İnsan Bağırsak Organoidlerinin İnnervasyonu

Özet

Doğal insan bağırsağının yapısını ve işlevini daha iyi özetlemek için insan bağırsak organoidleri innerve edilmelidir. Burada, bir enterik sinir sistemini bu yapılara dahil etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Bağırsak sitomimarisinin ve fonksiyonunun karmaşıklığı, biyomühendislik ürünü ince bağırsağın oluşturulması için önemli zorluklar doğurur. İnsan ince bağırsağına benzeyen insan bağırsak organoidleri (HIO'lar) üretme teknikleri daha önce bildirilmiştir. HIO'lar epitel ve mezenşim içerir, ancak enterik sinir sistemi (ENS), bağışıklık hücreleri, damar sistemi ve mikrobiyom gibi fonksiyonel bağırsağın diğer kritik bileşenlerinden yoksundur. İki bağımsız araştırma grubu, HIO'ları bir ENS ile innerve etmek için farklı yöntemler yayınladı. Burada, ENS'yi HIO'dan türetilmiş biyomühendislik ürünü bir ince bağırsağa dahil etmenin benzersiz bir yöntemini tartışıyoruz ve bu, progenitör hücre kimliğini ve gelişimsel zamanlamayı optimize etmek için bu önceki raporların bileşenlerini kullanır.

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), yayınlanan protokoller başına birkaç günlük bir süre boyunca farklılaşma belirteçlerinin zamansal regülasyonu ile bağımsız olarak HIO'lar ve enterik nöral krest hücreleri (ENCC'ler) oluşturmak üzere farklılaştırılır. HIO'lar orta arka bağırsak küresel aşamasına ulaştığında (yaklaşık 8. gün), 15-21. gün ENCC sferoidleri ayrışır, HIO'larla birlikte kültürlenir ve net üç boyutlu (3D) bazal membran matris damlacıkları içinde süspanse edilir. HIO + ENCC ko-kültürleri, daha fazla gelişme ve olgunlaşma için >9 haftalık immün yetmezliği olan farelere transplantasyondan önce 28-40 gün boyunca in vitro olarak tutulur. ENS ile nakledilen HIO'lar (tHIO'lar) 4-20 hafta sonra hasat edilebilir. Bu yöntem, daha olgun bir bağırsak morfolojisinin oluşumuna katkıda bulunan erken gelişimsel ipuçlarına maruz kalmayı en üst düzeye çıkarmak için hPSC'lerden üretilen ENCC'leri kullanarak ve bunları gelişimin erken bir aşamasında HIO'larla birlikte kültürleyerek daha önce yayınlanmış iki teknikten öğeleri bütünleştirir.

Giriş

İnsan ince bağırsağı, sindirim, besin emilimi, sıvı regülasyonu, bağışıklık bariyeri işlevi ve hareketlilik gibi çok sayıda temel işlevi yerine getiren karmaşık, çok katmanlı bir organdır. Kısa barsak sendromu, enteropatiler veya motilite bozuklukları gibi çok sayıda klinik hastalık, bağırsak kütlesinin kritik azalması veya önemli morbidite ve mortaliteye yol açan normal fizyolojinin bozulması ile karakterizedir 1,2,3,4. Mevcut tedavi seçenekleri genellikle bağırsak uzunluğunun azalması ve dolayısıyla kalan bağırsağın fonksiyonel kapasitesi pahasına işlevsiz bağırsağın çıkarılması için ameliyatı içerir⁵. Doğası gereği katkı maddesi olan, fonksiyonel bağırsak kapasitesini artıran ve bağırsak fonksiyonunu mevcut terapötik paradigmaların başaramadığı şekillerde geri kazandıran rejeneratif tedavilere ihtiyaç vardır.

Biyomühendislik ürünü ince bağırsak, bu zorluklara umut verici bir çözümdür. İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen insan bağırsak organoidleri (HIO'lar), biyomühendislik ürünü ince bağırsak için bir başlangıç materyalidir. 2011 yılında, Spence ve ark. ilk olarak, hem H1 hem de H9 insan embriyonik kök hücresi (hESC) ve çoklu insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları ^6,7 dahil olmak üzere hPSC hatlarından modern HIO'ların başarılı bir şekilde oluşturulduğunu bildirdi. Protokolleri, insan fetal bağırsak gelişimini taklit etmek için spesifik büyüme faktörlerine sahip, dikkatlice zamanlanmış bir dizi inkübasyon içeriyordu. Bir TGFβ sinyal molekülü olan Activin A, hPSC farklılaşmasını endodermal kadere doğru yönlendirir ve ardından Wnt / FGF ile yönlendirilmiş posterior modelleme yapar. Bu koşullar altında, hPSC'ler polarize epitel ve mezenşim içeren bağırsak sferoidleri oluşturmak için kendi kendini organize eder. Bir bazal membran matrisi içindeki 3D kültür, iç lümenli organoidler, villus benzeri epitel kıvrımları ve kript benzeri yapılar içinde kendi kendini yenileyen progenitör hücre nişleri ile sonuçlanan ek gelişime izin verir.

Bu orijinal 2011 protokolü kullanılarak üretilen HIO'lar yapısal olarak doğal bağırsağa benzese de, enterik sinir sisteminin (ENS) nöronlarını veya glialarını üretme kapasitesinden yoksundurlar. 2017'de, iki büyük makale, HIO'ları innerve etmek için benzer ancak farklı yöntemler tanımladı. ENS progenitörleri (enterik nöral krest hücreleri, ENCC'ler) hPSC'lerden türetilebilir. Kültürde, ENCC'ler, uygun koşullar altında enterik nöronlara ve glialara farklılaşabilen 3D nöroküreler oluşturur. Workman ve Mahe ve ark. hPSC'lerden ENCC'leri türetmek için mevcut bir protokolü değiştirdi ve bunları FGF ile zenginleştirilmiş medya ile tedavi etti ve ardından vagal kaderin posteriorizasyonu ve teşviki için 2 gün boyunca retinoik asit ile tedavi etti ^8,9. 6. gün nörosferleri, RA olmadan 4 gün daha inkübe edildi ve daha sonra enzimatik ayrılmadan sonra göç eden hücreler toplandı. Yaklaşık 20.000-50.000 ENCC, erken orta hindgut sferoidleri ile birleştirildi ve bu ENCC tohumlu bağırsak sferoidleri, 6-10 hafta boyunca immün yetmezliği olan farelerin böbrek kapsülüne in vivo engraftmana kadar 28 gün boyunca net bir 3D bazal membran matrisinde in vitro olarak büyütüldü. Elde edilen HIO + ENS, epitel ve mezenkimal bileşenlerin yanı sıra gangliyonlara benzer nöroglial yapıların önemli olgunlaşmasını gösterdi, ancak doğal bağırsaktan daha düşük hücre vücut yoğunluğuna sahip olmasına rağmen, klinik olarak ilgili bazı nöronal alt tiplerin yokluğu (yani, transplantasyon sonrası HIO + ENS'de CHAT pozitif nöronlar) ve genel fetal benzeri özellikler.

Aynı yıl, Schlieve ve ark. önceden in vitro ko-kültür¹⁰ olmadan 3 ay boyunca immün yetmezliği olan farelerin omentumuna in vivo transplantasyon sırasında daha olgun HIO'lar ile 40-60 sağlam, 15. gün ENCC nörosferlerinin bir karışımını içeren alternatif bir yöntem yayınladılar. ENCC-HIO-TESI (doku mühendisliği yapılmış ince bağırsak) adı verilen yapıları, Workman ve Mahe'nin HIO + ENS'sinden daha olgun bir ENS fenotipi içeriyor gibi görünüyordu, daha fazla nöronal alt tip çeşitliliği ve HIO + ENS'de görülmeyen nöroepitelyal sinaptik bağlantılara sahip. Daha da önemlisi, Schlieve'in deneylerinde kullanılan ENCC'ler, daha önce Fattahi ve ^ark.11 tarafından açıklandığı gibi farklı bir yöntemle türetilmiştir. Kısaca, hPSC'lere (hem hESC'ler hem de hiPSC'ler) FGF2 ile zenginleştirilmiş ortamda nöral krest indüksiyonu uygulandı. Bu hücreler ayrıca enterik bir vagal kader oluşturmak için RA ile tedavi edildi, ancak 5 gün boyunca (6-11. gün), Workman ve Mahe'nin 2 gününden (4-5. gün) bir artış. 2019'da Barber ve ark. Tutarsızlığı azaltmak ve o sırada değişen hücre kültürü tercihlerini yansıtmak için kültür koşullarının daha kapsamlı bir tanımını ve tanımlanmış bazal ortama geçişi içeren Fattahi protokolünün gözden geçirilmiş bir versiyonunu yayınladı¹².

Aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan HIO'ları innerve etme yöntemimiz, hem Workman/Mahe hem de Schlieve protokollerinin unsurlarını içerir. Schlieve'in ENCC-HIO-TESI'sindeki ENS, daha fazla nöronal çeşitlilik ve nöroglial entegrasyon ile daha olgun görünürken, her iki yöntem de gastrointestinal transkripsiyonel ekspresyonda gösterilen değişikliklerle fonksiyonel bir ENS'yi HIO'lara başarıyla entegre etti. Workman ve Mahe'nin HIO + ENS'si, ENCC-HIO-TESI'de değiştirilmemiş olan bağırsak kök hücreleri ve epitel hücre gelişimi ile ilgili birkaç genin artan ekspresyonunu indükledi. Bu ayrımlar için olası bir açıklama, ENCC'lerin ve HIO'ların protokoller arasında birleştirildiği farklı zaman noktalarıdır. Laboratuvarımız, erken kokültürün, epitelyal ve mezenkimal farklılaşmada rol oynayan çoklu genlerin ekspresyonunun artmasına neden olduğunu ve kokültürün zamanlamasının epitel hücre çeşitliliğini etkilediğini gözlemlemiştir (yayınlanmamış veriler). ENS öncüllerinin gelişmekte olan HIO'lara daha erken maruz kalması ve bunun tersinin de geçerli olması, epitel çeşitliliğini ve diğer erken gelişimsel süreçleri destekleyen henüz tanımlanmamış sinyal karışması için zaman sağlaması mümkündür.

Protokol

İnsan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9, WiCell'den (Madison, WI) elde edildi ve hESC'leri içeren tüm deneyler UTHealth Houston Kök Hücre Araştırma Gözetimi (SCRO) Komitesi (protokol #SCRO-23-01) tarafından onaylandı. Bu protokol için, kaplanmış plakalara veya kuyucuklara yapılan tüm atıflar, hESC onaylı 3D bazal membran matrisi ile hazırlananlara atıfta bulunur.

1. Hücre kültürü hazırlama

NOT: Laboratuvarımız H9 hESC'leri kullanır, ancak H9 hESC ^9,10,12, H1 hESC⁹, hESC hattı UCSF4¹² ve WTC11¹², WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f⁹, WTC10 ^9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)⁹ ve WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)⁹ gibi çoklu hiPSC hatları diğer laboratuvarlar tarafından başarıyla kullanılmıştır.

1. İstenen her bir kuyucuğu uygun bir hücre kültürü ortamında seyreltilmiş bir 3D bazal membran matrisi ile kaplayarak 6 oyuklu bir plaka hazırlayın (seyreltme faktörü ve hazırlama talimatları malzeme veri sayfasında bulunur). İstenen her bir kuyuyu oyuk başına 1 mL ile kaplayın ve hücreleri kaplamadan önce ayarlamak için en az 1 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Bu protokol sadece bir kuyudan alınan hücrelerle tamamlanabilir veya gerektiği gibi ölçeklendirilebilir. Farklılaşmamış hPSC'lerin ek geçişini ve bakımını kolaylaştırmak için başlamak için en az üç kuyu kaplamanızı öneririz.
   Çoğu matris oda sıcaklığında polimerleşmeye başladığından, çalışırken bazal membran matrisini soğuk tutmak önemlidir. Kaplamalı kuyular 37 °C'de saklandığında 2-3 haftaya kadar kullanılabilir. Kaplamanın kurumasını önlemek için tüm kuyuyu kaplayacak kadar yeterli seyreltici ile saklayın.
2. Ilık su banyosunda kısa bir süre döndürerek hPSC'leri (ideal olarak düşük bir geçiş numarası) çözün. Laminer bir akış başlığı altında, 2 mL kök hücre ortamında bir şişe hücreyi yeniden süspanse edin (Tablo 1). Hücreleri kaplamadan hemen önce 6 oyuklu bir tabakta daha önce kaplanmış bir kuyudan seyrelticiyi aspire edin, ardından 2 mL yeniden süspanse edilmiş hücrelerin tamamını kaplanmış kuyucuğa aktarın. Farklılaşmamış hPSC'lerin (bakım plakaları olarak adlandırılır) bakımı için, 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin ve ortamı her gün oyuk başına 2 mL kök hücre ortamı ile değiştirin.
3. Hücreleri% 70-80 birleşme noktasına ulaştıklarında geçirin. Hücreleri rahatsız etmeden ortamı kuyunun yanından aspire edin. Kuyucuğa 1 mL oda sıcaklığında kök hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücrelerin üzerinde ince bir sıvı tabakası bırakarak 1 dakika içinde aspire edin. Plakayı 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
   NOT: Hücrelerin geçiş için %80'lik birleşmeyi geçmesini beklemek, erken farklılaşma ile ilgili sorunlara neden olabilir ve bu da sonraki adımlarda verimi azaltacaktır.
4. Sıcak kök hücre ortamının oyuğu başına 1 mL ekleyin ve kolonileri çıkarmak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun. Hücre hasarını en aza indirirken kolonileri parçalamak için geniş ağızlı pipet uçlu bir P1000 mikropipet kullanarak ortamı nazikçe pipetleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
   NOT: Hücre süspansiyonunu ezerken, büyük hücre kümelerini parçalamanız, ancak daha küçük kümelerin bozulmadan kalmasına izin vermeniz önerilir. Tek hücreli bir süspansiyona ulaşılması tavsiye edilmez, bunun yerine kuyu boyunca eşit olarak yayılmış daha az, daha küçük kolonilerin hedeflenmesi önerilir.
5. Seyrelticiyi önceden kaplanmış bir kuyudan 6 oyuklu bir tabakta aspire edin ve 2 mL ılık kök hücre ortamı ekleyin. hPSC kolonilerini korumak için istenen hücre süspansiyonu hacmini bu kuyucuğa aktarın ve ortamı her gün oyuk başına 2 mL kök hücre ortamı ile değiştirin.
   NOT: Laboratuvarımız, hPSC bakım plakalarının haftada bir kez geçirilmesini sağlamak için tipik olarak 50-150 μL arasındaki hacimleri aktarır. Bu hacim, belirli hPSC hattı ve geçiş numarasına göre değişebilir ve bu nedenle ayarlama gerektirebilir. ENCC oluşturmayı (Bölüm 2) veya HIO oluşturmayı (Bölüm 3) başlatmak için kalan hücreleri kullanın. Yeni çözülmüş hPSC'ler, ENCC nesline veya HIO nesline ilerlemeden önce en az iki kez geçilmelidir.

2. ENCC üretimi

NOT: ENCC üretimi için yöntemimiz, Fattahi laboratuvarı tarafından tanımlanan ve Schlieve ve ^ark.10 tarafından kullanılanı yakından takip eder. Barber ve ^ark.10,12'de "Enterik Nöral Krest (ENC) İndüksiyonu (0-12. Gün)" ve "ENCC Küresel Oluşumu (12-15. Gün)" bölümleri aracılığıyla B protokol seçeneğinin biraz değiştirilmiş bir versiyonunu kullanıyoruz.

1. Seyrelticiyi önceden kaplanmış bir kuyucuktan 6 oyuklu yeni bir tabakta aspire edin ve 2 mL ılık kök hücre ortamı ekleyin. 850 μL hPSC hücre süspansiyonunu adım 1.5'ten aynı kuyucuğa aktarın (tipik olarak 5:6 geçiş oranı).
2. Hücreleri 37 °C, %5 CO_2'de tutun. Birleşme %60-80'e ulaşana kadar ortamı her gün oyuk başına 2 mL kök hücre ortamı ile değiştirin. Ardından, plaka ENC indüksiyonuna başlamaya hazırdır.
3. ENC indüksiyonu
   1. Gün 0. Kuyu kenarından besiyerini aspire edin ve 2 mL ılık Kokteyl A besiyeri ekleyin (Tablo 1). 48 saat boyunca inkübatöre geri dönün.
   2. 2. Gün. Kuyunun yanından Kokteyl A ortamını aspire edin ve 2 mL ılık Kokteyl B ortamı ile değiştirin (Tablo 1). 48 saat boyunca inkübatöre geri dönün.
   3. 4. Gün. Kuyunun yanından Kokteyl B ortamını aspire edin ve 2 mL taze, ılık Kokteyl B ortamı ile değiştirin. 48 saat boyunca inkübatöre geri dönün.
   4. 6-12. günler. Kuyu kenarından Kokteyl B ortamını aspire edin ve 2 mL ılık Kokteyl C ortamı ile değiştirin (Tablo 1). İnkübatöre geri dönün ve 12. günde ENC indüksiyonunun tamamlanmasına kadar her 48 saatte bir 2 mL taze, ılık Kokteyl C ile ortamı değiştirin.
      NOT: Bu aşamada, ENC soyları, Barber ve ^ark.12 tarafından tarif edildiği gibi gen ekspresyon analizi ile doğrulanabilir.
4. ENCC küresel oluşumu
   1. 13. Gün. Kuyu tarafından aspire Kokteyl C ortamı. 1 mL ılık enzimatik hücre ayırma reaktifi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri yerinden çıkarmak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun ve hücre süspansiyonunu geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. İyiliği 1 mL Nöral Krest Hücresi (NCC) ortamı ile yıkayın (Tablo 1) ve yıkamaları 15 mL konik tüpe ekleyin.
   2. Hücre süspansiyonunu 15 mL konik tüpte 300 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. Peleti 2 mL ılık NCC ortamında nazikçe yeniden süspanse edin.
   3. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri, ultra düşük bağlayıcı bir plakanın yeni, kaplanmamış bir kuyucuğuna ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO₂ 48 saat boyunca inkübe edin.
   4. 15-21. Günler. ENCC küresel büyümesini izleyin ve ortamı her 48 saatte bir 2 mL taze, ılık NCC ortamıyla değiştirin.
      NOT: ENCC sferoidlerine zarar vermemek veya aspire etmekten kaçınmak için ortam değişiklikleri dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Bu en iyi şekilde, sferoidleri kuyunun ortasına odaklamak için plakayı dairesel bir hareketle döndürerek ve ardından ortamı kuyunun kenarından aspire ederek gerçekleştirilir.
      ENCC sferoid oluşumu tipik olarak 15. günde tamamlanır, ancak orta hindgut sferoidleri ile ideal kokültür zamanlamasına uyum sağlamak için 21. güne kadar kültürlenmesi kabul edilebilir.

3. HIO üretimi (orta arka bağırsak küresel fazı)

NOT: HIO oluşturma yöntemimiz temel olarak McCracken ve ark. ve Spence ve Wells laboratuvarlarından^{diğerleri 6,7}. İşlem iki aşamada gerçekleşir: Kesin endoderm (DE) indüksiyonu ve Orta hindgut küresel oluşumu.

1. HIO Üretimi için Hazırlık
   1. İstenen her bir kuyucuğu uygun bir hücre kültürü ortamında seyreltilmiş bir 3D bazal membran matrisi ile kaplayarak 24 oyuklu bir plaka hazırlayın (seyreltme faktörü ve hazırlama talimatları malzeme veri sayfasında bulunur). İstenen her bir kuyuyu oyuk başına 500 μL ile kaplayın ve hücreleri kaplamadan önce sertleşmek için en az 1 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Çoğu matris oda sıcaklığında polimerleşmeye başladığından, çalışırken bazal membran matrisini soğuk tutmak önemlidir. Kaplamalı kuyular 37 °C'de saklandığında 2-3 haftaya kadar kullanılabilir. Kaplamanın kurumasını önlemek için tüm kuyuyu kaplayacak kadar seyreltici ile saklayın.
      Yukarıda açıklanan 6 kuyulu hPSC bakım plakalarından her 1 kuyu için 24 oyuklu bir plakanın 6 kuyusunu kaplamayı planlayın. Bu oran istenildiği gibi büyütülebilir.
   2. Seyrelticiyi önceden kaplanmış tüm kuyucuklardan 24 oyuklu bir tabakta aspire edin. Adım 1.5'ten itibaren hPSC hücre süspansiyonuna yeterli miktarda sıcak kök hücre ortamı ekleyin ve her bir oyuğa 500 μL dağıtın (örneğin, hPSC bakım plakasını geçtikten sonra 850 μL hPSC hücre süspansiyonu kalırsa, 24 oyuklu bir plakanın 6 oyuğu için, 2.150 μL sıcak kök hücre ortamını adım 1.5'ten 850 μL hPSC hücre süspansiyonu ile karıştırın, ve 6 kuyunun her birine dağıtılan 500 μL).
      NOT: Tipik olarak 50-150 μL hacimli hPSC bakım plakalarından geçtiğimizden, bu adım için genellikle 850-950 μL'lik hacimlerimiz vardır. Bu nedenle, 24 oyuklu plakadaki oyuk başına hPSC'lerin hacmi yaklaşık 150 μL/kuyudur.
      Yeni hazırlanan 24 oyuklu plaka inkübatöre yerleştirildikten sonra, hücreleri kuyu dibine mümkün olduğunca eşit bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe ileri geri (kuzeyden güneye ve doğudan batıya) çalkalayın.
   3. Hücreleri 37 °C, %5 CO_2'de tutun. Sıvıyı, birleşme %50-70'e ulaşana kadar oyuk başına 500 μL kök hücre ortamı ile gün aşırı değiştirin. Ardından, plaka DE indüksiyonuna başlamaya hazırdır.
      NOT: DE indüksiyonundan önce hücrelerin %>70 birleşmeye ulaşmaması çok önemlidir, çünkü daha yüksek birleşme sonraki aşamalarda endoderm yoğunluğunu ve arka bağırsak morfogenezini olumsuz etkiler. İdeal olarak, hücreler belirtilen geçiş oranlarında 24-48 saat sonra yaklaşık% 50-70 birleşmeye ulaşır.
2. DE indüksiyonu
   1. Gün 1. hPSC'ler %50-70 birleşmeye ulaştığında, kök hücre ortamını her bir oyuktan tamamen aspire edin ve kuyucuk başına 500 μL ılık Gün 1 DE ortamı (Tablo 1) ile değiştirin. 37 ° C'de,% 5 CO₂ 24 saat inkübe edin.
   2. 2. Gün. Gün 1 DE'yi aspire edin ve kuyucuk başına 500 μL ılık Gün 2 DE (Tablo 1) ortamı ile değiştirin. 37 ° C'de,% 5 CO₂ 24 saat inkübe edin.
   3. 3. Gün. Gün 2 DE'yi aspire edin ve kuyucuk başına 500 μL ılık Gün 3 DE (Tablo 1) ortamı ile değiştirin. 37 ° C'de,% 5 CO₂ 24 saat inkübe edin.
3. Orta hindgut küresel oluşumu
   1. 4-8. Günler. Ortamı her bir oyuktan tamamen aspire edin ve oyuk başına 500 μL ılık Orta arka bağırsak ortamı (MHGM, Tablo 1) ile değiştirin. 37 ° C'de,% 5 CO_2'de inkübe edin. Bu adımı, orta arka bağırsak sferoidlerinin toplama ve birlikte kültürleme için hazır olduğu 8. güne kadar her gün tekrarlayın (Bölüm 4).

4. ENCC'lerle orta hindgut sferoidlerinin ortak kültürü

NOT: Bu bölümün grafik özeti Şekil 1'de verilmiştir.

1. ENCC süspansiyonunun hazırlanması
   1. Adım 2.4.4'ten itibaren 15-21. gün ENCC sferoidlerini toplayın. Ortamı kuyudan dikkatlice çıkararak, bu adımın notunda açıklanan girdap yöntemini kullanarak sferoidleri aspire etmekten kaçınarak.
   2. Kuyucuğa 1 mL ılık enzimatik hücre ayırma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   3. Sferoidleri ayırmaya devam etmek için plakanın yan tarafına hafifçe vurun ve karışım homojen olana kadar hücre kümelerini parçalamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek geniş ağızlı bir uca sahip bir P1000 mikropipet ile ezin.
   4. ENCC süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Kalan hücreleri toplamak için kuyuyu 1 mL ılık NCC ortamıyla yıkayın (bkz. Tablo 1) ve bunu 15 mL konik tüpe ekleyin.
   5. Hücre süspansiyonunu 300 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı steril bir pipet ucu ile aspire edin.
   6. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, hücre peletini 1 mL ılık NCC ortamında yeniden süspanse edin. Bir hematitometre veya hücre sayacı kullanarak ENCC süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplayın.
2. ENCC süspansiyonunun orta arka bağırsak sferoidleri ile birleştirilmesi
   1. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak bir HIO plakasının tüm kuyucuklarından orta arka bağırsak sferoidlerini toplayın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
   2. 24 oyuklu bir plaka içinde kullanılacak kokültür kuyularının sayısını belirleyin. Kokültür için kuyu başına 10-30 orta hindgut sferoidi ve 50.000-100.000 ENCC plakalamayı hedefleyin.
      NOT: Uygulamada, sağlıklı sferoidlere sahip kuyucukların sayısı ile kokültür için ihtiyaç duyulacak son kuyu sayısı arasında genellikle bire bir ilişki vardır. Toplanan orta hindgut sferoidlerinin konsantrasyonunu hesaplamak için bir hemositometre de kullanılabilir.
   3. Planlanan kokültür kuyusu başına 50.000-100.000 ENCC'yi orta arka bağırsak sferoidleri ile konik tüpe iletmek için hesaplanan ENCC süspansiyon hacmini ekleyin. Orta arka bağırsak sferoidlerini ve ENCC'leri eşit şekilde karıştırmak için geniş ağızlı bir pipet ucuyla hafifçe ezin.
   4. 300 × g'da 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı steril bir pipet ucu ile dikkatlice aspire edin. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, hücre peletini nihai kokültür kuyusu başına 30 μL'ye eşit, soğuk, fenol içermeyen (berrak), büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi hacminde yeniden süspanse edin.
      NOT: Yeniden süspansiyon sırasında şeffaf bazal membran matrisinde kabarcıklar oluşturmaktan kaçının, çünkü bunların çıkarılması zordur, ortamın HIO+ENCC kokültürleri tarafından uygun şekilde emilmesini engelleyecek ve büyüdükçe HIO+ENCC kokültürlerinin görselleştirilmesini azaltacaktır.
   5. Her kuru kuyunun merkezine, 30 μL'lik bir damla yeniden süspanse edilmiş orta arka bağırsak sferoidleri + ENCC'leri, çevreleyen herhangi bir ortam olmadan şeffaf bir bazal membran matrisinde pipetleyin. Tüm damlacıklar kuyucuklara kaplandıktan sonra, plakayı örtün ve ters çevirin. 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 30 dakika ters çevrilerek inkübe edin.
      NOT: Bu adım, orta arka bağırsak sferoidlerinin ve ENCC'lerin plakanın altından düşmesi ve şeffaf 3D bazal membran matrisinin polimerizasyonu sırasında askıda kalması için zaman tanır.
3. In Vitro HIO+ENS kokültürü
   1. Gün 0: Şeffaf bazal membran matrisi polimerize olduktan sonra, her damlacığı 500 μL ılık Gün 0-3 HIO ortamıyla örtün (bkz. Tablo 1).
   2. 3. Gün: Şeffaf bazal membran matris damlacığını bozmadan, Gün 0-3 HIO ortamını kuyunun yanından dikkatlice aspire edin. Ortamı 500 μL ılık Gün 3-14 HIO ortamıyla değiştirin (bkz. Tablo 1). Plakayı inkübatöre geri koyun. Bu aşamada, medyayı her 3-4 günde bir değiştirin.
   3. 7-14. Günler: 3-14. Gün HIO ortamını her 3-4 günde bir gerektiği gibi değiştirmeye devam edin ve büyümeyi izleyin.
4. HIO'ları bölme
   1. 14. Gün: Her bir kuyuyu mikroskop altında dikkatlice inceleyin ve her bir şeffaf 3D bazal membran matris damlacığında kaç tane gelişmekte olan HIO + ENS olduğunu değerlendirin.
   2. 30 μL şeffaf bazal membran matrisli 2 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın ve bunları buz üzerinde tutun.
   3. Laminer akış başlığı altında, askıya alınmış HIO+ENS ile şeffaf 3D bodrum membranı matris damlacığını dikkatlice çıkarmak için ince forseps kullanın. Tek tek HIO+ENS'leri nazikçe ayırın.
      NOT: Cerrahi luplar veya diseksiyon mikroskobu bu aşamada çok yardımcı olabilir, ancak HIO'lar genellikle çıplak gözle büyük ölçüde görülebildiğinden kesinlikle gerekli değildir.
   4. Her izole edilmiş HIO + ENS'yi, forseps veya geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak 30 μL şeffaf bazal membran matrisi içeren hazırlanmış mikrosantrifüj tüplerinden birine yerleştirin.
      NOT: Eski şeffaf 3D bazal membran matrisinin bu aşamada sıvılaştırılmasına veya çözülmesine gerek yoktur. Mümkünse HIO'ları bozmaktan kaçının, ancak bu meydana gelirse sonraki aşamalarda yine de büyüyebilir.
   5. Bölünmüş ve yeniden kaplanmış HIO+ENS için 4.2.5 adımını tekrarlayın. Berrak 3D bazal membran damlacıkları polimerize edildikten sonra, her bir oyuğa 500 μL ılık, taze Gün 3-14 HIO ortamı ekleyin ve gece boyunca inkübe edin.
5. HIO+ENS ortak kültürü devam etti
   1. 15. Gün: Gün 3-14 HIO ortamını kuyunun yanından dikkatlice aspire edin. Ortamı 500 μL ılık Gün 15-28 HIO ortamıyla değiştirin (bkz. Tablo 1).
   2. 15-40. Gün: Her 3-4 günde bir 15-28. gün HIO ortamını gerektiği gibi değiştirmeye ve HIO + ENCC büyümesini izlemeye devam edin.

Sonuçlar

ENS, peristaltizm, besin emilimi, sıvı taşınması ve epitel bariyeri bakımı dahil olmak üzere olgun ince bağırsağın temel işlevlerini düzenler. Bu nedenle, HIO'ları innerve etmenin amacı, bu yapılara daha olgun, daha üst düzey işlevsellik geliştirmek için gereken unsurları sağlamaktır. Bu amaçla, laboratuvarımız özellikle HIO'lar içinde ENS'nin gelişimini ve farklı aşamalardaki işlevsel sonuçları inceler.

Bir sonraki aşamaya...

Tartışmalar

HIO'lar, 2010'ların başından beri insan bağırsak gelişimi için bir model sistem olarak kullanılmaktadır ve o zamandan beri giderek daha karmaşık hale gelmiştir. Artık bu yapılara bir ENS sağlamak mümkündür, bu da bir dizi klinik gastrointestinal varlığın anlaşılması ve daha iyi tedavi edilmesi için uygulanabilecek normal gelişim çalışmasında yeni fırsatlara izin verir.

İn vivo transplantasyon

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)	ThermoFischer Scientific	11140050
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	12565269
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	ThermoFischer Scientific	12587010	For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	17504044	For HIO
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific	3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated	VWR	29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well	VWR	29442-042
Essential 6 Media	Thermo Fischer	A1516401
Essential 8 Media	Thermo Fischer	A2858501	Alternative stem cell media, used for ENCC plates.
Fine-tip forceps	Dumont	11223-20
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific	50145522
Gibco Advanced DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010
Gibco HEPES 1 M	ThermoFischer Scientific	15630-080
Gibco Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103-049
Glutagro, 200 mM, 100x	Corning	25-015-CI
Glutamax	ThermoFischer Scientific	35050061
H9 human ESC	Wicell International Stem Cell Bank	N/A
HyCloneTM FBS Defined	VWR	16777-002
LabGard Biological Safety Cabinet	Nuaire	Nu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356231	"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	"3D basement membrane matrix"
Micropipettes	Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)	2231300008
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	"stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance.
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048	For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)	Thermo Fisher	A1370701	For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope	Nikon	TS100
Noggin-conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFischer Scientific	15140-122
Recombinant Human Activin A	Cell Guidance Systems	GFH6-100
Recombinant Human BMP-4	Fisher Scientific	314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CF	ThermoFisher Scientific	236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein	ThermoFischer Scientific	233-FB-010
Recombinant Human FGF-4	Peprotech	100-31
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872	"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acid	SIGMA	R2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL	Thermo Scientific	AM12425
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer Scientific	11875093
R-Spondin conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
SB 431542, Tocris Bioscience	Fisher Scientific	16-141-0
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor Tips	VWR	89049-166
Stemolecule Chir99021 in Solution	Stemgent	04-0004-02
Sterile filter pipette tips	VWR (1000uL, 200uL, 10uL)	76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XF	Stem Cell Technologies	7180	Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates.