiramente modificada da opção B do protocolo por meio das seções "Indução da Crista Neural Entérica (ENC) (Dias 0-12)" e "Formação de Esferóides ENCC (Dia 12-15)" em Barber et ^al.10,12.

1. Aspire o diluente de um poço previamente revestido em um novo prato de 6 poços e adicione 2 mL de meio de células-tronco quente. Transfira 850 μL de suspensão de células hPSC da etapa 1,5 para o mesmo poço (normalmente uma taxa de passagem de 5:6).
2. Mantenha as células a 37 °C, 5% de CO₂. Troque o meio a cada dois dias com 2 mL de meio de células-tronco por poço até que a confluência atinja 60-80%. Em seguida, a placa está pronta para iniciar a indução do ENC.
3. Indução ENC
   1. Dia 0. Aspire o meio do lado do poço e adicione 2 mL de meio quente de coquetel A (Tabela 1). Retorno à incubadora por 48 h.
   2. Dia 2. Aspire o meio Cocktail A do lado do poço e substitua por 2 mL de meio quente Cocktail B (Tabela 1). Retorno à incubadora por 48 h.
   3. Dia 4. Aspire o meio Cocktail B da lateral do poço e substitua por 2 mL de meio Cocktail B fresco e quente. Retorno à incubadora por 48 h.
   4. Dias 6-12. Aspire o meio Cocktail B da lateral do poço e substitua por 2 mL de meio quente Cocktail C (Tabela 1). Retorne à incubadora e substitua o meio por 2 mL de Cocktail C fresco e quente a cada 48 h até a conclusão da indução do ENC no dia 12.
      NOTA: Nesta fase, as linhagens ENC podem ser confirmadas pela análise da expressão gênica, conforme descrito por Barber et ^al.12.
4. Formação de esferóides ENCC
   1. Dia 13. Aspire o coquetel C do lado do poço. Adicione 1 ml de um reagente enzimático de descolamento de células quente e incube a 37 °C durante 30 min. Bata na lateral da placa para desalojar as células e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL usando uma ponta de pipeta de boca larga. Lave o poço com 1 mL de meio de Neural Crest Cell (NCC) (Tabela 1) e adicione as lavagens ao tubo cônico de 15 mL.
   2. Centrifugue a suspensão celular no tubo cónico de 15 ml a 300 × g durante 1 min. Aspire o sobrenadante. Ressuspenda suavemente o pellet em 2 mL de meio NCC quente.
   3. Adicionar as células ressuspensas a um novo alvéolo não revestido de uma placa de ligação ultrabaixa e incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 48 h.
   4. Dias 15-21. Monitore o crescimento de esferoides ENCC e substitua o meio por 2 mL de meio NCC fresco e quente a cada 48 h.
      NOTA: As mudanças de mídia devem ser realizadas com cuidado para evitar danificar ou aspirar os esferóides ENCC. Isso é melhor realizado girando a placa em um movimento circular para focar os esferoides no meio do poço e, em seguida, aspirando o meio da borda do poço.
      A formação de esferóides ENCC é normalmente concluída no dia 15, embora seja aceitável cultivá-los até o dia 21 para acomodar o momento ideal de cocultura com esferoides do intestino médio.

3. Geração de HIO (fase esferóide do intestino grosso)

NOTA: Nosso método para geração de HIO é fundamentalmente o mesmo que o protocolo original descrito em detalhes por McCracken et al. e outros dos laboratórios Spence e Wells ^6,7. O processo ocorre em duas fases: indução definitiva do endoderme (DE) e formação do esferóide do intestino médio.

1. Preparação para a geração de HIO
   1. Prepare uma placa de 24 poços revestindo cada poço desejado com uma matriz de membrana basal 3D diluída em um meio de cultura de células apropriado (o fator de diluição e as instruções de preparação são encontrados na folha de dados do material). Cubra cada poço desejado com 500 μL por alvéolo e incube a 37 ° C por pelo menos 1 h ou durante a noite para endurecer antes de plaquear as células.
      NOTA: É importante manter a matriz da membrana basal fria durante o trabalho, pois a maioria das matrizes começa a polimerizar à temperatura ambiente. Os poços revestidos podem ser usados por até 2-3 semanas quando armazenados a 37 °C. Armazene com diluente suficiente para cobrir todo o poço para evitar que o revestimento seque.
      Planeje revestir 6 poços de uma placa de 24 poços para cada 1 poço das placas de manutenção hPSC de 6 poços descritas acima. Essa proporção pode ser ampliada conforme desejado.
   2. Aspire o diluente de todos os poços previamente revestidos em um prato de 24 poços. Adicione meio de células-tronco quente suficiente à suspensão de células hPSC da etapa 1.5 e distribua 500 μL em cada poço (por exemplo, se 850 μL de suspensão de células hPSC forem deixados após passar pela placa de manutenção hPSC, então para 6 poços de uma placa de 24 poços, misture 2.150 μL de meio de células-tronco quentes com 850 μL da suspensão de células hPSC da etapa 1.5, e 500 μL distribuídos em cada um dos 6 poços).
      NOTA: Como normalmente passamos placas de manutenção hPSC com volumes de 50-150 μL, geralmente temos volumes de 850-950 μL disponíveis para esta etapa. Assim, o volume de hPSCs por poço na placa de 24 poços se aproxima de 150 μL/poço.
      Uma vez que a placa de 24 poços recém-preparada tenha sido colocada na incubadora, agite suavemente a placa para frente e para trás (norte a sul e leste a oeste) para distribuir as células o mais uniformemente possível pelo fundo do poço.
   3. Mantenha as células a 37 °C, 5% de CO₂. Troque o meio a cada dois dias com 500 μL de meio de células-tronco por poço até que a confluência atinja 50-70%. Em seguida, a placa está pronta para iniciar a indução de DE.
      NOTA: É fundamental que as células não atinjam >70% de confluência antes da indução de DE, pois uma confluência mais alta afeta adversamente a densidade da endoderme e a morfogênese do intestino grosso nos estágios subsequentes. Idealmente, as células atingem aproximadamente 50-70% de confluência após 24-48 h nas taxas de passagem especificadas.
2. Indução DE
   1. Dia 1. Assim que as hPSCs atingirem 50-70% de confluência, aspire completamente o meio de células-tronco de cada poço e substitua por 500 μL de meio DE quente do Dia 1 (Tabela 1) por poço. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 24 h.
   2. Dia 2. Aspire o DE Dia 1 e substitua por 500 μL de meio DE quente de Dia 2 (Tabela 1) por poço. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 24 h.
   3. Dia 3. Aspire o DE Dia 2 e substitua por 500 μL de meio quente de DE Dia 3 (Tabela 1) por poço. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 24 h.
3. Formação esferóide do intestino médio
   1. Dias 4-8. Aspire completamente o meio de cada poço e substitua por 500 μL de meio quente do intestino médio (MHGM, Tabela 1) por poço. Incubar a 37 °C, 5% CO₂. Repita esta etapa diariamente até o dia 8, quando os esferoides do intestino grosso estão prontos para coleta e cocultura (Seção 4).

4. Co-cultura de esferoides do intestino médio com ENCCs

NOTA: Um resumo gráfico desta seção é fornecido na Figura 1.

1. Preparação da suspensão ENCC
   1. Colete os esferóides ENCC do dia 15-21 da etapa 2.4.4. removendo cuidadosamente o meio do poço, evitando aspirar os esferóides usando o método de redemoinho descrito na nota para essa etapa.
   2. Adicione 1 ml de um reagente de descolamento de células enzimáticas quentes ao poço e incube a 37 °C durante 30 min.
   3. Bata na lateral da placa para continuar dissociando os esferóides e triture com uma micropipeta P1000 com uma ponta de boca larga, pipetando suavemente para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células até que a mistura fique homogênea.
   4. Transfira a suspensão ENCC para um tubo cônico de 15 mL. Lave o poço com 1 mL de meio NCC quente (consulte a Tabela 1) para coletar as células restantes e adicione-o ao tubo cônico de 15 mL.
   5. Centrifugar a suspensão celular a 300 × g durante 1 min. Aspirar o sobrenadante com uma ponta de pipeta estéril.
   6. Usando uma ponta de pipeta de boca larga, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio NCC quente. Calcular a concentração da suspensão ENCC utilizando um hemacitómetro ou um contador de células.
2. Combinando a suspensão ENCC com esferoides do intestino médio
   1. Colete os esferóides do intestino grosso de todos os poços de uma placa HIO usando uma ponta de pipeta de boca larga e transfira para um tubo cônico de 15 mL.
   2. Determine o número de poços de cocultura que serão usados dentro de uma placa de 24 poços. Procure plaquear 10-30 esferóides do intestino médio e 50.000-100.000 ENCCs por poço para cocultura.
      NOTA: Na prática, muitas vezes há uma relação de um para um entre o número de poços com esferoides saudáveis e o número final de poços que serão necessários para a cocultura. Um hemocitômetro também pode ser utilizado para calcular a concentração de esferóides do intestino médio coletados.
   3. Adicione o volume calculado de suspensão ENCC para fornecer 50.000-100.000 ENCCs por poço de cocultura planejado ao tubo cônico com os esferoides do intestino médio. Triturar suavemente com uma ponta de pipeta de boca larga para misturar uniformemente os esferoides do intestino médio e os ENCCs.
   4. Centrifugue a 300 × g durante 1 min e aspire cuidadosamente o sobrenadante com uma ponta de pipeta estéril. Usando uma ponta de pipeta de boca larga, ressuspenda o pellet celular em um volume de matriz de membrana basal fria, sem fenol (transparente) e com fator de crescimento reduzido, igual a 30 μL por poço de cocultura final.
      NOTA: Evite formar bolhas na matriz transparente da membrana basal durante a ressuspensão, pois elas são difíceis de remover, impedirão a embebição adequada do meio pelas coculturas HIO+ENCC e reduzirão a visualização das coculturas HIO+ENCC à medida que crescem.
   5. Para o centro de cada poço seco, pipete uma gota de 30 μL de esferóides do intestino médio + ENCCs ressuspensos em uma matriz de membrana basal transparente sem nenhum meio circundante. Depois que todas as gotículas estiverem depositadas nos poços, cubra e inverta a placa. Incubar invertido a 37 °C, 5% CO₂ por 30 min.
      NOTA: Esta etapa dá tempo para que os esferoides do intestino médio e os ENCCs caiam do fundo da placa e fiquem suspensos durante a polimerização da matriz transparente da membrana basal 3D.
3. In vitro Cocultura HIO+ENS
   1. Dia 0: Uma vez que a matriz da membrana basal transparente tenha polimerizado, cubra cada gota em 500 μL de meio HIO quente do Dia 0-3 (consulte a Tabela 1).
   2. Dia 3: Aspire cuidadosamente o meio HIO do dia 0-3 da lateral do poço, sem perturbar a gota transparente da matriz da membrana basal. Substitua o meio por 500 μL de meio HIO quente do dia 3-14 (consulte a Tabela 1). Retorne a placa para a incubadora. Nesta fase, mude a mídia a cada 3-4 dias.
   3. Dias 7-14: Continue substituindo a mídia HIO do dia 3-14 conforme necessário a cada 3-4 dias e monitore o crescimento.
4. Divisão de HIOs
   1. Dia 14: Examine cada poço cuidadosamente ao microscópio e avalie quantos HIO + ENS em desenvolvimento estão em cada gotícula transparente da matriz da membrana basal 3D.
   2. Prepare 2 mL de tubos de microcentrífuga com 30 μL de matriz de membrana basal transparente e mantenha-os no gelo.
   3. Sob uma capa de fluxo laminar, use uma pinça fina para remover cuidadosamente a gota transparente da matriz da membrana basal 3D com o HIO+ENS suspenso. Separe suavemente o HIO+ENS individual.
      NOTA: Lupas cirúrgicas ou um microscópio de dissecação podem ser muito úteis nesta fase, mas não são estritamente necessários, pois os HIOs costumam ser grosseiramente visíveis a olho nu.
   4. Coloque cada HIO + ENS isolado em um dos tubos de microcentrífuga preparados contendo 30 μL de matriz de membrana basal transparente usando uma pinça ou uma ponta de pipeta de boca larga.
      NOTA: A matriz de membrana do embasamento 3D transparente antiga não precisa ser liquefeita ou dissolvida neste estágio. Evite interromper os HIOs, se possível, embora se isso ocorrer, ainda possa crescer em estágios posteriores.
   5. Repita a etapa 4.2.5 para o HIO+ENS dividido e revestido. Depois que as gotículas transparentes da membrana do embasamento 3D forem polimerizadas, adicione 500 μL de meio HIO quente e fresco do Dia 3-14 a cada poço e incube durante a noite.
5. Cocultura HIO+ENS continuada
   1. Dia 15: Aspire cuidadosamente o meio HIO do dia 3-14 do lado do poço. Substitua o meio por 500 μL de meio HIO quente do dia 15-28 (consulte a Tabela 1).
   2. Dia 15-40: Continue substituindo a mídia HIO do dia 15-28 conforme necessário a cada 3-4 dias e monitorando o crescimento de HIO + ENCC.

Resultados

O ENS regula as funções essenciais do intestino delgado maduro, incluindo peristaltismo, absorção de nutrientes, transporte de fluidos e manutenção da barreira epitelial. Assim, o objetivo de inervar os HIOs é fornecer a essas construções os elementos necessários para desenvolver uma funcionalidade mais madura e de nível superior. Para esse fim, nosso laboratório estuda especificamente o desenvolvimento do ENS dentro dos HIOs, bem como os resultados funcionais em diferentes e...

Discussão

Os HIOs têm sido usados como um sistema modelo para o desenvolvimento intestinal humano desde o início dos anos 2010 e tornaram-se cada vez mais complexos desde então. Agora é possível fornecer a esses construtos um ENS, permitindo novas oportunidades no estudo do desenvolvimento normal que podem ser aplicadas para entender e tratar melhor uma série de entidades gastrointestinais clínicas.

Transplante in vivo <...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)	ThermoFischer Scientific	11140050
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	12565269
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	ThermoFischer Scientific	12587010	For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	17504044	For HIO
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific	3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated	VWR	29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well	VWR	29442-042
Essential 6 Media	Thermo Fischer	A1516401
Essential 8 Media	Thermo Fischer	A2858501	Alternative stem cell media, used for ENCC plates.
Fine-tip forceps	Dumont	11223-20
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific	50145522
Gibco Advanced DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010
Gibco HEPES 1 M	ThermoFischer Scientific	15630-080
Gibco Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103-049
Glutagro, 200 mM, 100x	Corning	25-015-CI
Glutamax	ThermoFischer Scientific	35050061
H9 human ESC	Wicell International Stem Cell Bank	N/A
HyCloneTM FBS Defined	VWR	16777-002
LabGard Biological Safety Cabinet	Nuaire	Nu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356231	"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	"3D basement membrane matrix"
Micropipettes	Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)	2231300008
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	"stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance.
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048	For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)	Thermo Fisher	A1370701	For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope	Nikon	TS100
Noggin-conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFischer Scientific	15140-122
Recombinant Human Activin A	Cell Guidance Systems	GFH6-100
Recombinant Human BMP-4	Fisher Scientific	314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CF	ThermoFisher Scientific	236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein	ThermoFischer Scientific	233-FB-010
Recombinant Human FGF-4	Peprotech	100-31
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872	"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acid	SIGMA	R2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL	Thermo Scientific	AM12425
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer Scientific	11875093
R-Spondin conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
SB 431542, Tocris Bioscience	Fisher Scientific	16-141-0
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor Tips	VWR	89049-166
Stemolecule Chir99021 in Solution	Stemgent	04-0004-02
Sterile filter pipette tips	VWR (1000uL, 200uL, 10uL)	76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XF	Stem Cell Technologies	7180	Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates.