Innervation des organoïdes intestinaux humains

Résumé

Les organoïdes intestinaux humains doivent être innervés pour mieux récapituler la structure et la fonction de l’intestin humain natif. Ici, nous présentons une méthode pour incorporer un système nerveux entérique dans ces constructions.

Résumé

La complexité de la cytoarchitecture et de la fonction intestinales pose des défis importants pour la création de l’intestin grêle issu de la bio-ingénierie. Des techniques de génération d’organoïdes intestinaux humains (HIO) ressemblant à l’intestin grêle humain ont déjà été signalées. Les HIO contiennent de l’épithélium et du mésenchyme, mais manquent d’autres composants essentiels de l’intestin fonctionnel, tels que le système nerveux entérique (SNE), les cellules immunitaires, le système vasculaire et le microbiome. Deux groupes de recherche indépendants ont publié des méthodes distinctes pour innerver les HIO avec un ENS. Nous discutons ici d’une méthode unique d’incorporation de l’ENS dans un intestin grêle bio-modifié dérivé de HIO, qui utilise des composants de ces rapports antérieurs pour optimiser l’identité des cellules progénitrices ainsi que le calendrier de développement.

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sont différenciées pour générer indépendamment des HIO et des cellules entériques de la crête neurale (ENCC) par régulation temporelle des marqueurs de différenciation sur une période de plusieurs jours selon les protocoles publiés. Une fois que les HIO atteignent le stade des sphéroïdes de l’intestin postérieur moyen (environ le jour 8), les sphéroïdes ENCC des jours 15 à 21 sont dissociés, co-cultivés avec les HIO et suspendus dans des gouttelettes de matrice de membrane basale tridimensionnelles (3D) claires. Les co-cultures HIO + ENCC sont conservées in vitro pendant 28 à 40 jours avant d’être transplantées chez des souris immunodéficientes âgées de >9 semaines pour un développement et une maturation ultérieurs. Les HIO transplantés (tHIOs) avec ENS peuvent être récoltés 4 à 20 semaines plus tard. Cette méthode intègre des éléments de deux techniques publiées précédemment en utilisant des ENCC générés à partir de hPSC et en les co-cultivant avec des HIO à un stade précoce du développement afin de maximiser l’exposition aux signaux de développement précoces qui contribuent probablement à la formation d’une morphologie intestinale plus mature.

Introduction

L’intestin grêle humain est un organe complexe et multicouche qui remplit de nombreuses fonctions essentielles telles que la digestion, l’absorption des nutriments, la régulation des fluides, la fonction de barrière immunitaire et la motilité. De nombreuses maladies cliniques, telles que le syndrome de l’intestin court, les entéropathies ou les troubles de la motilité, sont caractérisées par une réduction critique de la masse intestinale ou des perturbations de la physiologie normale entraînant une morbidité et une mortalité importantes 1,2,3,4. Les options de traitement actuelles comprennent souvent une intervention chirurgicale pour enlever l’intestin dysfonctionnel au prix d’une diminution de la longueur de l’intestin et, par conséquent, de la capacité fonctionnelle de l’intestin restant⁵. Il est nécessaire de mettre en place des thérapies régénératives de nature additive, qui augmentent la capacité intestinale fonctionnelle et restaurent la fonction intestinale d’une manière que les paradigmes thérapeutiques actuels ne sont pas en mesure de faire.

La bio-ingénierie de l’intestin grêle est une solution prometteuse à ces défis. Les organoïdes intestinaux humains (HIO) dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sont un matériau de départ pour l’intestin grêle issu de la bio-ingénierie. En 2011, Spence et al. ont signalé pour la première fois la création réussie de HIO modernes à partir de lignées de hPSC, y compris les lignées^H1 et H9 de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et les lignées ^6,7 multiples de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Leur protocole comprenait une série d’incubations soigneusement chronométrées avec des facteurs de croissance spécifiques pour imiter le développement intestinal du fœtus humain. L’activine A, une molécule de signalisation TGFβ, entraîne la différenciation des hPSC vers le devenir endodermique, suivie d’une structuration postérieure dirigée avec Wnt/FGF. Dans ces conditions, les hPSC s’auto-organisent pour former des sphéroïdes intestinaux contenant un épithélium polarisé et un mésenchyme. La culture 3D dans une matrice de membrane basale permet un développement supplémentaire, ce qui permet d’obtenir des organoïdes avec une lumière interne, des involutions de l’épithélium semblables à des villosités et des niches cellulaires progénitrices auto-régénérantes dans des structures de type crypte.

Bien que les HIO générés à l’aide de ce protocole original de 2011 ressemblent structurellement à l’intestin natif, ils n’ont pas la capacité de générer les neurones ou la glie du système nerveux entérique (SNE). En 2017, deux articles importants décrivaient des méthodes similaires, mais distinctes, pour innerver les DOI. Les progéniteurs de l’ENS (cellules entériques de la crête neurale, ENCCs) peuvent être dérivés des hPSC. En culture, les ENCC forment des neurosphères 3D, qui peuvent se différencier en neurones entériques et en cellules gliales dans des conditions appropriées. Workman et Mahe et al. ont modifié un protocole existant pour dériver les ENCC à partir des hPSC et les ont traités avec un milieu enrichi en FGF suivi d’acide rétinoïque pendant 2 jours pour la postériorisation et la promotion du devenir vagal ^8,9. Les neurosphères du jour 6 ont été incubées pendant 4 jours supplémentaires sans PR, puis les cellules migrées ont été collectées après détachement enzymatique. Environ 20 000 à 50 000 ENCC ont été agrégés avec des sphéroïdes précoces de l’intestin moyen et ces sphéroïdes intestinaux ensemencés par ENCC ont été cultivés in vitro dans une matrice de membrane basale 3D transparente pendant 28 jours jusqu’à une greffe in vivo dans la capsule rénale de souris immunodéficientes pendant 6 à 10 semaines. Le HIO + ENS qui en a résulté a montré une maturation significative des composants épithéliales et mésenchymateux ainsi que des structures neurogliales similaires aux ganglions, bien qu’avec une densité corporelle cellulaire inférieure à celle de l’intestin natif, l’absence de certains sous-types neuronaux cliniquement pertinents (c’est-à-dire des neurones positifs au CHAT dans HIO + ENS après la transplantation) et des caractéristiques globales semblables à celles du fœtus.

La même année, Schlieve et al. ont publié une méthode alternative impliquant un mélange de 40 à 60 neurosphères ENCC intactes, jour 15, avec des HIO plus matures au moment de la transplantation in vivo dans l’épiploon de souris immunodéficientes pendant 3 mois sans co-culture in vitro préalable¹⁰. Leurs constructions, appelées ENCC-HIO-TESI (tissue-engineered small intestine), semblaient contenir un phénotype ENS plus mature que celui de HIO + ENS de Workman et Mahe, avec une plus grande diversité de sous-types neuronaux et des connexions synaptiques neuroépithéliales non observées dans HIO + ENS. Il est important de noter que les ENCC utilisés dans les expériences de Schlieve ont été dérivés via une méthode différente, comme décrit précédemment par Fattahi et ^al.11. En bref, les hPSC (hESCs et hiPSCs) ont subi une induction de crête neurale dans des milieux enrichis par FGF2. Ces cellules ont également été traitées avec la PR pour établir un devenir vagal entérique, mais pendant 5 jours (jours 6 à 11), une augmentation par rapport aux 2 jours de Workman et Mahe (jours 4 et 5). En 2019, Barber et al. ont publié une version révisée du protocole de Fattahi comprenant une description plus approfondie des conditions de culture et une transition vers des milieux basaux définis pour réduire les incohérences et refléter l’évolution des préférences en matière de culture cellulaire à l’époque¹².

Notre méthode d’innervation des DOI, décrite en détail ci-dessous, intègre des éléments des protocoles Workman/Mahé et Schlieve. Alors que le SNE dans l’ENCC-HIO-TESI de Schlieve semblait plus mature avec une plus grande diversité neuronale et une plus grande intégration neurogliale, les deux méthodes ont réussi à intégrer un SNE fonctionnel dans les HIO avec des changements démontrés dans l’expression transcriptionnelle gastro-intestinale. L’étude HIO + ENS de Workman et Mahe a induit une expression accrue de plusieurs gènes liés aux cellules souches intestinales et au développement des cellules épithéliales, qui n’ont pas été modifiés dans ENCC-HIO-TESI. Une explication possible de ces distinctions est la différence entre les différents moments où les CENC et les DOI ont été combinés entre les protocoles. Notre laboratoire a observé que la coculture précoce entraîne l’expression accrue de plusieurs gènes impliqués dans la différenciation épithéliale et mésenchymateuse, et que le moment de la coculture influence la diversité des cellules épithéliales (données non publiées). Il est possible qu’une exposition plus précoce des précurseurs du SNE aux HIO en développement et vice versa donne du temps pour une diaphonie de signalisation encore indéfinie qui favorise la diversité épithéliale et d’autres processus de développement précoces.

Protocole

La lignée H9 de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) provient de WiCell (Madison, WI) et toutes les expériences impliquant des CSEh ont été approuvées par le comité de surveillance de la recherche sur les cellules souches (SCRO) de l’UTHealth Houston (protocole #SCRO-23-01). Pour ce protocole, toutes les références aux plaques ou puits revêtus se réfèrent à ceux préparés avec une matrice de membrane basale 3D qualifiée hESC.

1. Préparation de la culture cellulaire

REMARQUE : Notre laboratoire utilise des hESC H9, mais plusieurs lignes hPSC ont été utilisées avec succès par d’autres laboratoires pour générer des HIO et des ENCC, y compris les hESCs H9^{9, 10, 12}, H1 hESC⁹, la ligne hESC UCSF4¹², et plusieurs raies hiPSC telles que WTC11¹², WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f⁹, WTC10 ^9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)⁹ et WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)⁹.

1. Préparez une plaque à 6 puits en enrobant chaque puits souhaité d’une matrice de membrane basale 3D diluée dans un milieu de culture cellulaire approprié (le facteur de dilution et les instructions de préparation se trouvent dans la fiche technique du matériau). Enduire chaque puits désiré avec 1 mL par puits et incuber à 37 °C pendant au moins 1 h ou toute la nuit pour prendre avant de plaquer les cellules.
   REMARQUE : Ce protocole peut être complété avec des cellules d’un seul puits ou mis à l’échelle si nécessaire. Nous recommandons de recouvrir au moins trois puits pour commencer afin de faciliter le passage supplémentaire et le maintien des hPSC indifférenciés.
   Il est important de garder la matrice de la membrane basale froide pendant le travail, car la plupart des matrices commencent à polymériser à température ambiante. Les puits recouverts peuvent être utilisés jusqu’à 2-3 semaines lorsqu’ils sont stockés à 37 °C. Stocker avec un diluant adéquat pour couvrir tout le puits afin d’éviter que le revêtement ne se dessèche.
2. Décongelez les hPSC (idéalement un faible nombre de passages) en les remuant brièvement dans un bain d’eau chaude. Sous une hotte à flux laminaire, remettre en suspension un flacon de cellules dans 2 mL de milieu de cellules souches (tableau 1). Aspirez le diluant d’un puits précédemment enrobé dans une boîte à 6 puits immédiatement avant de plaquer les cellules, puis transférez la totalité des 2 ml de cellules remises en suspension dans le puits enrobé. Pour l’entretien des hPSC indifférenciées (appelées plaques d’entretien), incuber à 37 °C, 5 % de CO₂, et changer le milieu tous les deux jours avec 2 ml de milieu de cellules souches par puits.
3. Passez les cellules lorsqu’elles atteignent 70-80 % de confluence. Aspirez le média par le côté du puits sans déranger les cellules. Ajoutez 1 ml de réactif de dissociation des cellules souches à température ambiante dans le puits et aspirez-le dans un délai de 1 minute, en laissant une fine pellicule de liquide sur les cellules. Incuber la plaque pendant 5 min à 37 °C.
   REMARQUE : Attendre que les cellules aient dépassé 80 % de confluence au passage peut causer des problèmes de différenciation prématurée, ce qui réduira le rendement aux étapes suivantes.
4. Ajouter 1 mL par puits de milieu de cellules souches chaud et tapoter le côté de la plaque pour déloger les colonies. Pipetez doucement le support à l’aide d’une micropipette P1000 avec une pointe de pipette à large ouverture (voir le tableau des matériaux) pour briser les colonies tout en minimisant les dommages cellulaires.
   REMARQUE : Lors de la trituration de la suspension cellulaire, il est recommandé de briser de grands amas de cellules mais de laisser les petits amas rester intacts. Il n’est pas recommandé d’atteindre une suspension unicellulaire, mais plutôt de viser des colonies moins nombreuses et plus petites réparties uniformément dans tout le puits.
5. Aspirez le diluant d’un puits préalablement enrobé dans une boîte à 6 puits et ajoutez 2 ml de milieu chaud à base de cellules souches. Transférez le volume désiré de suspension cellulaire dans ce puits pour maintenir les colonies de hPSC, en changeant le milieu tous les deux jours avec 2 ml de milieu de cellules souches par puits.
   REMARQUE : Notre laboratoire transfère généralement des volumes compris entre 50 et 150 μL pour permettre le passage des plaques d’entretien hPSC une fois par semaine. Ce volume peut varier en fonction de la ligne hPSC spécifique et du numéro de passage et peut donc nécessiter un ajustement. Utilisez les cellules restantes pour amorcer la génération de la CCNA (section 2) ou de l’OIH (section 3). Les CSPh nouvellement décongelées doivent être adoptées au moins deux fois avant de passer à la génération de CCNA ou à la génération de DOI.

2. Génération d’ENCC

REMARQUE : Notre méthode de génération d’ENCC suit de près celle décrite par le laboratoire Fattahi et utilisée par Schlieve et ^al.10. Nous utilisons une version légèrement modifiée de l’option B du protocole à travers les sections « Induction de la crête neurale entérique (ENC) (jours 0-12) » et « Formation de sphéroïdes ENCC (jours 12-15) » dans Barber et ^al.10,12.

1. Aspirez le diluant d’un puits préalablement enrobé dans une nouvelle boîte à 6 puits et ajoutez 2 ml de milieu chaud à base de cellules souches. Transférez 850 μL de suspension de cellules hPSC de l’étape 1,5 vers le même puits (généralement un rapport de passage de 5:6).
2. Maintenir les cellules à 37 °C, 5 % CO₂. Changer le milieu tous les deux jours avec 2 ml de milieu de cellules souches par puits jusqu’à ce que la confluence atteigne 60 à 80 %. Ensuite, la plaque est prête à commencer l’induction ENC.
3. Induction ENC
   1. Jour 0. Aspirer le milieu du côté du puits et ajouter 2 ml de milieu chaud pour le cocktail A (tableau 1). Retour à l’incubateur pendant 48 h.
   2. Jour 2. Aspirez le milieu du cocktail A par le côté du puits et remplacez-le par 2 ml de milieu chaud du cocktail B (tableau 1). Retour à l’incubateur pendant 48 h.
   3. Jour 4. Aspirez le milieu Cocktail B par le côté du puits et remplacez-le par 2 ml de milieu Cocktail B frais et chaud. Retour à l’incubateur pendant 48 h.
   4. Jours 6 à 12. Aspirez le milieu du cocktail B par le côté du puits et remplacez-le par 2 ml de milieu chaud du cocktail C (tableau 1). Retournez à l’incubateur et remplacez le milieu par 2 ml de Cocktail C frais et chaud toutes les 48 heures jusqu’à la fin de l’induction ENC le jour 12.
      REMARQUE : À ce stade, les lignées ENC peuvent être confirmées par l’analyse de l’expression génique décrite par Barber et ^al.12.
4. Formation de sphéroïdes ENCC
   1. Jour 13. Aspirez le milieu du cocktail C par le côté du puits. Ajouter 1 mL d’un réactif chaud de détachement de cellules enzymatiques et incuber à 37 °C pendant 30 min. Tapotez le côté de la plaque pour déloger les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture. Lavez le puits avec 1 mL de milieu à cellules de crête neurale (NCC) (tableau 1) et ajoutez les lavages dans le tube conique de 15 mL.
   2. Centrifuger la suspension cellulaire dans le tube conique de 15 mL à 300 × g pendant 1 min. Aspirez le surnageant. Remettez doucement la pastille en suspension dans 2 mL de média CNC chaud.
   3. Ajouter les cellules remises en suspension dans un nouveau puits non revêtu d’une plaque à très faible liaison et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 48 h.
   4. Jours 15-21. Surveiller la croissance des sphéroïdes ENCC et remplacer le substrat par 2 mL de substrat CNC frais et chaud toutes les 48 h.
      REMARQUE : Les changements de support doivent être effectués avec soin pour éviter d’endommager ou d’aspirer les sphéroïdes ENCC. La meilleure façon d’y parvenir est de faire tourner la plaque dans un mouvement circulaire pour concentrer les sphéroïdes au milieu du puits, puis d’aspirer le média à partir du bord du puits.
      La formation des sphéroïdes ENCC est généralement terminée au 15e jour, bien qu’il soit acceptable de les cultiver jusqu’au 21e jour pour s’adapter au moment idéal de la coculture avec les sphéroïdes de l’intestin postérieur.

3. Génération HIO (phase sphéroïde de l’intestin postérieur)

REMARQUE : Notre méthode de génération d’HIO est fondamentalement la même que le protocole original décrit en détail par McCracken et al. et d’autres des laboratoires Spence et Wells ^6,7. Le processus se déroule en deux phases : l’induction définitive de l’endoderme (DE) et la formation du sphéroïde de l’intestin moyen.

1. Préparation à la génération d’un DOI
   1. Préparez une plaque à 24 puits en recouvrant chaque puits souhaité d’une matrice de membrane basale 3D diluée dans un milieu de culture cellulaire approprié (le facteur de dilution et les instructions de préparation se trouvent dans la fiche technique du matériau). Enduire chaque puits désiré avec 500 μL par puits et incuber à 37 °C pendant au moins 1 h ou toute la nuit pour prendre avant de plaquer les cellules.
      REMARQUE : Il est important de garder la matrice de la membrane basale froide pendant le travail, car la plupart des matrices commencent à polymériser à température ambiante. Les puits recouverts peuvent être utilisés jusqu’à 2-3 semaines lorsqu’ils sont stockés à 37 °C. Conserver avec suffisamment de diluant pour couvrir tout le puits afin d’éviter que le revêtement ne se dessèche.
      Prévoyez d’enduire 6 puits d’une plaque de 24 puits pour chaque puits des plaques de maintenance hPSC de 6 puits décrites ci-dessus. Ce rapport peut être augmenté à volonté.
   2. Aspirez le diluant de tous les puits précédemment enrobés dans une boîte à 24 puits. Ajouter suffisamment de milieu de cellules souches chaudes dans la suspension de cellules hPSC à partir de l’étape 1.5 et distribuer 500 μL dans chaque puits (par exemple, s’il reste 850 μL de suspension de cellules hPSC après le passage de la plaque d’entretien hPSC, alors pour 6 puits d’une plaque à 24 puits, mélanger 2 150 μL de milieu de cellules souches chaudes avec 850 μL de suspension de cellules hPSC à partir de l’étape 1.5, et 500 μL répartis dans chacun des 6 puits).
      REMARQUE : Comme nous passons généralement des plaques de maintenance hPSC avec des volumes de 50 à 150 μL, nous avons généralement des volumes de 850 à 950 μL disponibles pour cette étape. Ainsi, le volume de hPSC par puits dans la plaque de 24 puits est d’environ 150 μL/puits.
      Une fois que la plaque de 24 puits nouvellement préparée a été placée dans l’incubateur, agitez doucement la plaque d’avant en arrière (du nord au sud et d’est en ouest) pour répartir les cellules aussi uniformément que possible au fond du puits.
   3. Maintenir les cellules à 37 °C, 5 % CO₂. Changer le milieu tous les deux jours avec 500 μL de milieu de cellules souches par puits jusqu’à ce que la confluence atteigne 50-70 %. Ensuite, la plaque est prête à commencer l’induction DE.
      REMARQUE : Il est essentiel que les cellules n’atteignent pas >70 % de confluence avant l’induction de DE, car une confluence plus élevée affecte négativement la densité de l’endoderme et la morphogenèse de l’intestin postérieur dans les stades ultérieurs. Idéalement, les cellules atteignent une confluence d’environ 50 à 70 % après 24 à 48 h aux rapports de passage spécifiés.
2. Induction DE
   1. Jour 1. Une fois que les hPSC ont atteint une confluence de 50 à 70 %, aspirer complètement le milieu de cellules souches de chaque puits et le remplacer par 500 μL de milieu DE chaud du jour 1 (tableau 1) par puits. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 24 h.
   2. Jour 2. Aspirer le DE du jour 1 et le remplacer par 500 μL de milieu DE chaud du jour 2 (tableau 1) par puits. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 24 h.
   3. Jour 3. Aspirer le DE du jour 2 et le remplacer par 500 μL de milieu DE du jour 3 chaud (tableau 1) par puits. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 24 h.
3. Formation de sphéroïdes de l’intestin postérieur
   1. Jours 4 à 8. Aspirer complètement le milieu de chaque puits et le remplacer par 500 μL de milieu chaud de l’intestin moyen postérieur (MHGM, tableau 1) par puits. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂. Répétez cette étape quotidiennement jusqu’au jour 8, date à laquelle les sphéroïdes de l’intestin moyen sont prêts pour la collecte et la coculture (section 4).

4. Co-culture de sphéroïdes de l’intestin moyen postérieur avec des ENCC

REMARQUE : La figure 1 présente un résumé graphique de cette section.

1. Préparation de la suspension ENCC
   1. Récupérez les sphéroïdes ENCC des jours 15 à 21 de l’étape 2.4.4. En retirant soigneusement le média du puits, en évitant d’aspirer les sphéroïdes à l’aide de la méthode de turbulence décrite dans la note pour cette étape.
   2. Ajouter 1 mL d’un réactif chaud de détachement de cellules enzymatiques dans le puits et incuber à 37 °C pendant 30 min.
   3. Tapotez le côté de la plaque pour continuer à dissocier les sphéroïdes et triturez avec une micropipette P1000 à embout large en pipetant doucement de haut en bas pour briser les amas de cellules jusqu’à ce que le mélange soit homogène.
   4. Transférez la suspension ENCC dans un tube conique de 15 ml. Lavez le puits avec 1 mL de milieu NCC chaud (voir le tableau 1) pour recueillir les cellules restantes et ajoutez-les dans le tube conique de 15 mL.
   5. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 × g pendant 1 min. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette stérile.
   6. À l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture, remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu CNC chaud. Calculez la concentration de la suspension ENCC à l’aide d’un hémacytomètre ou d’un compteur de cellules.
2. Combinaison de la suspension ENCC et des sphéroïdes de l’intestin postérieur
   1. Prélever les sphéroïdes de l’intestin moyen dans tous les puits d’une plaque HIO à l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
   2. Déterminez le nombre de puits de coculture qui seront utilisés dans une plaque de 24 puits. Visez à plaquer 10 à 30 sphéroïdes de l’intestin moyen postérieur et 50 000 à 100 000 ENCC par puits pour la coculture.
      REMARQUE : En pratique, il y a souvent une relation biunivoque entre le nombre de puits contenant des sphéroïdes sains et le nombre final de puits qui seront nécessaires pour la coculture. Un hémocytomètre peut également être utilisé pour calculer la concentration de sphéroïdes de l’intestin moyen de l’intestin postérieur recueillis.
   3. Ajoutez le volume calculé de suspension ENCC pour fournir 50 000 à 100 000 ENCC par coculture planifiée bien dans le tube conique avec les sphéroïdes de l’intestin postérieur. Triturez doucement avec une pointe de pipette à large ouverture pour mélanger uniformément les sphéroïdes de l’intestin moyen et les ENCC.
   4. Centrifuger à 300 × g pendant 1 min et aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette stérile. À l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume de matrice de membrane basale froide, sans phénol (transparente) et à facteur de croissance réduit, égal à 30 μL par puits de coculture final.
      REMARQUE : Évitez de former des bulles dans la matrice de la membrane basale transparente pendant la remise en suspension, car celles-ci sont difficiles à éliminer, entraveront l’intégration adéquate du milieu par les cocultures HIO+ENCC et réduiront la visualisation des cocultures HIO+ENCC au fur et à mesure de leur croissance.
   5. Au centre de chaque puits sec, pipetez une gouttelette de 30 μL de sphéroïdes de l’intestin moyen postérieur en suspension + ENCC dans une matrice de membrane basale transparente sans aucun milieu environnant. Une fois que toutes les gouttelettes sont plaquées dans les puits, couvrez et retournez la plaque. Incuber à l’envers à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 30 min.
      REMARQUE : Cette étape laisse le temps aux sphéroïdes de l’intestin moyen et aux ENCC de se détacher du bas de la plaque et de devenir en suspension pendant la polymérisation de la matrice de membrane basale 3D transparente.
3. In vitro Coculture HIO+ENS
   1. Jour 0 : Une fois que la matrice transparente de la membrane basale a polymérisé, recouvrez chaque gouttelette de 500 μL de milieu HIO chaud des jours 0 à 3 (voir le tableau 1).
   2. Jour 3 : Aspirer soigneusement le média HIO des jours 0 à 3 par le côté du puits, sans perturber la gouttelette de matrice transparente de la membrane basale. Remplacer le support par 500 μL de support HIO chaud du jour 3 au 14 (voir le tableau 1). Remettez la plaque dans l’incubateur. À ce stade, changez de support tous les 3-4 jours.
   3. Jours 7 à 14 : Continuer à remplacer les supports HIO des jours 3 à 14 au besoin tous les 3 à 4 jours et surveiller la croissance.
4. Fractionnement des DOI
   1. Jour 14 : Examinez attentivement chaque puits au microscope et évaluez le nombre de HIO + ENS en développement dans chaque gouttelette de matrice de membrane basale 3D transparente.
   2. Préparez des tubes de microcentrifugation de 2 ml avec 30 μL de matrice de membrane basale transparente et conservez-les sur de la glace.
   3. Sous une hotte à flux laminaire, à l’aide d’une pince fine, retirez soigneusement la gouttelette transparente de la matrice de membrane basale 3D avec le HIO+ENS suspendu. Séparez doucement les HIO+ENS individuels.
      REMARQUE : Les loupes chirurgicales ou un microscope à dissection peuvent être très utiles à ce stade, mais ne sont pas strictement nécessaires, car les HIO sont souvent très visibles à l’œil nu.
   4. Placer chaque HIO + ENS isolé dans l’un des tubes de microcentrifugation préparés contenant 30 μL de matrice de membrane basale transparente à l’aide d’une pince ou d’une pointe de pipette à large ouverture.
      REMARQUE : L’ancienne matrice de membrane basale 3D transparente n’a pas besoin d’être liquéfiée ou dissoute à ce stade. Évitez de perturber les EIH si possible, mais si cela se produit, il peut encore se développer à des stades ultérieurs.
   5. Répéter l’étape 4.2.5 pour le HIO+ENS divisé et replaqué. Une fois que les gouttelettes transparentes de la membrane basale 3D sont polymérisées, ajoutez 500 μL de milieu HIO chaud et frais des jours 3 à 14 dans chaque puits et incubez pendant la nuit.
5. La coculture HIO+ENS s’est poursuivie
   1. Jour 15 : Aspirer soigneusement le support HIO des jours 3 à 14 par le côté du puits. Remplacer le support par un milieu HIO de 500 μL chaud (voir le tableau 1).
   2. Jours 15 à 40 : Continuer à remplacer les supports HIO des jours 15 à 28 au besoin tous les 3 à 4 jours et surveiller la croissance des HIO + ENCC.

Résultats

Le SNE régule les fonctions essentielles de l’intestin grêle mature, notamment le péristaltisme, l’absorption des nutriments, le transport des fluides et le maintien de la barrière épithéliale. Ainsi, l’objectif de l’innervation des DOI est de fournir à ces constructions les éléments nécessaires à l’élaboration d’une fonctionnalité plus mature et de niveau supérieur. À cette fin, notre laboratoire étudie spécifiquement le développement de l’ENS au sein des...

Discussion

Les HIO sont utilisés comme système modèle pour le développement intestinal humain depuis le début des années 2010 et sont devenus de plus en plus complexes depuis. Il est maintenant possible de doter ces constructions d’un ENS, ce qui ouvre de nouvelles opportunités dans l’étude du développement normal qui peuvent être appliquées à la compréhension et à un meilleur traitement d’un certain nombre d’entités gastro-intestinales cliniques.

...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)	ThermoFischer Scientific	11140050
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	12565269
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	ThermoFischer Scientific	12587010	For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	17504044	For HIO
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific	3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated	VWR	29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well	VWR	29442-042
Essential 6 Media	Thermo Fischer	A1516401
Essential 8 Media	Thermo Fischer	A2858501	Alternative stem cell media, used for ENCC plates.
Fine-tip forceps	Dumont	11223-20
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific	50145522
Gibco Advanced DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010
Gibco HEPES 1 M	ThermoFischer Scientific	15630-080
Gibco Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103-049
Glutagro, 200 mM, 100x	Corning	25-015-CI
Glutamax	ThermoFischer Scientific	35050061
H9 human ESC	Wicell International Stem Cell Bank	N/A
HyCloneTM FBS Defined	VWR	16777-002
LabGard Biological Safety Cabinet	Nuaire	Nu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356231	"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	"3D basement membrane matrix"
Micropipettes	Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)	2231300008
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	"stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance.
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048	For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)	Thermo Fisher	A1370701	For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope	Nikon	TS100
Noggin-conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFischer Scientific	15140-122
Recombinant Human Activin A	Cell Guidance Systems	GFH6-100
Recombinant Human BMP-4	Fisher Scientific	314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CF	ThermoFisher Scientific	236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein	ThermoFischer Scientific	233-FB-010
Recombinant Human FGF-4	Peprotech	100-31
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872	"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acid	SIGMA	R2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL	Thermo Scientific	AM12425
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer Scientific	11875093
R-Spondin conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
SB 431542, Tocris Bioscience	Fisher Scientific	16-141-0
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor Tips	VWR	89049-166
Stemolecule Chir99021 in Solution	Stemgent	04-0004-02
Sterile filter pipette tips	VWR (1000uL, 200uL, 10uL)	76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XF	Stem Cell Technologies	7180	Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates.