Innervazione di organoidi intestinali umani

Riepilogo

Gli organoidi intestinali umani devono essere innervati per ricapitolare meglio la struttura e la funzione dell'intestino umano nativo. Qui, presentiamo un metodo per incorporare un sistema nervoso enterico in questi costrutti.

Abstract

La complessità della citoarchitettura e della funzione intestinale pone sfide significative per la creazione dell'intestino tenue bioingegnerizzato. In precedenza sono state riportate tecniche per la generazione di organoidi intestinali umani (HIO) simili all'intestino tenue umano. Gli HIO contengono epitelio e mesenchima, ma mancano di altri componenti critici dell'intestino funzionale come il sistema nervoso enterico (ENS), le cellule immunitarie, il sistema vascolare e il microbioma. Due gruppi di ricerca indipendenti hanno pubblicato metodi distinti per innervare gli HIO con un ENS. Qui discutiamo un metodo unico per incorporare l'ENS in un intestino tenue bioingegnerizzato derivato da HIO, che utilizza i componenti di questi rapporti precedenti per ottimizzare l'identità delle cellule progenitrici e i tempi di sviluppo.

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono differenziate per generare in modo indipendente HIO e cellule della cresta neurale enterica (ENCC) mediante regolazione temporale dei marcatori di differenziazione per un periodo di diversi giorni secondo i protocolli pubblicati. Una volta che gli HIO raggiungono lo stadio di sferoide medio-intestinale (circa il giorno 8), gli sferoidi ENCC del giorno 15-21 vengono dissociati, co-coltivati con HIO e sospesi all'interno di goccioline di matrice di membrana basale tridimensionali (3D) chiare. Le co-colture HIO + ENCC vengono mantenute in vitro per 28-40 giorni prima del trapianto in topi immunodeficienti di >9 settimane per un ulteriore sviluppo e maturazione. Gli HIO trapiantati (tHIO) con ENS possono essere raccolti 4-20 settimane dopo. Questo metodo integra elementi di due tecniche precedentemente pubblicate utilizzando ENCC generati da hPSC e co-coltivandoli con HIO in una fase iniziale di sviluppo per massimizzare l'esposizione a segnali di sviluppo precoci che probabilmente contribuiscono alla formazione di una morfologia intestinale più matura.

Introduzione

L'intestino tenue umano è un organo complesso e multistrato che svolge numerose funzioni essenziali come la digestione, l'assorbimento dei nutrienti, la regolazione dei liquidi, la funzione di barriera immunitaria e la motilità. Numerose malattie cliniche, come la sindrome dell'intestino corto, le enteropatie o i disturbi della motilità, sono caratterizzate da una riduzione critica della massa intestinale o da interruzioni della normale fisiologia che portano a una significativa morbilità e mortalità 1,2,3,4. Le attuali opzioni di trattamento spesso includono la chirurgia per rimuovere l'intestino disfunzionale al costo di una diminuzione della lunghezza intestinale e, quindi, della capacità funzionale dell'intestino rimanente⁵. C'è bisogno di terapie rigenerative che siano di natura additiva, che aumentino la capacità funzionale intestinale e ripristinino la funzione intestinale in modi che gli attuali paradigmi terapeutici non sono in grado di raggiungere.

L'intestino tenue bioingegnerizzato è una soluzione promettente a queste sfide. Gli organoidi intestinali umani (HIO) derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono un materiale di partenza per l'intestino tenue bioingegnerizzato. Nel 2011, Spence et al. hanno riportato per la prima volta il successo della creazione di moderne HIO da linee di hPSC, tra cui cellule staminali embrionali umane H1 e H9 (hESC) e linee multiple di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) ^6,7. Il loro protocollo includeva una serie di incubazioni accuratamente programmate con fattori di crescita specifici per imitare lo sviluppo intestinale fetale umano. L'activina A, una molecola di segnalazione del TGFβ, guida la differenziazione delle hPSC verso il destino endodermico seguita da un patterning posteriore diretto con Wnt/FGF. In queste condizioni, le hPSC si auto-organizzano per formare sferoidi intestinali contenenti epitelio polarizzato e mesenchima. La coltura 3D all'interno di una matrice di membrana basale consente un ulteriore sviluppo che si traduce in organoidi con un lume interno, involuzioni di epitelio simili a villi e nicchie di cellule progenitrici autorigeneranti all'interno di strutture simili a cripte.

Sebbene gli HIO generati utilizzando questo protocollo originale del 2011 assomiglino strutturalmente all'intestino nativo, mancano della capacità di generare i neuroni o la glia del sistema nervoso enterico (ENS). Nel 2017, due importanti articoli hanno descritto metodi simili ma distinti per innervare gli HIO. I progenitori dell'ENS (cellule della cresta neurale enterica, ENCC) possono essere derivati dalle hPSC. In coltura, gli ENCC formano neurosfere 3D, che possono differenziarsi in neuroni enterici e glia in condizioni appropriate. Workman e Mahe et al. hanno modificato un protocollo esistente per derivare ENCC da hPSC e li hanno trattati con terreni arricchiti con FGF seguiti da acido retinoico per 2 giorni per la posteriorizzazione e la promozione del destino vagale ^8,9. Le neurosfere del giorno 6 sono state incubate per altri 4 giorni senza AR, quindi le cellule migrate sono state raccolte dopo il distacco enzimatico. Circa 20.000-50.000 ENCC sono stati aggregati con sferoidi dell'intestino medio precoce e questi sferoidi intestinali seminati con ENCC sono stati coltivati in vitro in una matrice di membrana basale 3D trasparente per 28 giorni fino all'attecchimento in vivo nella capsula renale di topi immunodeficienti per 6-10 settimane. L'HIO + ENS risultante ha dimostrato una maturazione significativa dei componenti epiteliali e mesenchimali, nonché di strutture neurogliali simili ai gangli, anche se con una densità corporea cellulare inferiore rispetto all'intestino nativo, l'assenza di alcuni sottotipi neuronali clinicamente rilevanti (ad esempio, neuroni CHAT-positivi in HIO + ENS dopo il trapianto) e caratteristiche generali simili al feto.

Lo stesso anno, Schlieve et al. hanno pubblicato un metodo alternativo che coinvolge una miscela di 40-60 neurosfere ENCC intatte, giorno 15 con HIO più mature al momento del trapianto in vivo nell'omento di topi immunodeficienti per 3 mesi senza precedente co-coltura in vitro ¹⁰. I loro costrutti, chiamati ENCC-HIO-TESI (intestino tenue ingegnerizzato in tessuto), sembravano contenere un fenotipo ENS più maturo rispetto a quello di HIO + ENS di Workman e Mahe con una maggiore diversità di sottotipi neuronali e connessioni sinaptiche neuroepiteliali non osservate in HIO + ENS. È importante sottolineare che gli ENCC utilizzati negli esperimenti di Schlieve sono stati derivati con un metodo diverso, come descritto in precedenza da Fattahi et ^al.11. In breve, le hPSC (sia hESC che hiPSC) sono state sottoposte a induzione della cresta neurale in terreni arricchiti con FGF2. Anche queste cellule sono state trattate con AR per stabilire un destino vagale enterico, ma per 5 giorni (giorni 6-11), un aumento rispetto ai 2 giorni di Workman e Mahe (giorni 4-5). Nel 2019, Barber et al. hanno pubblicato una versione rivista del protocollo Fattahi che include una descrizione più approfondita delle condizioni di coltura e una transizione a terreni basali definiti per ridurre l'incoerenza e riflettere le mutevoli preferenze di coltura cellulare al momento¹².

Il nostro metodo per innervare gli HIO, descritto in dettaglio di seguito, incorpora elementi di entrambi i protocolli Workman/Mahe e Schlieve. Mentre l'ENS nell'ENCC-HIO-TESI di Schlieve appariva più maturo con una maggiore diversità neuronale e integrazione neurogliale, entrambi i metodi hanno integrato con successo un ENS funzionale negli HIO con cambiamenti dimostrati nell'espressione trascrizionale gastrointestinale. HIO + ENS di Workman e Mahe ha indotto un aumento dell'espressione di diversi geni correlati alle cellule staminali intestinali e allo sviluppo delle cellule epiteliali, che non sono stati alterati in ENCC-HIO-TESI. Una possibile spiegazione di queste distinzioni è rappresentata dai diversi punti temporali in cui ENCC e HIO sono stati combinati tra i protocolli. Il nostro laboratorio ha osservato che la cocoltura precoce provoca l'aumento dell'espressione di più geni coinvolti nella differenziazione epiteliale e mesenchimale e che la tempistica della cocoltura influenza la diversità delle cellule epiteliali (dati non pubblicati). È possibile che l'esposizione precoce dei precursori dell'ENS allo sviluppo di HIO e viceversa fornisca il tempo per un crosstalk di segnalazione ancora indefinito che promuove la diversità epiteliale e altri processi di sviluppo precoce.

Protocollo

La linea H9 di cellule staminali embrionali umane (hESC) proviene da WiCell (Madison, WI) e tutti gli esperimenti che coinvolgono le hESC sono stati approvati dal Comitato di supervisione della ricerca sulle cellule staminali (SCRO) dell'UTHealth Houston (protocollo #SCRO-23-01). Per questo protocollo, tutti i riferimenti a piastre o pozzetti rivestiti si riferiscono a quelli preparati con matrice di membrana basale 3D qualificata hESC.

1. Preparazione della coltura cellulare

NOTA: Il nostro laboratorio utilizza hESC H9, ma più linee hPSC sono state utilizzate con successo da altri laboratori per generare HIO ed ENCC, tra cui H9 hESC ^9,10,12, H1 hESCs⁹, linea hESC UCSF4¹² e più linee hiPSC come WTC11¹², WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f⁹, WTC10 ^9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)⁹ e WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)⁹.

1. Preparare una piastra a 6 pozzetti rivestendo ogni pozzetto desiderato con una matrice di membrana basale 3D diluita in un terreno di coltura cellulare appropriato (il fattore di diluizione e le istruzioni per la preparazione si trovano nella scheda tecnica del materiale). Rivestire ciascun pozzetto desiderato con 1 mL per pozzetto e incubare a 37 °C per almeno 1 ora o tutta la notte per indurire prima di galvanizzare le cellule.
   NOTA: Questo protocollo può essere completato con celle da un solo pozzetto o ingrandito secondo necessità. Si consiglia di rivestire almeno tre pozzetti per facilitare il passaggio e il mantenimento aggiuntivi di hPSC indifferenziate.
   È importante mantenere fredda la matrice della membrana basale durante il lavoro, poiché la maggior parte delle matrici inizia a polimerizzare a temperatura ambiente. I pozzetti rivestiti sono utilizzabili fino a 2-3 settimane se conservati a 37 °C. Conservare con un diluente adeguato a coprire l'intero pozzetto per evitare che il rivestimento si secchi.
2. Scongelare le hPSC (idealmente un numero di passaggio basso) facendo roteare brevemente in un bagno di acqua calda. Sotto una cappa a flusso laminare, risospendere una fiala di cellule in 2 mL di terreno di coltura per cellule staminali (Tabella 1). Aspirare il diluente da un pozzetto precedentemente rivestito in una piastra a 6 pozzetti immediatamente prima di galvanizzare le cellule, quindi trasferire tutti i 2 mL di cellule risospese nel pozzetto rivestito. Per il mantenimento di hPSC indifferenziate (denominate piastre di mantenimento), incubare a 37 °C, 5% di CO₂ e sostituire il terreno a giorni alterni con 2 mL di terreno di coltura di cellule staminali per pozzetto.
3. Passaggio delle celle quando raggiungono il 70-80% di confluenza. Aspirare il fluido dal lato del pozzetto senza disturbare le cellule. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione delle cellule staminali a temperatura ambiente nel pozzetto e aspirarlo entro 1 minuto, lasciando un sottile film di liquido sulle cellule. Incubare la piastra per 5 minuti a 37 °C.
   NOTA: Attendere che le celle superino l'80% di confluenza per il passaggio può causare problemi di differenziazione prematura, che ridurrà la resa nei passaggi successivi.
4. Aggiungere 1 ml per pozzetto di terreno di coltura con cellule staminali calde e picchiettare il lato della piastra per rimuovere le colonie. Pipettare delicatamente i terreni utilizzando una micropipetta P1000 con punta a bocca larga (vedere la Tabella dei materiali) per rompere le colonie riducendo al minimo i danni alle cellule.
   NOTA: Quando si triturica la sospensione cellulare, si consiglia di rompere grandi grumi di cellule, ma lasciare intatti i gruppi più piccoli. Non è consigliabile raggiungere una sospensione unicellulare, ma piuttosto puntare a un minor numero di colonie più piccole distribuite uniformemente in tutto il pozzetto.
5. Aspirare il diluente da un pozzetto precedentemente rivestito in un piatto a 6 pozzetti e aggiungere 2 mL di terreno di coltura con cellule staminali calde. Trasferire il volume desiderato della sospensione cellulare in questo pozzetto per mantenere le colonie di hPSC, cambiando il terreno a giorni alterni con 2 mL di terreno di coltura di cellule staminali per pozzetto.
   NOTA: Il nostro laboratorio trasferisce in genere volumi compresi tra 50 e 150 μl per consentire il passaggio delle piastre di mantenimento hPSC una volta alla settimana. Questo volume può variare in base alla linea hPSC specifica e al numero di passaggio e quindi potrebbe richiedere una regolazione. Utilizzare le celle rimanenti per avviare la generazione ENCC (Sezione 2) o HIO (Sezione 3). Le hPSC appena scongelate devono essere passate almeno due volte prima di passare alla generazione ENCC o HIO.

2. Generazione ENCC

NOTA: Il nostro metodo per la generazione di ENCC segue da vicino quello descritto dal laboratorio Fattahi e utilizzato da Schlieve et ^al.10. Utilizziamo una versione leggermente modificata dell'opzione B del protocollo attraverso le sezioni "Induzione della cresta neurale enterica (ENC) (giorni 0-12)" e "Formazione di sferoidi ENCC (giorni 12-15)" in Barber et ^al.10,12.

1. Aspirare il diluente da un pozzetto precedentemente rivestito in una nuova piastra a 6 pozzetti e aggiungere 2 mL di terreno di coltura con cellule staminali calde. Trasferire 850 μl di sospensione cellulare hPSC dalla fase 1,5 allo stesso pozzetto (tipicamente un rapporto di passaggio 5:6).
2. Mantenere le celle a 37 °C, 5% di CO₂. Sostituire il terreno a giorni alterni con 2 ml di terreno di coltura di cellule staminali per pozzetto fino a raggiungere il 60-80%. Quindi, la piastra è pronta per iniziare l'induzione ENC.
3. Induzione ENC
   1. Giorno 0. Aspirare il terreno dal lato del pozzetto e aggiungere 2 ml di terreno Cocktail A caldo (Tabella 1). Ritorno all'incubatrice per 48 ore.
   2. Giorno 2. Aspirare il terreno Cocktail A dal lato del pozzetto e sostituirlo con 2 mL di terreno Cocktail B caldo (Tabella 1). Ritorno all'incubatrice per 48 ore.
   3. Giorno 4. Aspirare il terreno Cocktail B dal lato del pozzetto e sostituirlo con 2 ml di terreno Cocktail B fresco e caldo. Ritorno all'incubatrice per 48 ore.
   4. Giorni 6-12. Aspirare il terreno Cocktail B dal lato del pozzetto e sostituirlo con 2 ml di terreno Cocktail C caldo (Tabella 1). Rimettere nell'incubatore e sostituire il terreno con 2 ml di Cocktail C fresco e caldo ogni 48 ore fino al completamento dell'induzione ENC il giorno 12.
      NOTA: In questa fase, i lignaggi ENC possono essere confermati dall'analisi dell'espressione genica come descritto da Barber et ^al.12.
4. Formazione di sferoidi ENCC
   1. Giorno 13. Aspirare il terreno Cocktail C dal lato del pozzetto. Aggiungere 1 mL di un reagente caldo per il distacco di cellule enzimatiche e incubare a 37 °C per 30 minuti. Picchiettare il lato della piastra per rimuovere le cellule e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga. Lavare il pozzetto con 1 mL di terreno di coltura Neural Crest Cell (NCC) (Tabella 1) e aggiungere i lavaggi alla provetta conica da 15 mL.
   2. Centrifugare la sospensione cellulare nella provetta conica da 15 mL a 300 × g per 1 minuto. Aspirare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet in 2 mL di terreno NCC caldo.
   3. Aggiungere le cellule risospese in un nuovo pozzetto non rivestito di una piastra a bassissimo legame e incubare a 37 °C, 5% di CO₂ per 48 ore.
   4. Giorni 15-21. Monitorare la crescita degli sferoidi ENCC e sostituire i terreni con 2 mL di terreni NCC freschi e caldi ogni 48 ore.
      NOTA: Le sostituzioni dei fluidi devono essere eseguite con cura per evitare di danneggiare o aspirare gli sferoidi ENCC. Il modo migliore per farlo è far roteare la piastra con un movimento circolare per concentrare gli sferoidi al centro del pozzetto, quindi aspirare il mezzo dal bordo del pozzetto.
      La formazione degli sferoidi ENCC è in genere completa entro il giorno 15, anche se è accettabile coltivarli fino al giorno 21 per adattarsi ai tempi ideali di cocoltura con gli sferoidi medio-intestinali.

3. Generazione di HIO (fase sferoidale medio-posteriore)

NOTA: Il nostro metodo per la generazione di HIO è fondamentalmente lo stesso del protocollo originale descritto in dettaglio da McCracken et al. e altri dai laboratori di Spence e Wells ^6,7. Il processo avviene in due fasi: induzione definitiva dell'endoderma (DE) e formazione dello sferoide medio-posteriore.

1. Preparazione per la generazione HIO
   1. Preparare una piastra a 24 pozzetti rivestendo ogni pozzetto desiderato con una matrice di membrana basale 3D diluita in un terreno di coltura cellulare appropriato (il fattore di diluizione e le istruzioni per la preparazione si trovano nella scheda tecnica del materiale). Rivestire ciascun pozzetto desiderato con 500 μl per pozzetto e incubare a 37 °C per almeno 1 ora o durante la notte per indurire prima di galvanizzare le celle.
      NOTA: È importante mantenere fredda la matrice della membrana basale durante il lavoro poiché la maggior parte delle matrici inizia a polimerizzare a temperatura ambiente. I pozzetti rivestiti sono utilizzabili fino a 2-3 settimane se conservati a 37 °C. Conservare con una quantità di diluente sufficiente a coprire l'intero pozzetto per evitare che il rivestimento si secchi.
      Pianificare il rivestimento di 6 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti per ogni 1 pozzetto delle piastre di manutenzione hPSC a 6 pozzetti descritte sopra. Questo rapporto può essere aumentato in base alle esigenze.
   2. Aspirare il diluente da tutti i pozzetti precedentemente rivestiti in una capsula a 24 pozzetti. Aggiungere una quantità sufficiente di terreno di coltura di cellule staminali calde alla sospensione di cellule hPSC dal passaggio 1.5 e distribuire 500 μL in ciascun pozzetto (ad esempio, se rimangono 850 μL di sospensione di cellule hPSC dopo aver passato la piastra di mantenimento hPSC, per 6 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, mescolare 2.150 μL di terreno di coltura di cellule staminali calde con 850 μL di sospensione di cellule hPSC dal passaggio 1.5, e 500 μL distribuiti in ciascuno dei 6 pozzetti).
      NOTA: Poiché in genere passiamo piastre di mantenimento hPSC con volumi di 50-150 μL, di solito abbiamo volumi di 850-950 μL disponibili per questa fase. Pertanto, il volume di hPSC per pozzetto nella piastra a 24 pozzetti si avvicina a 150 μL/pozzetto.
      Una volta che la piastra a 24 pozzetti appena preparata è stata collocata nell'incubatore, agitare delicatamente la piastra avanti e indietro (da nord a sud e da est a ovest) per distribuire le cellule il più uniformemente possibile sul fondo del pozzetto.
   3. Mantenere le celle a 37 °C, 5% di CO₂. Sostituire il terreno a giorni alterni con 500 μL di terreno di coltura con cellule staminali per pozzetto fino a quando la confluenza raggiunge il 50-70%. Quindi, la piastra è pronta per iniziare l'induzione DE.
      NOTA: È fondamentale che le cellule non raggiungano >70% di confluenza prima dell'induzione di DE, poiché una confluenza più elevata influisce negativamente sulla densità dell'endoderma e sulla morfogenesi dell'intestino posteriore nelle fasi successive. Idealmente, le cellule raggiungono circa il 50-70% di confluenza dopo 24-48 ore ai rapporti di passaggio specificati.
2. Induzione DE
   1. Giorno 1. Una volta che le hPSC hanno raggiunto il 50-70% di confluenza, aspirare completamente il terreno di coltura delle cellule staminali da ciascun pozzetto e sostituirlo con 500 μL di terreno caldo di DE Day 1 (Tabella 1) per pozzetto. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 24 h.
   2. Giorno 2. Aspirare il DE del giorno 1 e sostituirlo con 500 μl di terreno caldo del DE del giorno 2 (Tabella 1) per pozzetto. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 24 h.
   3. Giorno 3. Aspirare il DE del giorno 2 e sostituirlo con 500 μl di terreno caldo del DE del giorno 3 (Tabella 1) per pozzetto. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 24 h.
3. Formazione di sferoidi medio-intestinali posteriori
   1. Giorni 4-8. Aspirare completamente il terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 500 μL di terreno caldo dell'intestino medio posteriore (MHGM, Tabella 1) per pozzetto. Incubare a 37 °C, 5% CO₂. Ripetere questo passaggio ogni giorno fino al giorno 8, momento in cui gli sferoidi dell'intestino medio sono pronti per la raccolta e la cocoltura (Sezione 4).

4. Co-coltura di sferoidi medio-intestinali con ENCC

NOTA: Un riepilogo grafico di questa sezione è fornito nella Figura 1.

1. Preparazione della sospensione ENCC
   1. Raccogli gli sferoidi ENCC del giorno 15-21 dal passaggio 2.4.4. Rimuovendo con cura il terreno dal pozzetto, evitando di aspirare gli sferoidi utilizzando il metodo a vortice descritto nella nota relativa a tale passaggio.
   2. Aggiungere 1 mL di un reagente caldo per il distacco di cellule enzimatiche al pozzetto e incubare a 37 °C per 30 minuti.
   3. Picchiettare il lato della piastra per continuare a dissociare gli sferoidi e triturare con una micropipetta P1000 con punta a bocca larga, pipettando delicatamente su e giù per rompere i grumi di cellule fino a ottenere una miscela omogenea.
   4. Trasferire la sospensione ENCC in una provetta conica da 15 mL. Lavare il pozzetto con 1 mL di terreno caldo NCC (vedere la Tabella 1) per raccogliere eventuali cellule rimanenti e aggiungerlo alla provetta conica da 15 mL.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 1 minuto. Aspirare il surnatante con un puntale per pipetta sterile.
   6. Utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno NCC caldo. Calcolare la concentrazione della sospensione ENCC utilizzando un ematocitometro o un contatore di cellule.
2. Combinazione di sospensioni ENCC con sferoidi medio-posteriori
   1. Raccogliere gli sferoidi dell'intestino medio posteriore da tutti i pozzetti di una piastra HIO utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga e trasferirli in una provetta conica da 15 mL.
   2. Determinare il numero di pozzetti di cocoltura che verranno utilizzati all'interno di una piastra a 24 pozzetti. Mirare a piastrare 10-30 sferoidi dell'intestino medio posteriore e 50.000-100.000 ENCC per pozzetto per la cocoltura.
      NOTA: In pratica, esiste spesso una relazione uno-a-uno tra il numero di pozzetti con sferoidi sani e il numero finale di pozzetti che saranno necessari per la cocoltura. Un emocitometro può anche essere utilizzato per calcolare la concentrazione di sferoidi medio-intestinali raccolti .
   3. Aggiungere il volume calcolato di sospensione ENCC per erogare 50.000-100.000 ENCC per pozzo di cocoltura pianificato al tubo conico con gli sferoidi medio-intestinali. Triturare delicatamente con una punta di pipetta a bocca larga per miscelare uniformemente gli sferoidi dell'intestino medio-posteriore e gli ENCC.
   4. Centrifugare a 300 × g per 1 minuto e aspirare accuratamente il surnatante con un puntale di pipetta sterile. Utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga, risospendere il pellet cellulare in un volume di matrice di membrana basale fredda, priva di fenolo (trasparente), a ridotto fattore di crescita, pari a 30 μl per pozzetto di cocoltura finale.
      NOTA: Evitare la formazione di bolle nella matrice trasparente della membrana basale durante la risospensione, poiché queste sono difficili da rimuovere, impediranno la corretta imbibibizione del terreno da parte delle cocolture HIO+ENCC e ridurranno la visualizzazione delle cocolture HIO+ENCC durante la crescita.
   5. Al centro di ciascun pozzetto asciutto, pipettare una goccia da 30 μl di sferoidi medio-intestinali sospesi + ENCC in una matrice di membrana basale trasparente senza alcun terreno circostante. Una volta che tutte le goccioline sono state piastrate nei pozzetti, coprire e capovolgere la piastra. Incubare capovolto a 37 °C, 5% CO₂ per 30 min.
      NOTA: Questo passaggio consente agli sferoidi dell'intestino medio-posteriore e agli ENCC di staccarsi dal fondo della piastra e di rimanere sospesi durante la polimerizzazione della matrice della membrana basale 3D trasparente.
3. In vitro Cocultura HIO+ENS
   1. Giorno 0: Una volta polimerizzata la matrice chiara della membrana basale, coprire ogni goccia con 500 μL di terreno caldo Day 0-3 HIO (vedere Tabella 1).
   2. Giorno 3: Aspirare con cautela il terreno HIO del giorno 0-3 dal lato del pozzetto, senza disturbare la gocciolina chiara della matrice della membrana basale. Sostituire il terreno con 500 μL di terreno caldo Day 3-14 HIO (vedere la Tabella 1). Rimettere la piastra nell'incubatrice. A questo punto, cambia il supporto ogni 3-4 giorni.
   3. Giorni 7-14: Continuare a sostituire i terreni HIO Day 3-14 secondo necessità ogni 3-4 giorni e monitorare la crescita.
4. Divisione degli HIO
   1. Giorno 14: Esaminare attentamente ogni pozzetto al microscopio e valutare quanti HIO + ENS in via di sviluppo ci sono in ogni gocciolina di matrice della membrana basale 3D trasparente.
   2. Preparare provette per microcentrifuga da 2 mL con 30 μL di matrice di membrana basale trasparente e tenerle in ghiaccio.
   3. Sotto una cappa a flusso laminare, utilizzare una pinza fine per rimuovere con cura la gocciolina trasparente della matrice della membrana basale 3D con HIO+ENS sospeso. Separare delicatamente i singoli HIO+ENS.
      NOTA: Le lenti chirurgiche o un microscopio da dissezione possono essere molto utili in questa fase, ma non sono strettamente necessarie poiché le HIO sono spesso grossolanamente visibili ad occhio nudo.
   4. Posizionare ciascun HIO + ENS isolato in una delle provette per microcentrifuga preparate contenenti 30 μl di matrice di membrana basale trasparente utilizzando una pinza o un puntale per pipetta a bocca larga.
      NOTA: La vecchia matrice di membrana basale 3D trasparente non ha bisogno di essere liquefatta o disciolta in questa fase. Evita di interrompere gli HIO se possibile, anche se ciò si verifica potrebbe comunque crescere nelle fasi successive.
   5. Ripetere il passaggio 4.2.5 per HIO+ENS diviso e riplaccato. Una volta polimerizzate le goccioline trasparenti della membrana basale 3D, aggiungere 500 μL di terreno caldo e fresco Day 3-14 HIO a ciascun pozzetto e incubare durante la notte.
5. La cocoltura HIO+ENS continua
   1. Giorno 15: Aspirare con cura il terreno HIO Day 3-14 dal lato del pozzo. Sostituire il terreno con un terreno caldo Day 15-28 HIO da 500 μL (vedere la Tabella 1).
   2. Giorno 15-40: Continuare a sostituire i terreni HIO del giorno 15-28 secondo necessità ogni 3-4 giorni e monitorare la crescita HIO + ENCC.

Risultati

L'ENS regola le funzioni essenziali dell'intestino tenue maturo, tra cui la peristalsi, l'assorbimento dei nutrienti, il trasporto dei liquidi e il mantenimento della barriera epiteliale. Pertanto, l'obiettivo dell'innervazione degli HIO è quello di fornire a questi costrutti gli elementi necessari per sviluppare funzionalità più mature e di livello superiore. A tal fine, il nostro laboratorio studia in modo specifico lo sviluppo dell'ENS all'interno delle HIO e i risultati funzionali...

Discussione

Gli HIO sono stati utilizzati come sistema modello per lo sviluppo intestinale umano fin dai primi anni 2010 e da allora sono diventati sempre più complessi. È ora possibile dotare questi costrutti di un ENS, consentendo nuove opportunità nello studio dello sviluppo normale che possono essere applicate alla comprensione e al trattamento migliore di un certo numero di entità gastrointestinali cliniche.

Trapianto in vivo

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)	ThermoFischer Scientific	11140050
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	12565269
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	ThermoFischer Scientific	12587010	For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	17504044	For HIO
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific	3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated	VWR	29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well	VWR	29442-042
Essential 6 Media	Thermo Fischer	A1516401
Essential 8 Media	Thermo Fischer	A2858501	Alternative stem cell media, used for ENCC plates.
Fine-tip forceps	Dumont	11223-20
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific	50145522
Gibco Advanced DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010
Gibco HEPES 1 M	ThermoFischer Scientific	15630-080
Gibco Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103-049
Glutagro, 200 mM, 100x	Corning	25-015-CI
Glutamax	ThermoFischer Scientific	35050061
H9 human ESC	Wicell International Stem Cell Bank	N/A
HyCloneTM FBS Defined	VWR	16777-002
LabGard Biological Safety Cabinet	Nuaire	Nu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356231	"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	"3D basement membrane matrix"
Micropipettes	Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)	2231300008
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	"stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance.
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048	For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)	Thermo Fisher	A1370701	For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope	Nikon	TS100
Noggin-conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFischer Scientific	15140-122
Recombinant Human Activin A	Cell Guidance Systems	GFH6-100
Recombinant Human BMP-4	Fisher Scientific	314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CF	ThermoFisher Scientific	236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein	ThermoFischer Scientific	233-FB-010
Recombinant Human FGF-4	Peprotech	100-31
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872	"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acid	SIGMA	R2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL	Thermo Scientific	AM12425
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer Scientific	11875093
R-Spondin conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
SB 431542, Tocris Bioscience	Fisher Scientific	16-141-0
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor Tips	VWR	89049-166
Stemolecule Chir99021 in Solution	Stemgent	04-0004-02
Sterile filter pipette tips	VWR (1000uL, 200uL, 10uL)	76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XF	Stem Cell Technologies	7180	Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates.