인간 장내 오가노이드(Intestinal Organoids)의 신경 분포(Nervation of Human Intestinal Organoids)

요약

인간 장 오가노이드는 천연 인간 장의 구조와 기능을 더 잘 재현할 수 있도록 신경을 분포시켜야 합니다. 여기에서는 장 신경계를 이러한 구조체에 통합하는 한 가지 방법을 제시합니다.

초록

장내 세포 구조와 기능의 복잡성은 생명공학적 소장 생성에 중대한 도전을 제기합니다. 인간의 소장과 유사한 인간 장 오가노이드(HIO)를 생성하는 기술은 이전에 보고된 바 있습니다. HIO는 상피와 중간엽을 포함하지만 장 신경계(ENS), 면역 세포, 혈관 구조 및 마이크로바이옴과 같은 기능 장의 다른 중요한 구성 요소가 부족합니다. 두 개의 독립적인 연구 그룹은 ENS로 HIO를 신경 분포시키는 고유한 방법을 발표했습니다. 여기에서는 ENS를 HIO 유래 생명공학 소장에 통합하는 고유한 방법에 대해 논의하며, 이는 이러한 이전 보고서의 구성 요소를 활용하여 전구 세포 식별과 발달 타이밍을 최적화합니다.

인간 만능 줄기 세포(hPSC)는 발표된 프로토콜에 따라 며칠 동안 분화 마커의 시간적 조절을 통해 HIO 및 장 신경능선 세포(ENCC)를 독립적으로 생성하도록 분화됩니다. HIO가 중장 스페로이드 단계(약 8일차)에 도달하면, 15-21일차 ENCC 스페로이드는 해리되고, HIO와 공동 배양되고, 투명한 3차원(3D) 기저막 매트릭스 방울 내에 부유합니다. HIO + ENCC 공동 배양은 추가 발달 및 성숙을 위해 >9주 된 면역 결핍 마우스에 이식하기 전에 28-40일 동안 체외 에서 유지됩니다. ENS가 있는 이식된 HIO(tHIO)는 4-20주 후에 수확할 수 있습니다. 이 방법은 hPSC에서 생성된 ENCC를 활용하고 개발 초기 단계에서 HIO와 공동 배양하여 보다 성숙한 장 형태 형성에 기여할 수 있는 초기 발달 신호에 대한 노출을 극대화함으로써 이전에 발표된 두 가지 기술의 요소를 통합합니다.

서문

인간의 소장은 소화, 영양소 흡수, 체액 조절, 면역 장벽 기능 및 운동성과 같은 수많은 필수 기능을 수행하는 복잡하고 다층적인 기관입니다. 단장 증후군(short bowel syndrome), 장 질환(enteropathy) 또는 운동성 장애(motility disorder)와 같은 수많은 임상 질환은 장 질량의 급격한 감소 또는 정상적인 생리적 장애로 인해 심각한 이환율과 사망률을 초래하는 것이 특징이다 1,2,3,4. 현재 치료법으로는 장 길이 감소를 대가로 기능 장애를 가진 장을 제거하는 수술이 포함되는 경우가 많다⁵. 현재의 치료 패러다임으로는 달성할 수 없는 방식으로 장내 기능을 향상시키고 장 기능을 회복하는 부가적인 재생 요법이 필요합니다.

생명공학적 소장은 이러한 문제에 대한 유망한 해결책입니다. 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 유래한 인간 장 오가노이드(HIO)는 생명공학 소장의 시작 물질 중 하나입니다. 2011년, Spence 등은 H1 및 H9 인간 배아 줄기 세포(hESC)와 다중 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 라인 ^6,7을 포함한 hPSC 라인에서 현대 HIO를 성공적으로 생성했다고 처음으로 보고했습니다. 그들의 프로토콜에는 인간 태아의 장 발달을 모방하기 위해 특정 성장 인자를 가진 신중한 시기의 일련의 배양이 포함되었습니다. TGFβ 신호 분자인 Activin A는 Wnt/FGF를 이용한 유도 후방 패터닝(posterior patterning)을 통해 hPSC의 분화를 유도합니다. 이러한 조건에서 hPSC는 자기 조직화하여 편광 상피와 중간엽을 포함하는 내장 스페로이드를 형성합니다. 기저막 매트릭스 내의 3D 배양은 추가 개발을 가능하게 하여 내부 내강을 가진 오가노이드, 상피의 융모 같은 인볼루션, crypt-like 구조 내의 자가 재생 전구 세포 틈새를 생성합니다.

이 2011년 오리지널 프로토콜을 사용하여 생성된 HIO는 구조적으로 천연 장과 유사하지만, 장 신경계(ENS)의 뉴런 또는 신경교세포를 생성할 수 있는 능력이 부족합니다. 2017년에 발표된 두 개의 주요 논문에서는 HIO를 신경 분포시키는 유사하지만 뚜렷한 방법을 설명했습니다. ENS 전구세포(장 신경능선 세포, ENCC)는 hPSC에서 파생될 수 있습니다. 배양에서 ENCC는 3D 신경구를 형성하며, 이는 적절한 조건에서 장 뉴런과 신경교세포로 분화할 수 있습니다. Workman과 Mahe 등은 hPSC에서 ENCC를 추출하기 위해 기존 프로토콜을 수정하고 FGF 농축 배지로 처리한 후 미주신경 운명의 사후 형성 및 촉진을 위해 2일 동안 레티노산으로 처리했습니다 ^8,9. 6일차 신경구를 RA 없이 4일 더 배양한 후, 효소 박리 후 이동한 세포를 수집했습니다. 대략 20,000-50,000개의 ENCC를 초기 중장 스페로이드로 집계하고, 이러한 ENCC 파종된 장 스페로이드를 6-10주 동안 면역결핍 마우스의 신장 캡슐에 생체 내 생착할 때까지 28일 동안 투명한 3D 기저막 매트릭스에서 체외에서 성장시켰습니다. 그 결과 HIO + ENS는 상피 및 중간엽 구성 요소의 상당한 성숙을 보여주었을 뿐만 아니라 신경교세포(neuroglia) 구조와 유사한 신경교세포(neuroglia) 구조가 본래 장보다 세포체 밀도가 낮고, 임상적으로 관련된 특정 신경 세포 아형(즉, 이식 후 HIO + ENS의 CHAT 양성 뉴런)이 없으며, 전반적으로 태아와 유사한 특성을 보였습니다.

같은 해, Schlieve 등은 40-60개의 손상되지 않은 15일차 ENCC 신경구와 더 성숙한 HIO를 사전 시험관 내 공동 배양 없이 3개월 동안 면역 결핍 마우스의 망막에 생체 내 이식 시 혼합하는 것을 포함하는 대체 방법을 발표했습니다¹⁰. ENCC-HIO-TESI(조직 공학 소장)라고 불리는 그들의 구조는 HIO + ENS에서 볼 수 없는 더 큰 신경 아형 다양성과 신경 상피 시냅스 연결을 가진 Workman과 Mahe의 HIO + ENS보다 더 성숙한 ENS 표현형을 포함하는 것으로 나타났습니다. 중요한 것은 Schlieve의 실험에 사용된 ENCC가 이전에 Fattahi et ^al.11에 의해 설명된 것처럼 다른 방법을 통해 파생되었다는 것입니다. 간단히 말해서, hPSC(hESC 및 hiPSC 모두)는 FGF2가 풍부한 배지에서 신경능선 유도를 받았습니다. 이 세포들은 또한 장 미주신경 운명을 확립하기 위해 RA로 처리되었지만, 5일(6-11일) 동안 Workman과 Mahe의 2일(4-5일)보다 증가했습니다. 2019년, Barber 등은 불일치를 줄이고 당시의 변화하는 세포 배양 선호도를 반영하기 위해 배양 조건에 대한 보다 철저한 설명과 정의된 기초 배지로의 전환을 포함하는 Fattahi 프로토콜의 개정된 버전을 발표했습니다¹².

아래에 자세히 설명된 HIO를 신경 분포시키는 방법은 Workman/Mahe 및 Schlieve 프로토콜의 요소를 통합합니다. Schlieve의 ENCC-HIO-TESI의 ENS는 신경 세포 다양성과 신경교세포 통합이 더 크면서 더 성숙한 것처럼 보였지만, 두 방법 모두 위장관 전사 발현의 변화를 입증하면서 기능적 ENS를 HIO에 성공적으로 통합했습니다. Workman과 Mahe의 HIO + ENS는 장 줄기 세포 및 상피 세포 발달과 관련된 여러 유전자의 발현을 증가시켰으며, 이는 ENCC-HIO-TESI에서 변경되지 않았습니다. 이러한 구분에 대한 한 가지 가능한 설명은 ENCC와 HIO가 프로토콜 간에 결합된 시점이 다르다는 것입니다. 우리 연구실은 초기 공동 배양이 상피 및 중간엽 분화에 관여하는 여러 유전자의 발현을 증가시키고 공동 배양의 타이밍이 상피 세포 다양성에 영향을 미친다는 것을 관찰했습니다(미발표 데이터). ENS 전구체가 HIO 발병에 더 일찍 노출되거나 그 반대의 경우도 마찬 가지일 수 있으며, 이는 상피 다양성 및 기타 초기 발달 과정을 촉진하는 아직 정의되지 않은 신호 전달에 시간을 할애할 수 있습니다.

프로토콜

인간 배아 줄기 세포(hESC) 라인 H9는 WiCell(위스콘신주 매디슨)에서 공급되었으며 hESC와 관련된 모든 실험은 UTHealth Houston Stem Cell Research Oversight(SCRO) 위원회(프로토콜 #SCRO-23-01)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜의 경우, 코팅된 플레이트 또는 웰에 대한 모든 참조는 hESC 인증 3D 기저 멤브레인 매트릭스로 준비된 것을 나타냅니다.

1. 세포 배양 준비

참고: 본 연구실에서는 H9 hESC를 사용하지만, H9 hESC ^9,10,12, H1 hESC⁹, hESC 라인 UCSF4¹² 및 WTC11 12, WTC11^{AAVS1-CAG-GCaMP6f 9}, WTC10 ^9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)9 및 WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)⁹ 및 WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)⁹와 같은 여러 hPSC 라인을 사용하여 HIO 및 ENCC를 생성했습니다.

1. 적절한 세포 배양 배지에 희석된 3D 기저 멤브레인 매트릭스로 원하는 각 웰을 코팅하여 6웰 플레이트를 준비합니다(희석 계수 및 준비 지침은 재료 데이터 시트에 나와 있음). 웰당 1mL로 원하는 각 웰을 코팅하고 37°C에서 최소 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 배양하여 세포를 도금하기 전에 굳힙니다.
   참고: 이 프로토콜은 하나의 웰에서 추출한 세포로 완료하거나 필요에 따라 확장할 수 있습니다. 미분화 hPSC의 추가 통과 및 유지 관리를 용이하게 하기 위해 최소 3개의 웰을 코팅하는 것이 좋습니다.
   대부분의 매트릭스가 실온에서 중합을 시작하므로 작업하는 동안 기저막 매트릭스를 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 코팅된 웰은 37°C에서 보관할 경우 최대 2-3주 동안 사용할 수 있습니다. 코팅이 마르는 것을 방지하기 위해 우물 전체를 덮을 수 있도록 적절한 희석제와 함께 보관하십시오.
2. 따뜻한 수조에서 잠시 소용돌이쳐 hPSC(이상적으로는 통과 수가 낮은 것)를 해동합니다. 층류 후드 아래에서 2mL의 줄기 세포 배지에 세포 1바이알을 재현탁합니다(표 1). 세포를 도금하기 직전에 6-well 접시에 미리 코팅된 well의 희석액을 흡입한 다음 2mL의 재현탁 세포 전체를 코팅된 well로 옮깁니다. 미분화 hPSC(유지보수 플레이트라고 함)의 유지보수를 위해 37°C, 5% CO₂에서 배양하고 웰당 2mL의 줄기 세포 배지로 격일로 배지를 교체합니다.
3. 세포가 70-80% 포화도에 도달할 때 세포를 통과시킵니다. 세포를 방해하지 않고 웰 측면에서 배지를 흡인합니다. 실온 줄기세포 해리 시약 1mL를 웰에 추가하고 1분 이내에 흡인하여 세포 위에 얇은 액체 필름을 남깁니다. 플레이트를 37 ° C에서 5 분 동안 배양합니다.
   참고: 세포가 80% confluency를 넘을 때까지 기다리면 조기 분화 문제가 발생할 수 있으며, 이로 인해 후속 단계에서 수율이 감소할 수 있습니다.
4. 따뜻한 줄기 세포 배지 웰당 1mL를 추가하고 플레이트 측면을 두드려 집락을 제거합니다. 입이 넓은 피펫 팁이 있는 P1000 마이크로피펫을 사용하여 배지를 부드럽게 피펫팅하여 세포 손상을 최소화하면서 콜로니를 분리합니다.
   참고: 세포 현탁액을 분쇄할 때 큰 세포 덩어리를 분해하되 더 작은 클러스터는 그대로 유지하는 것이 좋습니다. 단일 세포 현탁액에 도달하는 것이 아니라 우물 전체에 고르게 퍼져 있는 더 적고 작은 군체를 목표로 하는 것이 좋습니다.
5. 6웰 접시에 미리 코팅된 웰의 희석액을 흡입하고 따뜻한 줄기 세포 배지 2mL를 추가합니다. hPSC 콜로니를 유지하기 위해 원하는 부피의 세포 현탁액을 이 웰로 옮기고, 웰당 2mL의 줄기세포 배지로 격일로 배지를 교체합니다.
   참고: 저희 실험실은 일반적으로 50-150 μL 사이의 부피를 전달하여 일주일에 한 번 hPSC 유지보수 플레이트를 계대항하할 수 있습니다. 이 부피는 특정 hPSC 라인 및 통과 수에 따라 달라질 수 있으므로 조정이 필요할 수 있습니다. 나머지 셀을 사용하여 ENCC 생성(섹션 2) 또는 HIO 생성(섹션 3)을 시작합니다. 새로 해동된 hPSC는 ENCC 세대 또는 HIO 세대로 진행하기 전에 최소 두 번 통과해야 합니다.

2. ENCC 생성

참고: ENCC 생성 방법은 Fattahi 실험실에서 설명하고 Schlieve et ^al.10에서 사용한 방법을 밀접하게 따릅니다. Barber et ^al.10,12의 "Enteric Neural Crest (ENC) Induction (Days 0-12)" 및 "ENCC Spheroid Formation (Day 12-15)" 섹션을 통해 프로토콜 옵션 B의 약간 수정된 버전을 사용합니다.

1. 이전에 코팅된 웰의 희석액을 새로운 6웰 접시에 넣고 2mL의 따뜻한 줄기 세포 배지를 추가합니다. 1.5단계에서 850μL의 hPSC 세포 현탁액을 동일한 웰로 전달합니다(일반적으로 5:6 계대형성 비율).
2. 셀을 37 ° C, 5 % CO₂로 유지하십시오. 포화도가 60-80%에 도달할 때까지 웰당 2mL의 줄기 세포 배지로 격일로 배지를 교체합니다. 그런 다음 플레이트는 ENC 유도를 시작할 준비가 된 것입니다.
3. ENC 인덕션
   1. 일 0. 웰 측면에서 배지를 흡입하고 따뜻한 칵테일 A 배지 2mL를 추가합니다(표 1). 인큐베이터로 돌아가 48시간 동안 기다립니다.
   2. 2일차. 웰 측면에서 Cocktail A 미디어를 흡입하고 따뜻한 Cocktail B 미디어 2mL로 교체합니다(표 1). 인큐베이터로 돌아가 48시간 동안 기다립니다.
   3. 4일차. 웰 측면에서 칵테일 B 배지를 흡입하고 신선하고 따뜻한 칵테일 B 배지 2mL로 교체합니다. 인큐베이터로 돌아가 48시간 동안 기다립니다.
   4. 6-12일차. 웰 측면에서 Cocktail B media를 흡입하고 2mL의 따뜻한 Cocktail C media로 교체합니다(표 1). 인큐베이터로 돌아가 12일차에 ENC 유도가 완료될 때까지 48시간마다 배지를 2mL의 신선하고 따뜻한 칵테일 C로 교체합니다.
      참고: 이 단계에서 ENC 계통은 Barber et ^al.12에 설명된 대로 유전자 발현 분석을 통해 확인할 수 있습니다.
4. ENCC 스페로이드 형성
   1. 13일차. 우물 측면에서 칵테일 C 매체를 흡입합니다. 따뜻한 효소 세포 박리 시약 1mL를 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 플레이트의 측면을 두드려 세포를 제거하고 입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 1mL의 신경능선세포(NCC) 배지(표 1)로 웰을 세척하고 15mL 원뿔형 튜브에 세척액을 추가합니다.
   2. 15mL 코니컬 튜브의 세포 현탁액을 300 × g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인합니다. 펠릿을 따뜻한 NCC 배지 2mL에 부드럽게 재현탁합니다.
   3. 재현탁된 세포를 코팅되지 않은 ultra-low-binding 플레이트의 새로운 웰에 추가하고 37°C, 5% CO₂ 에서 48시간 동안 배양합니다.
   4. 15-21일. ENCC 스페로이드 성장을 모니터링하고 48시간마다 배지를 2mL의 신선하고 따뜻한 NCC 배지로 교체합니다.
      알림: 매체 교체는 ENCC 스페로이드가 손상되거나 흡인되지 않도록 주의해서 수행해야 합니다. 이것은 플레이트를 원을 그리며 소용돌이치며 우물 중앙의 스페로이드에 초점을 맞춘 다음 우물 가장자리에서 매체를 흡인하는 것이 가장 좋습니다.
      ENCC 스페로이드 형성은 일반적으로 15일째까지 완료되지만, 중부 뒷장 스페로이드와의 이상적인 공동 배양 타이밍을 수용하기 위해 21일까지 배양하는 것이 허용됩니다.

3. HIO 발생(중부 뒷장 스페로이드상)

참고: HIO 생성 방법은 McCracken et al. 및 Spence and Wells 연구소 ^6,7의 다른 사람들이 자세히 설명한 원래 프로토콜과 근본적으로 동일합니다. 이 과정은 최종 내배엽(DE) 유도와 중부 뒷장 스페로이드 형성의 두 단계로 발생합니다.

1. HIO 생성 준비
   1. 적절한 세포 배양 배지에 희석된 3D 기저 멤브레인 매트릭스로 원하는 각 웰을 코팅하여 24웰 플레이트를 준비합니다(희석 계수 및 준비 지침은 재료 데이터 시트에 나와 있음). 웰당 500μL로 원하는 각 웰을 코팅하고 37°C에서 최소 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 배양하여 세포를 도금하기 전에 설정합니다.
      알림: 대부분의 매트릭스가 실온에서 중합을 시작하므로 작업하는 동안 기저막 매트릭스를 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 코팅된 웰은 37°C에서 보관할 경우 최대 2-3주 동안 사용할 수 있습니다. 코팅이 마르는 것을 방지하기 위해 우물 전체를 덮을 만큼 충분한 희석제와 함께 보관하십시오.
      위에서 설명한 6웰 hPSC 유지보수 플레이트에서 각 1웰에 대해 24웰 플레이트의 6웰을 코팅할 계획을 세웁니다. 이 비율은 원하는 대로 확장할 수 있습니다.
   2. 24웰 접시에 이전에 코팅된 모든 웰에서 희석액을 흡입합니다. 1.5단계에서 hPSC 세포 현탁액에 충분한 온난 줄기 세포 배지를 추가하고 각 웰에 500μL를 분배합니다(예: hPSC 유지 플레이트를 계대 배양한 후 850μL의 hPSC 세포 현탁액이 남아 있는 경우, 24웰 플레이트의 6웰에 대해 2,150μL의 따뜻한 줄기 세포 배지를 1.5단계의 hPSC 세포 현탁액 850μL와 혼합합니다. 및 500 μL는 6 개의 웰 각각에 분포되어 있음).
      참고: 일반적으로 50-150 μL 부피의 hPSC 유지보수 플레이트를 통과시키기 때문에 일반적으로 이 단계에 850-950 μL의 부피를 사용할 수 있습니다. 따라서 24웰 플레이트의 웰당 hPSC의 부피는 약 150μL/웰입니다.
      새로 준비된 24웰 플레이트를 인큐베이터에 넣으면 플레이트를 앞뒤로(북쪽에서 남쪽으로, 동쪽에서 서쪽으로) 부드럽게 교반하여 웰 바닥에 세포를 최대한 고르게 분포시킵니다.
   3. 셀을 37 ° C, 5 % CO₂로 유지하십시오. 포화도가 50-70%에 도달할 때까지 웰당 500μL의 줄기 세포 배지로 격일로 배지를 교체합니다. 그런 다음 플레이트는 DE 유도를 시작할 준비가 됩니다.
      참고: 더 높은 포화도는 후속 단계에서 내배엽 밀도와 뒷장 형태 형성에 부정적인 영향을 미치기 때문에 세포가 DE 유도 전에 >70% 포화도에 도달하지 않는 것이 중요합니다. 이상적으로, 세포는 지정된 계대 비율에서 24-48시간 후에 약 50-70%의 포화도에 도달합니다.
2. DE 인덕션
   1. 1일차. hPSC가 50-70% 포화도에 도달하면 각 웰에서 줄기세포 배지를 완전히 흡인하고 웰당 500μL의 따뜻한 Day 1 DE 배지(표 1)로 교체합니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 24 시간 동안 배양합니다.
   2. 2일차. Day 1 DE를 흡입하고 웰당 500μL의 따뜻한 Day 2 DE(표 1) 배지로 교체합니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 24 시간 동안 배양합니다.
   3. 3일차. Day 2 DE를 흡입하고 웰당 500μL의 따뜻한 Day 3 DE(표 1) 배지로 교체합니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 24 시간 동안 배양합니다.
3. Mid-hindgut 스페로이드 형성
   1. 4-8일차. 각 웰의 배지를 완전히 흡입하고 웰당 500μL의 따뜻한 Mid-hindgut 배지(MHGM, 표 1)로 교체합니다. 37 °C, 5 % CO₂ 에서 배양하십시오. 8일차까지 이 단계를 매일 반복하며, 이때 중간 뒷장 스페로이드는 수집 및 공동 배양할 준비가 됩니다(섹션 4).

4. ENCC와 mid-hindgut spheroids의 공동 배양

참고: 이 섹션의 그래픽 요약은 그림 1에 나와 있습니다.

1. ENCC 현탁액의 준비
   1. 15-21일차 ENCC 스페로이드를 2.4.4단계에서 수집합니다. 웰에서 매체를 조심스럽게 제거함으로써 해당 단계에 대한 노트에 설명된 소용돌이 방법을 사용하여 스페로이드를 흡인하지 않도록 합니다.
   2. 따뜻한 효소 세포 분리 시약 1mL를 웰에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   3. 플레이트의 측면을 두드려 스페로이드를 계속 해리하고 입 끝이 넓은 P1000 마이크로피펫으로 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 혼합물이 균질해질 때까지 세포 덩어리를 분해합니다.
   4. ENCC 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 1mL의 따뜻한 NCC 매체( 표 1 참조)로 웰을 세척하여 남아 있는 세포를 수집하고 이를 15mL 원추형 튜브에 추가합니다.
   5. 300 × g 에서 1분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 멸균 피펫 팁으로 상층액을 흡입합니다.
   6. 입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 1mL의 따뜻한 NCC 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 혈구계 또는 세포 계수기를 사용하여 ENCC 현탁액의 농도를 계산합니다.
2. ENCC 현탁액과 중부 뒷장 스페로이드 결합
   1. 입이 넓은 피펫 팁을 사용하여 HIO 플레이트의 모든 웰에서 mid-hindgut 스페로이드를 수집하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   2. 24웰 플레이트 내에서 사용할 공동 배양 웰의 수를 결정합니다. 공동 배양을 위해 웰당 10-30개의 중간 뒷장 스페로이드와 50,000-100,000개의 ENCC를 플레이트하는 것을 목표로 합니다.
      참고: 실제로, 건강한 스페로이드가 있는 웰의 수와 공동 배양에 필요한 최종 웰 수 사이에는 종종 일대일 관계가 있습니다. 혈구계를 사용하여 수집된 중간 뒷장 스페로이드의 농도를 계산할 수도 있습니다.
   3. 계획된 공동 배양 웰당 50,000-100,000 ENCC를 중간 뒷장 스페로이드가 있는 원뿔형 튜브에 전달하기 위해 계산된 ENCC 현탁액의 부피를 추가합니다. 입이 넓은 피펫 팁으로 부드럽게 분쇄하여 뒷장 중간 스페로이드와 ENCC를 균일하게 혼합합니다.
   4. 300 × g 에서 1분 동안 원심분리기를 하고 멸균 피펫 팁으로 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 세포 펠릿을 최종 공동 배양 웰당 30μL와 동일한 차갑고 페놀이 없는(투명) 성장 인자 감소 기저막 매트릭스 부피에 재현탁합니다.
      참고: 재부유 중 투명한 기저막 매트릭스에 기포를 형성하지 마십시오., 이는 제거가 어렵고, HIO+ENCC 배양에 의한 배지의 적절한 흡수를 방해하며, HIO+ENCC 배양이 성장함에 따라 시각화를 감소시킬 수 있습니다.
   5. 각 건조 웰의 중앙으로 주변 매체가 없는 투명한 기저막 매트릭스에 재현탁된 mid-hindgut 스페로이드 + ENCC의 30μL 방울을 피펫으로 주입합니다. 모든 물방울이 웰에 도금되면 플레이트를 덮고 뒤집습니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 30 분 동안 뒤집어 배양합니다.
      참고: 이 단계를 통해 중간 뒷장 스페로이드와 ENCC가 플레이트 바닥에서 떨어져 나와 투명 3D 기저막 매트릭스의 중합 중에 부유하게 될 시간을 허용합니다.
3. 체외(In Vitro )HIO+ENS 공동 문화
   1. Day 0: 투명한 기저막 매트릭스가 중합되면 500μL의 따뜻한 Day 0-3 HIO 매체에 각 액적을 덮습니다( 표 1 참조).
   2. 3일차: 투명한 기저막 매트릭스 방울을 방해하지 않고 우물 측면에서 Day 0-3 HIO 매체를 조심스럽게 흡인합니다. 매체를 500μL의 따뜻한 Day 3-14 HIO 매체로 교체합니다( 표 1 참조). 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이 단계에서는 3-4일마다 미디어를 교체합니다.
   3. 7-14일: 3-4일마다 필요에 따라 3-14일 HIO 미디어를 계속 교체하고 성장을 모니터링합니다.
4. HIO 분할
   1. 14일차: 현미경으로 각 우물을 주의 깊게 검사하고 각 투명한 3D 기저막 매트릭스 방울에 얼마나 많은 HIO + ENS가 있는지 평가합니다.
   2. 30μL의 투명한 기저 멤브레인 매트릭스가 있는 2mL 마이크로 원심분리 튜브를 준비하고 얼음 위에 보관합니다.
   3. 층류 후드 아래에서 미세한 집게를 사용하여 현탁된 HIO+ENS가 있는 투명한 3D 기저막 매트릭스 방울을 조심스럽게 제거합니다. 개별 HIO+ENS를 부드럽게 떼어냅니다.
      참고: 수술용 확대경이나 해부 현미경은 이 단계에서 매우 도움이 될 수 있지만 HIO는 종종 육안으로 크게 보이기 때문에 반드시 필요한 것은 아닙니다.
   4. 분리된 각 HIO + ENS를 집게 또는 입이 넓은 피펫 팁을 사용하여 30μL의 투명한 기저 멤브레인 매트릭스가 들어 있는 준비된 미세 원심분리 튜브 중 하나에 넣습니다.
      참고: 오래된 투명 3D 기저막 매트릭스는 이 단계에서 액화되거나 용해될 필요가 없습니다. 가능하면 HIO를 중단하지 않지만, 이러한 상황이 발생하면 이후 단계로 계속 증가할 수 있습니다.
   5. 분할 및 재도금된 HIO+ENS에 대해 4.2.5단계를 반복합니다. 투명한 3D 기저막 방울이 중합되면 따뜻하고 신선한 Day 3-14 HIO 배지 500μL를 각 웰에 추가하고 밤새 배양합니다.
5. HIO+ENS 공동 배양 계속
   1. 15일차: 우물 측면에서 3-14일차 HIO 매체를 조심스럽게 흡인합니다. 매체를 500μL 웜 Day 15-28 HIO 매체로 교체합니다( 표 1 참조).
   2. 15-40일차: 3-4일마다 필요에 따라 15-28일차 HIO 미디어를 계속 교체하고 HIO + ENCC 성장을 모니터링합니다.

결과

ENS는 연동 운동, 영양소 흡수, 체액 수송 및 상피 장벽 유지를 포함한 성숙한 소장의 필수 기능을 조절합니다. 따라서 HIO를 신경 분포시키는 목표는 이러한 구문에 보다 성숙하고 높은 수준의 기능을 개발하는 데 필요한 요소를 제공하는 것입니다. 이를 위해 우리 연구실은 HIO 내 ENS의 발달과 여러 단계에서의 기능적 결과를 구체적으로 연구합니다.

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토론

HIO는 2010년대 초반부터 인간의 장 발달을 위한 모델 시스템으로 사용되어 왔으며 그 이후로 점점 더 복잡해졌습니다. 이제 이러한 구조에 ENS를 제공할 수 있게 되어 여러 임상 위장 개체를 이해하고 더 잘 치료하는 데 적용할 수 있는 정상 발달 연구에서 새로운 기회를 얻을 수 있습니다.

생체 내 이식
ENCC는 중간 뒷?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)	ThermoFischer Scientific	11140050
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	12565269
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	ThermoFischer Scientific	12587010	For ENCC
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	17504044	For HIO
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific	3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated	VWR	29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well	VWR	29442-042
Essential 6 Media	Thermo Fischer	A1516401
Essential 8 Media	Thermo Fischer	A2858501	Alternative stem cell media, used for ENCC plates.
Fine-tip forceps	Dumont	11223-20
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific	50145522
Gibco Advanced DMEM/F12	ThermoFischer Scientific	12634-010
Gibco HEPES 1 M	ThermoFischer Scientific	15630-080
Gibco Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103-049
Glutagro, 200 mM, 100x	Corning	25-015-CI
Glutamax	ThermoFischer Scientific	35050061
H9 human ESC	Wicell International Stem Cell Bank	N/A
HyCloneTM FBS Defined	VWR	16777-002
LabGard Biological Safety Cabinet	Nuaire	Nu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356231	"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	"3D basement membrane matrix"
Micropipettes	Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)	2231300008
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	"stem cell media" Catalog number includes the 5x supplement, to be added in bulk in advance.
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048	For HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)	Thermo Fisher	A1370701	For ENCC. Slightly different formulation.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscope	Nikon	TS100
Noggin-conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFischer Scientific	15140-122
Recombinant Human Activin A	Cell Guidance Systems	GFH6-100
Recombinant Human BMP-4	Fisher Scientific	314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CF	ThermoFisher Scientific	236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein	ThermoFischer Scientific	233-FB-010
Recombinant Human FGF-4	Peprotech	100-31
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872	"Stem cell dissociation reagent"
Retinoic acid	SIGMA	R2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL	Thermo Scientific	AM12425
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer Scientific	11875093
R-Spondin conditioned media	Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core	N/A
SB 431542, Tocris Bioscience	Fisher Scientific	16-141-0
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor Tips	VWR	89049-166
Stemolecule Chir99021 in Solution	Stemgent	04-0004-02
Sterile filter pipette tips	VWR (1000uL, 200uL, 10uL)	76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XF	Stem Cell Technologies	7180	Alternative 3D basement membrane matrix, used for ENCC plates.