Иннервация органоидов кишечника человека

Резюме

Органоиды кишечника человека должны быть иннервированы для лучшего восстановления структуры и функции нативного кишечника человека. Здесь мы представляем один из методов включения энтеральной нервной системы в эти конструкции.

Аннотация

Сложность цитоархитектуры и функции кишечника создает значительные проблемы для создания биоинженерной тонкой кишки. Ранее сообщалось о методах получения кишечных органоидов человека (HIO), напоминающих тонкую кишку человека. ГИО содержат эпителий и мезенхиму, но не содержат других важных компонентов функционального кишечника, таких как энтеральная нервная система (ЭНС), иммунные клетки, сосуды и микробиом. Две независимые исследовательские группы опубликовали различные методы иннервации ГИО с помощью ЭНС. В этой статье мы обсуждаем уникальный метод включения ЭНС в биоинженерный тонкий кишечник, полученный из HIO, который использует компоненты этих предыдущих отчетов для оптимизации идентификации клеток-предшественников, а также времени развития.

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) дифференцируются для независимого образования HIO и клеток кишечного нервного гребня (ENCC) путем временной регуляции маркеров дифференцировки в течение нескольких дней в соответствии с опубликованными протоколами. Как только HIO достигают стадии сфероидов средней части задней кишки (примерно на 8-й день), сфероиды ENCC на 15-21-й день диссоциируют, совместно культивируют с HIO и суспензируют в прозрачных трехмерных (3D) каплях матрицы базальной мембраны. Кокультуры HIO + ENCC поддерживаются in vitro в течение 28-40 дней перед трансплантацией >9-недельным мышам с иммунодефицитом для дальнейшего развития и созревания. Трансплантированные HIO (tHIOs) с ENS можно собирать через 4-20 недель. Этот метод объединяет элементы двух ранее опубликованных методов, используя ENCC, полученные из hPSCs, и совместно культивируя их с HIO на ранней стадии развития, чтобы максимизировать воздействие сигналов раннего развития, которые, вероятно, способствуют формированию более зрелой морфологии кишечника.

Введение

Тонкий кишечник человека является сложным многослойным органом, который выполняет множество важных функций, таких как пищеварение, усвоение питательных веществ, регуляция жидкости, функция иммунного барьера и моторика. Многочисленные клинические заболевания, такие как синдром короткой кишки, энтеропатии или нарушения моторики, характеризуются критическим снижением кишечной массы или нарушением нормальной физиологии, что приводит к значительной заболеваемости и смертности 1,2,3,4. Современные варианты лечения часто включают хирургическое вмешательство по удалению дисфункциональной кишки за счет уменьшения длины кишечника и, следовательно, функциональной емкости оставшейся кишки^. Существует потребность в регенеративной терапии, которая является аддитивной по своей природе, увеличивая функциональную емкость кишечника и восстанавливая его функцию способами, которые современные терапевтические парадигмы не могут достичь.

Биоинженерная тонкая кишка является многообещающим решением этих проблем. Кишечные органоиды человека (HIO), полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs), являются одним из исходных материалов для биоинженерной тонкой кишки. В 2011 году Spence et al. впервые сообщили об успешном создании современных HIO из линий hPSC, включая как H1, так и H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC) и множественные человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) линий ^6,7. Их протокол включал в себя тщательно рассчитанную по времени серию инкубаций со специфическими факторами роста, чтобы имитировать развитие кишечника плода человека. Активин А, сигнальная молекула TGFβ, стимулирует дифференцировку hPSC в сторону эндодермальной судьбы с последующим направленным задним паттернированием с помощью Wnt/FGF. В этих условиях hPSCs самоорганизуются с образованием кишечных сфероидов, содержащих поляризованный эпителий и мезенхиму. 3D-культура в матрице базальной мембраны позволяет дополнительно развиваться, в результате чего образуются органоиды с внутренним просветом, ворсинчатыми инволюциями эпителия и самовосстанавливающимися прогениторными клеточными нишами в криптоподобных структурах.

В то время как ГИО, созданные с использованием этого оригинального протокола 2011 года, структурно напоминают нативный кишечник, им не хватает способности генерировать нейроны или глии энтеральной нервной системы (ЭНС). В 2017 году в двух крупных работах были описаны похожие, но разные методы иннервации HIO. Предшественники ЭНС (клетки кишечного нервного гребня, ЭНКК) могут быть получены из ЧПСК. В культуре ЭНХК образуют трехмерные нейросферы, которые при соответствующих условиях могут дифференцироваться в энтеральные нейроны и глию. Workman and Mahe et al. модифицировали существующий протокол для получения ENCCs из hPSC и обрабатывали их средами, обогащенными FGF, с последующей ретиноевой кислотой в течение 2 дней для постериоризации и улучшения блуждающей судьбы ^8,9. Нейросферы 6-го дня инкубировали еще 4 дня без РА, а затем собирали мигрировавшие клетки после ферментативной отслойки. Приблизительно 20 000-50 000 ENCC были агрегированы с ранними сфероидами средней части задней кишки, и эти кишечные сфероиды, посеянные ENCC, были выращены in vitro в прозрачной 3D матрице базальной мембраны в течение 28 дней до приживления in vivo в капсулу почки иммунодефицитных мышей в течение 6-10 недель. Полученная в результате HIO + ENS продемонстрировала значительное созревание эпителиального и мезенхимального компонентов, а также нейроглиальных структур, сходных с ганглиями, хотя и с более низкой плотностью клеточного тела, чем в нативной кишке, отсутствие некоторых клинически значимых подтипов нейронов (т.е. CHAT-положительных нейронов в HIO + ENS после трансплантации) и общие фетальные характеристики.

В том же году Schlieve et al. опубликовали альтернативный метод, включающий смесь 40-60 интактных нейросфер ENCC на 15-й день с более зрелыми HIO во время трансплантации in vivo в сальник иммунодефицитных мышей в течение 3 месяцев без предварительного совместного культивирования in vitro ¹⁰. Их конструкции, названные ENCC-HIO-TESI (тканевая инженерия тонкой кишки), по-видимому, содержали более зрелый фенотип ENS, чем у HIO + ENS Уоркмана и Маэ, с большим разнообразием нейронных подтипов и нейроэпителиальными синаптическими связями, не наблюдаемыми при HIO + ENS. Важно отметить, что ENCC, использованные в экспериментах Шливе, были получены с помощью другого метода, описанного ранее Фаттахи и ^др.11. Вкратце, hPSCs (как hESCs, так и hiPSCs) подвергались индукции нервного гребня в средах, обогащенных FGF2. Эти клетки также обрабатывали РА для установления внутрикишечной судьбы блуждающего нерва, но в течение 5 дней (6-11 дни), увеличение по сравнению с 2 днями Уоркмана и Маэ (4-5 день). В 2019 году Barber et al. опубликовали пересмотренную версию протокола Фаттахи, включающую более подробное описание условий культивирования и переход к определенным базальным средам для уменьшения несогласованности и отражения изменения предпочтений клеточных культур^{на тот момент}.

Наш метод иннервации HIO, подробно описанный ниже, включает в себя элементы протоколов Workman/Mahe и Schlieve. В то время как ЭНС в ENCC-HIO-TESI Шливе оказалась более зрелой с большим разнообразием нейронов и нейроглиальной интеграцией, оба метода успешно интегрировали функциональную ЭНС в HIO, продемонстрировав изменения в экспрессии транскрипции желудочно-кишечного тракта. HIO + ENS Уоркмана и Маэ индуцировал повышенную экспрессию нескольких генов, связанных с кишечными стволовыми клетками и развитием эпителиальных клеток, которые не были изменены при ENCC-HIO-TESI. Одним из возможных объяснений этих различий являются различные временные точки, когда ENCC и HIO были объединены между протоколами. Наша лаборатория заметила, что ранняя кокультура приводит к увеличению экспрессии нескольких генов, участвующих в эпителиальной и мезенхимальной дифференцировке, а время кокультуры влияет на разнообразие эпителиальных клеток (неопубликованные данные). Возможно, что более раннее воздействие предшественников ЭНС на развивающиеся HIO и наоборот дает время для еще неопределенных перекрестных сигнальных помех, которые способствуют эпителиальному разнообразию и другим процессам раннего развития.

протокол

Линия H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC) была получена компанией WiCell (Мэдисон, штат Висконсин), и все эксперименты с использованием hESCs были одобрены Комитетом по надзору за исследованиями стволовых клеток (SCRO) UTHealth Houston (протокол #SCRO-23-01). В данном протоколе все ссылки на пластины или лунки с покрытием относятся к пластинам или лункам, изготовленным с использованием матрицы 3D-базальной мембраны, сертифицированной по стандарту hESC.

1. Подготовка клеточной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Наша лаборатория использует H9 hESCs, но несколько линий hPSC были успешно использованы другими лабораториями для создания HIO и ENCC, включая H9 hESCs ^9,10,12, H1 hESCs⁹, линию hESC UCSF4¹² и несколько линий hiPSC, таких как WTC11¹², WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f⁹, WTC10 ^9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)⁹ и WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)⁹.

1. Подготовьте 6-луночный планшет, покрыв каждую желаемую лунку 3D-матрицей базальной мембраны, разведенной в соответствующей среде для клеточной культуры (коэффициент разведения и инструкции по приготовлению можно найти в техническом паспорте материала). Покройте каждую нужную лунку по 1 мл на лунку и инкубируйте при 37 °C в течение не менее 1 ч или в течение ночи до нанесения покрытий на ячейки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть дополнен клетками только из одной лунки или увеличен по мере необходимости. Для начала мы рекомендуем наносить покрытие не менее чем в три лунки, чтобы облегчить дополнительное прохождение и поддержание недифференцированных hPSCs.
   Важно сохранять матрицу базальной мембраны холодной во время работы, так как большинство матриц начинают полимеризоваться при комнатной температуре. Лунки с покрытием пригодны для использования до 2-3 недель при хранении при температуре 37 °C. Храните с достаточным разбавителем, чтобы покрыть всю лунку, чтобы предотвратить высыхание покрытия.
2. Разморозьте hPSCs (в идеале с низким числом проходимости), кратковременно взболтав в теплой водяной бане. Под ламинарным проточным колпаком ресуспендируйте один флакон клеток в 2 мл среды стволовых клеток (табл. 1). Отсадите разбавитель из одной лунки с предварительно покрытым покрытием в 6-луночной чашке непосредственно перед покрытием клеток, затем перенесите все 2 мл ресуспендированных клеток в лунку с покрытием. Для поддержания недифференцированных hPSCs (называемых поддерживающими планшетами) инкубируйте при 37 °C, 5%_CO2 и меняйте среду через день по 2 мл среды стволовых клеток на лунку.
3. Пропускайте клетки, когда они достигнут 70-80% конфлюенции. Отсасывайте среду со стороны лунки, не нарушая клетки. Добавьте в лунку 1 мл реагента для диссоциации стволовых клеток комнатной температуры и аспирируйте его в течение 1 минуты, оставляя над клетками тонкую пленку жидкости. Выдерживайте тарелку в течение 5 минут при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидание, пока клетки превысят 80% конфлюенции для пассажа, может вызвать проблемы с преждевременной дифференцировкой, что приведет к снижению выхода на последующих этапах.
4. Добавьте 1 мл на лунку теплой среды для стволовых клеток и постучите по боковой стороне планшета, чтобы удалить колонии. Осторожно наносите средства для дозирования с помощью микропипетки P1000 с наконечником пипетки с широким горлышком (см. Таблицу материалов), чтобы разбить колонии и свести к минимуму повреждение клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При растирании клеточной суспензии рекомендуется разбивать большие скопления клеток, но позволять меньшим скоплениям оставаться неповрежденными. Не рекомендуется использовать одноклеточную суспензию, а стремиться к меньшему количеству небольших колоний, равномерно распределенных по всей лунке.
5. Отсадите разбавитель из предварительно покрытой лунки в 6-луночной чашке и добавьте 2 мл теплой среды стволовых клеток. Перенесите желаемый объем клеточной суспензии в эту лунку для поддержания колоний hPSC, меняя среду через день по 2 мл среды стволовых клеток на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наша лаборатория обычно перекачивает объемы от 50 до 150 μл, чтобы обеспечить возможность прохождения планшетов для технического обслуживания hPSC один раз в неделю. Этот объем может варьироваться в зависимости от конкретной линии hPSC и номера прохода и, таким образом, может потребовать регулировки. Используйте оставшиеся ячейки для инициации генерации ENCC (раздел 2) или генерации HIO (раздел 3). Недавно размороженные hPSCs должны быть пройдены не менее двух раз, прежде чем перейти к генерации ENCC или HIO.

2. Генерация ENCC

ПРИМЕЧАНИЕ: Наш метод генерации ENCC очень похож на метод, описанный лабораторией Фаттахи и использованный Шливе и ^др.10. Мы используем слегка измененную версию протокола B в разделах «Индукция кишечного нервного гребня (ENC) (дни 0-12)» и «Формирование сфероидов ENCC (день 12-15)» в Barber et ^al.10,12.

1. Отсадите разбавитель из ранее покрытой лунки в новую 6-луночную чашку и добавьте 2 мл теплой среды для стволовых клеток. Перенесите 850 мкл суспензии клеток hPSC со стадии 1,5 в ту же лунку (обычно коэффициент пропускания 5:6).
2. Поддерживайте температуру клеток при 37 °C, 5% CO₂. Меняйте среду через день по 2 мл среды стволовых клеток на лунку до тех пор, пока конфлюенция не достигнет 60-80%. После этого пластина готова к началу индукции ENC.
3. Индукционная система ENC
   1. День 0. Отсадите среду со стороны лунки и добавьте 2 мл теплой среды Коктейль А (табл. 1). Возвращение в инкубатор на 48 ч.
   2. День 2. Отсадите фильтрующий материал для коктейля А со стороны лунки и замените 2 мл теплого фильтрующего материала для коктейля В (табл. 1). Возвращение в инкубатор на 48 ч.
   3. День 4. Отсадите фильтрующий материал для коктейля B со стороны лунки и замените 2 мл свежего, теплого фильтрующего материала для коктейля B. Возвращение в инкубатор на 48 ч.
   4. Дни 6-12. Отсадите фильтрующий материал для коктейля В со стороны лунки и замените 2 мл теплого фильтрующего материала для коктейля С (табл. 1). Вернитесь в инкубатор и заменяйте среду 2 мл свежего теплого коктейля C каждые 48 часов до завершения индукции ЭНК на 12-й день.
      Примечание: На данном этапе линии ENC могут быть подтверждены с помощью анализа экспрессии генов, как описано Barber et ^al.12.
4. Формирование сфероида ENCC
   1. День 13. Аспирация коктейля С среды со стороны лунки. Добавьте 1 мл теплого реагента для отсоединения ферментативных клеток и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Постучите по боковой стороне планшета, чтобы выбить клетки, и перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл с помощью наконечника пипетки с широким горлышком. Промойте лунку 1 мл фильтрующего материала Neural Crest Cell (NCC) (Таблица 1) и добавьте промывки в коническую трубку объемом 15 мл.
   2. Центрифугируйте клеточную суспензию в конической пробирке объемом 15 мл при 300 × г в течение 1 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость. Аккуратно суспендируйте гранулу в 2 мл теплого фильтрующего материала NCC.
   3. Добавьте ресуспендированные клетки в новую, не покрытую покрытием лунку планшета со сверхнизким уровнем связывания и инкубируйте при 37 °C, 5%_CO2 в течение 48 часов.
   4. Дни 15-21. Контролируйте рост сфероидов ENCC и заменяйте среды 2 мл свежих, теплых сред NCC каждые 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смена среды должна выполняться с осторожностью, чтобы не повредить или не отсасывать сфероиды ENCC. Лучше всего это достигается путем вращения пластины круговыми движениями, чтобы сфокусировать сфероиды в середине скважины, а затем аспирации среды от края скважины.
      Формирование сфероидов ENCC обычно завершается к 15-му дню, хотя приемлемо культивировать их до 21-го дня, чтобы обеспечить идеальное время сокультуры со сфероидами средней задней кишки.

3. Генерация HIO (сфероидальная фаза средней части задней кишки)

Примечание: Наш метод генерации HIO принципиально идентичен оригинальному протоколу, подробно описанному McCracken et al. и другими из лабораторий Spence and Wells ^6,7. Процесс происходит в две фазы: дефинитивная индукция энтодермы (ДЭ) и формирование сфероида средней части задней кишки.

1. Подготовка к генерации HIO
   1. Подготовьте 24-луночный планшет, покрыв каждую желаемую лунку 3D-матрицей базальной мембраны, разведенной в соответствующей среде для клеточной культуры (коэффициент разбавления и инструкции по приготовлению можно найти в техническом описании материала). Покройте каждую желаемую лунку 500 мкл на лунку и инкубируйте при 37 °C в течение не менее 1 ч или в течение ночи для схватывания перед нанесением покрытий на ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно держать матрицу базальной мембраны холодной во время работы, так как большинство матриц начинают полимеризоваться при комнатной температуре. Лунки с покрытием пригодны для использования до 2-3 недель при хранении при температуре 37 °C. Храните с достаточным количеством разбавителя, чтобы покрыть всю лунку, чтобы предотвратить высыхание покрытия.
      Запланируйте покрытие 6 лунок 24-луночной пластины для каждой 1 лунки из 6-луночных пластин для технического обслуживания hPSC, описанных выше. Это соотношение может быть увеличено по желанию.
   2. Отсадите разбавитель из всех предварительно покрытых лунок в 24-луночной чашке. Добавьте достаточное количество теплой среды стволовых клеток в суспензию клеток hPSC с шага 1,5 и распределите по 500 мкл в каждую лунку (например, если после прохождения поддерживающей пластины hPSC остается 850 мкл суспензии клеток hPSC, то для 6 лунок 24-луночного планшета смешайте 2 150 мкл теплой среды стволовых клеток с 850 μл суспензии клеток hPSC с этапа 1,5, и 500 μL распределены в каждой из 6 лунок).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мы обычно проходим планшеты для технического обслуживания hPSC объемом 50-150 μл, у нас обычно есть объемы 850-950 μЛ, доступные для этого этапа. Таким образом, объем hPSCs на лунку в 24-луночном планшете приближается к 150 мкл/лунка.
      После того, как только что подготовленная 24-луночная пластина будет помещена в инкубатор, осторожно перемешивайте пластину вперед и назад (с севера на юг и с востока на запад), чтобы распределить ячейки как можно более равномерно по дну лунки.
   3. Поддерживайте температуру клеток при 37 °C, 5% CO₂. Меняйте среду через день по 500 мкл среды стволовых клеток на лунку до тех пор, пока сливаемость не достигнет 50-70%. Затем пластина готова к началу индукции ДЭ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы клетки не достигали >70% конфлюенции до индукции ДЭ, так как более высокая конфлюенция отрицательно влияет на плотность энтодермы и морфогенез задней кишки на последующих стадиях. В идеале клетки достигают примерно 50-70% конфлюенции через 24-48 ч при заданных коэффициентах пассажа.
2. Индукция DE
   1. День 1. Как только слияние hPSCs достигнет 50-70%, полностью отсасывайте среду стволовых клеток из каждой лунки и замените 500 мкл теплой среды Day 1 DE (Таблица 1) на лунку. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 часов.
   2. День 2. Отсадите Day 1 DE и замените 500 мкл теплого фильтрующего материала Day 2 DE (Таблица 1) на лунку. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 часов.
   3. День 3. Отсадите Day 2 DE и замените 500 мкл теплого фильтрующего материала Day 3 DE (Таблица 1) на лунку. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 часов.
3. Формирование сфероида средней части задней кишки
   1. Дни 4-8. Полностью отасуньте среду из каждой лунки и замените 500 мкл теплой среды средней задней кишки (MHGM, таблица 1) на лунку. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2. Повторяйте этот шаг ежедневно до дня 8, когда сфероиды средней задней кишки будут готовы к сбору и совместному выращиванию (раздел 4).

4. Кокультура сфероидов средней задней кишки с ENCC

ПРИМЕЧАНИЕ: Графическое резюме этого раздела представлено на рисунке 1.

1. Приготовление суспензии ENCC
   1. Соберите сфероиды ENCC на 15-21 день с шага 2.4.4. Осторожно удаляя среду из лунки, избегая аспирации сфероидов с помощью метода завихрения, описанного в примечании к этому этапу.
   2. Добавьте в лунку 1 мл теплого реагента для отсоединения ферментативных клеток и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
   3. Постукивайте по боковой стороне планшета, чтобы продолжить диссоциацию сфероидов, и растирайте микропипеткой P1000 с широким горлышком, осторожно пипетируя вверх и вниз, чтобы разбить скопления клеток до тех пор, пока смесь не станет однородной.
   4. Перенесите суспензию ENCC в коническую трубку объемом 15 мл. Промойте лунку 1 мл теплого фильтрующего материала NCC (см. Таблицу 1), чтобы собрать оставшиеся клетки, и добавьте его в коническую пробирку объемом 15 мл.
   5. Центрифугировать клеточную суспензию при 300 × г в течение 1 мин. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью стерильного наконечника пипетки.
   6. С помощью наконечника пипетки с широким горлышком ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл теплой среды NCC. Рассчитайте концентрацию суспензии ENCC с помощью гемацитометра или счетчика клеток.
2. Комбинирование суспензии ENCC со сфероидами средней задней кишки
   1. Соберите сфероиды средней части задней кишки из всех лунок планшета HIO с помощью наконечника пипетки с широким горлышком и перенесите в коническую пробирку объемом 15 мл.
   2. Определите количество кокультурных лунок, которые будут использоваться в 24-луночной пластине. Стремитесь к 10-30 сфероидам средней задней кишки и 50 000-100 000 ENCC на лунку для кокультуры.
      Примечание: На практике часто существует взаимно однозначная зависимость между количеством лунок со здоровыми сфероидами и конечным числом лунок, которые потребуются для кокультуры. Гемоцитометр также может быть использован для расчета концентрации собранных сфероидов средней задней кишки.
   3. Сложите расчетный объем суспензии ENCC, чтобы доставить 50 000-100 000 ENCC на запланированную скважину для совместной культуры в коническую трубку со сфероидами средней задней кишки. Аккуратно растирайте кончиком пипетки с широким горлышком, чтобы равномерно смешать сфероиды средней части задней кишки и ЭНХК.
   4. Центрифугируйте при 300 × г в течение 1 мин и осторожно отсасывайте надосадочную жидкость стерильным наконечником пипетки. С помощью наконечника пипетки с широким горлышком ресуспендируйте клеточную гранулу в объеме холодной, не содержащей фенола (прозрачной) матрицы базальной мембраны с пониженным фактором роста, равной 30 мкл на конечную лунку для кокультуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков в прозрачной матрице базальной мембраны во время ресуспендирования, так как их трудно удалить, это будет препятствовать надлежащему впитыванию среды кокультурами HIO+ENCC и уменьшит визуализацию кокультур HIO+ENCC по мере их роста.
   5. В центр каждой сухой лунки пипеткой капля объемом 30 мкл ресуспендированных сфероидов средней части задней кишки + ENCCs в прозрачной матрице базальной мембраны без какой-либо окружающей среды. Как только все капли будут нанесены в лунки, накройте и переверните пластину. Инкубировать в перевернутом состоянии при 37 °C, 5%_CO2 в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап дает время для того, чтобы сфероиды средней задней кишки и ENCC отпали от нижней части пластины и стали взвешенными во время полимеризации прозрачной матрицы 3D-базальной мембраны.
3. В пробирке Кокультура HIO+ENS
   1. День 0: После того, как прозрачная матрица базальной мембраны полимеризуется, покройте каждую каплю 500 мкл теплой среды Day 0-3 HIO (см. Таблицу 1).
   2. День 3: Осторожно отсасывайте среду Day 0-3 HIO со стороны лунки, не нарушая каплю чистой матрицы базальной мембраны. Замените среду на 500 мкл теплой среды Day 3-14 HIO (см. Таблицу 1). Верните тарелку в инкубатор. На этом этапе меняйте носители каждые 3-4 дня.
   3. Дни 7-14: Продолжайте заменять среды HIO для дней 3-14 по мере необходимости каждые 3-4 дня и следите за ростом.
4. Разделение HIO
   1. День 14: Внимательно осмотрите каждую лунку под микроскопом и оцените, сколько развивающихся HIO + ENS содержится в каждой чистой 3D-капле матрицы базальной мембраны.
   2. Приготовьте микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл с 30 мкл прозрачной матрицы базальной мембраны и держите их на льду.
   3. Под колпаком с ламинарным потоком с помощью тонких щипцов осторожно удалите прозрачную каплю матрицы базальной мембраны 3D с помощью подвешенного HIO+ENS. Аккуратно раздразните отдельные HIO+ENS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические лупы или препарирующий микроскоп могут быть очень полезны на этом этапе, но они не являются строго необходимыми, поскольку HIO часто сильно видны невооруженным глазом.
   4. Поместите каждую изолированную HIO + ENS в одну из подготовленных микроцентрифужных пробирок, содержащую 30 мкл прозрачной матрицы базальной мембраны, с помощью щипцов или наконечника для пипетки с широким горлышком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старая прозрачная матрица 3D базальной мембраны не нуждается в разжижении или растворении на данном этапе. По возможности избегайте нарушения HIO, хотя в этом случае они все еще могут расти на более поздних стадиях.
   5. Повторите шаг 4.2.5 для разделенного и повторно покрытого HIO+ENS. После того, как прозрачные капли 3D базальной мембраны полимеризуются, добавьте 500 μл теплой, свежей среды Day 3-14 HIO в каждую лунку и инкубируйте в течение ночи.
5. Продолжение кокультуры HIO+ENS
   1. День 15: Осторожно отсасывайте среду HIO на 3-14 день со стороны лунки. Замените среду на 500 мкл теплой среды Day 15-28 HIO (см. Таблицу 1).
   2. День 15-40: Продолжайте заменять среды HIO 15-28 дня по мере необходимости каждые 3-4 дня и контролируйте рост HIO + ENCC.

Результаты

ЭНС регулирует основные функции зрелого тонкого кишечника, включая перистальтику, всасывание питательных веществ, транспортировку жидкости и поддержание эпителиального барьера. Таким образом, цель иннервации HIO состоит в том, чтобы снабдить эти конструкции элемент?...

Обсуждение

ГИО используются в качестве модельной системы для развития кишечника человека с начала 2010-х годов и с тех пор становятся все более сложными. В настоящее время стало возможным снабдить эти конструкции ЭНС, что открывает новые возможности в изучении нормального развит?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)	ThermoFischer Scientific	11140050
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	12565269
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	ThermoFischer Scientific	12587010	For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	17504044	For HIO
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific	3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated	VWR	29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well	VWR	29442-042
Essential 6 Media	Thermo Fischer	A1516401
Essential 8 Media	Thermo Fischer	A2858501	Alternative stem cell media, used for ENCC plates.
Fine-tip forceps	Dumont	11223-20
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific	50145522
Gibco Advanced DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010
Gibco HEPES 1 M	ThermoFischer Scientific	15630-080
Gibco Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103-049
Glutagro, 200 mM, 100x	Corning	25-015-CI
Glutamax	ThermoFischer Scientific	35050061
H9 human ESC	Wicell International Stem Cell Bank	N/A
HyCloneTM FBS Defined	VWR	16777-002
LabGard Biological Safety Cabinet	Nuaire	Nu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356231	"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	"3D basement membrane matrix"
Micropipettes	Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)	2231300008
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	"stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance.
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048	For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)	Thermo Fisher	A1370701	For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope	Nikon	TS100
Noggin-conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFischer Scientific	15140-122
Recombinant Human Activin A	Cell Guidance Systems	GFH6-100
Recombinant Human BMP-4	Fisher Scientific	314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CF	ThermoFisher Scientific	236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein	ThermoFischer Scientific	233-FB-010
Recombinant Human FGF-4	Peprotech	100-31
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872	"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acid	SIGMA	R2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL	Thermo Scientific	AM12425
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer Scientific	11875093
R-Spondin conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
SB 431542, Tocris Bioscience	Fisher Scientific	16-141-0
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor Tips	VWR	89049-166
Stemolecule Chir99021 in Solution	Stemgent	04-0004-02
Sterile filter pipette tips	VWR (1000uL, 200uL, 10uL)	76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XF	Stem Cell Technologies	7180	Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates.