A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
نقدم بروتوكولا على الطاولة للحث على تجلط الدم في أجهزة المساعدة البطينية (VAD) داخل منصة اختبار معاد تدويرها. تعمل هذه الطريقة على تحديد النقاط الساخنة للتخثر في مسار تدفق الدم ويمكن أن تساعد في تحسين مقاومة التخثر قبل الاختبارات قبل السريرية في النماذج الحيوانية.
لا يزال خطر تجلط الدم مصدر قلق كبير في تطوير أجهزة المساعدة البطينية (VADs) والاستخدام السريري لها. التقييمات التقليدية لتخثر مرض البطن ، من خلال الدراسات التي أجريت على في المقام الأول ، مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وتثير مخاوف أخلاقية ، وقد لا تعكس في النهاية النتائج البشرية بدقة. لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير بروتوكول اختبار قوي في المختبر مصمم لإثارة تجلط الدم وتحديد المناطق المحتملة عالية الخطورة داخل مسار تدفق الدم. يستخدم هذا البروتوكول ، بدافع من عمل Maruyama et al. ، استراتيجية معدلة لمكافحة التخثر ويستخدم المكونات المتاحة بسهولة ، مما يجعله في متناول معظم المختبرات التي تجري اختبارات الدم في المختبر لأجهزة المساعدة البطينية. لقد أظهرنا فائدة هذه الطريقة من خلال الاختبار التكراري وتحسين جهاز المساعدة البطينية للأطفال المصغر المرفوعة مغناطيسيا (PediaFlow PF5). كانت الطريقة فعالة في تحديد النقاط الساخنة للتخثر الناجمة عن عيوب التصميم والتصنيع في النماذج الأولية لجهاز المساعدة البطينية ، مما يتيح التحسينات المستهدفة قبل التقدم إلى الدراسات التي أجريت على. على الرغم من محدوديته ، بما في ذلك عدم وجود تدفق نابض وتأثير خصائص دم المتبرع به ، فإن هذا البروتوكول يعمل كأداة عملية لتطوير VAD في المراحل المبكرة والتخفيف من المخاطر.
أصبحت أجهزة المساعدة البطينية (VADs) معيارا للرعاية في إدارة المرضى الذين يعانون من قصور القلب المتقدم ، ومع ذلك لا يزال خطر الإصابة بالجلطة والسكتة الدماغية يمثل تحديا كبيرا1،2. عادة ما يتم تقييم تجلط الدم داخل أجهزة المساعدة البطينية أثناء الدراسات قبل السريرية التي أجريت على ، والتي ، على الرغم من قيمتها ، إلا أنها تمثل تكاليف كبيرة وتحديات لوجستية. هذه الدراسات كثيفة الاستخدام للموارد وتستغرق وقتا طويلا وعرضة لعيب واحد يعرض الاختبار بأكمله للخطر ويستلزم تجارب إضافية. هذا لا يزيد من العبء المالي فحسب ، بل يثير أيضا مخاوف أخلاقية بسبب الحاجة إلى تكرار الاختبارات على.
على الرغم من وجود العديد من النماذج العددية للتنبؤ بترسب الصفائح الدموية والتخثر3،4،5،6 ، إلا أن القليل منها فقط مناسب لمحاكاة تكوين الجلطة في الأجهزة ذات الحجم الكلي مثل VADs7،8،9. علاوة على ذلك ، تفترض النماذج الحالية حتما أسطحا مثالية وهندسة مبسطة "مانعة لتسرب الماء" ، والتي لا تعكس بدقة تعقيدات وعيوب تجميعات المضخات في العالم الحقيقي. عند النظر في تفاعلات سطح الصفائح الدموية ، تستخدم هذه النماذج ذات الحجم الكلي عموما خصائص المواد الموصوفة بشكل موحد (عادة ما يتم نمذجتها كمعامل في الظروف الحدودية للتدفق السطحي) 10،11،12. وبالتالي ، لا يمكن للنماذج العددية أن تحل محل الاختبارات التجريبية بالدم.
يلعب كل من اختيار المواد وتشطيب السطح أدوارا حاسمة في التصاق الصفائح الدموية على أسطح VAD13،14،15،16،17. يمكن أن تؤدي العيوب مثل البقع الخشنة أو المخالفات إلى تعزيز التصاق الصفائح الدموية وتكوين الجلطة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون الشقوق بين المكونات في مسار التدفق بمثابة nidus للتخثر ، مما يوفر بيئات محمية حيث يمكن أن تتشكل الجلطات وتنمو18،19. يمكن أن يشكل استخدام الشحوم أو مواد التشحيم أو المواد المانعة للتسرب أثناء التجميع خطرا أيضا ، حيث قد تتسرب هذه المواد إلى مسار التدفق وتتفاعل مع الدم ، مما يزيد من خطر حدوث مضاعفات.
لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول اختبار محدد جيدا في المختبر يمكنه تقييم مقاومة التخثر لأجهزة المساعدة البطينية بشكل موثوق قبل إخضاعها للاختبار على أو الاستخدام السريري. في حين أن هناك معيار ASTM معتمد على نطاق واسع لتقييم انحلال الدم20 ، لا يوجد مثل هذا المعيار لاختبار تجلط الدم لأجهزة المساعدة البطينية في ظل ظروف التشغيل ذات الصلةسريريا 21. على الرغم من الدراسات المنوية التي يعود تاريخها إلى ثلاثة عقود والتي تظهر جدوى اختبار تجلط الدم في المختبر لمضخات الدم22،23،24،25 ، فقد استمرت التجارب على كممارسة فعلية لتقييم تجلط الدم حتى الآن26. من المحتمل أن يكون العائق أمام التبني الأوسع للطرق المختبرية هو الطبيعة المعقدة للتخثر ، مع وجود العديد من العوامل المربكة التي يمكن أن تؤثر على نتائج الاختبار ، مما يجعل من الصعب التمييز بين تجلط المضخة الجوهرية والقطع الأثرية الناشئة بسبب القيود المنهجية والأخطاء الإجرائية.
حفزنا هذا على مشاركة بروتوكول مفصل كدليل للتجريبيين لتجنب المزالق ، وبالتالي تعزيز استخدام الاختبار في المختبر والتخفيف من الاعتماد على الدراسات على. تم تنقيح البروتوكول الموصوف هنا ، المشتق من Maruyama et al.27 ، والتحقق من صحته أثناء تصميم الجيلالخامس PediaFlow (PF5) من VADللأطفال 28،29. أثبتت طريقة الاختبار هذه أنها مفيدة في تحديد ومعالجة مخاطر التخثر المحتملة بشكل منهجي في نماذج VAD الأولية قبل الاختبار على.
تم الحصول على دم الأغنام الكامل المستخدم في هذه الدراسة من بائع تجاري ، وبالتالي ، لم يتطلب مراجعة من قبل لجنة رعاية المؤسسي بجامعة كورنيل.
1. بناء حلقة تدفق الاختبار
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على قائمة مفصلة بمكونات الحلقة وجميع المواد الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول.
2. تحضير محلول كلوريد الكالسيوم (CaCl2)
3. تحضير الدم
ملاحظة: تم الحصول على دم الأغنام المستخدم في هذه الدراسة من بائع تجاري مدرج في جدول المواد. تم جمع الدم باستخدام إبرة 14 جم ، مع تقييد في وضع الوقوف الزراعي القياسي. استغرقت عملية التجميع من 10 إلى 12 دقيقة من إدخال الإبرة إلى الانتهاء. تم مضاد للتخثر في الدم ب 14 جزءا من CPD إلى 86 جزءا من الدم (تركيبة CPD: 26.3 جم / لتر من Na-Citrate ، و 25.2 جم من سكر العنب ، و 3 جم / لتر من حامض الستريك ، و 2.2 جم / لتر من فوسفات الصوديوم في الماء منزوع الأيونات [DI]). تم شحن كيس الدم طوال الليل في حاوية معزولة مع كمادات ثلج وتم استخدامه للتجربة في غضون 24 ساعة من الجمع.
4. إجراءات الاختبار المسبق
ملاحظة: تنطبق جميع الخطوات الموضحة في هذا القسم على القسمين 5 و6. قم بتنفيذ هذه الخطوات قبل تشغيل المضخة باستخدام ألبومين مصل الأبقار (BSA) أو الدم في الحلقة. نقل الدم بين الأوعية باستخدام التغذية بالجاذبية لتقليل الإجهاد الميكانيكي. تجنب استخدام مكبس الحقنة لدفع الدم ، لأن ذلك قد يخلق ضغطا مفرطا. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب اختناق الدم من خلال الفتحات الضيقة لمنع تلف المكونات الخلوية.
5. تخميل الأسطح الملامسة للدم
6. اختبار التخثر
7. إجراء التنظيف
يتيح التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول تحديد المناطق الموضعية لترسب الصفائح الدموية ، مما يكشف عن البقع الإشكالية داخل مسار تدفق المضخة. يسمح التطبيق المتسق لهذا البروتوكول بإجراء تحسينات تدريجية من خلال معالجة هذه "النقاط الساخنة" المحددة.
على سبيل المثال...
دائما ما تكون التجربة الأولى على الإنسان لمضخة جديدة مسعى محفوفا بالمخاطر ، حيث لا يمكن للدراسات قبل السريرية أن تتنبأ بشكل موثوق بتجلط الدم في أجهزة المساعدة البطينية لدىالبشر 26. والجدير بالذكر أن بعض أجهزة المساعدة البطينية التي أظهرت التحرر من تجلط الدم...
تعمل S.E.O. حاليا كمستشارة لشركة Magenta Medical وكانت سابقا مستشارة في Boston Scientific. لا يوجد مؤلفون آخرون لديهم أي إفصاحات مالية ذات صلة أو تضارب في المصالح للإبلاغ عنها.
تم دعم هذا العمل من قبل R01HL089456 منح المعاهد الوطنية للصحة ومشروع اكتساب البحوث الطبية للجيش الأمريكي رقم W81XWH2010387.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
14-mL test tubes | Falcon | 352059 | Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap |
1-way stopcock | Qosina | 99759 | Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock |
3-way stopcock | Qosina | 99771 | 2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock |
ACT+ cuvettes for Hemochron | Werfen | 000JACT+ | 45/Box |
All-purpose cleaner/degreaser | Simple Green | 2710200613005 | Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution. |
Barbed connectors | Qosina | 73311 | Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector |
Barbed connectors w/ luer lock | Qosina | 73316 | Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Scientific Chemicals | AAJ6465522 | Or equivalent |
Calcium chloride, CaCl2 | Thermo Scientific Chemicals | AA89866-30 | Anhydrous, ≥96.0% ACS |
Dissecting scope (recommended) | Olympus | https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/ | Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar |
DPBS (w/o calcium and magnesium) | Gibco | 14200075 | Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use) |
EDTA | Quality Biological | 351-027-721EA | 0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid) |
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional) | Bebird | https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers | 3–4 mm probe diameter |
Enzyme-active powdered detergent | Alconox | 1304-1 | Alconox Tergazyme. Use 1% solution. |
Extension Line, 30" | Qosina | 36218 | 30" length, female luer lock to male luer lock |
Extension Line, 6" | Qosina | 36212 | 6" length, female luer lock to male luer lock |
Female luer lock, barbed | Qosina | 11548 | Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate; |
Flow meter | Transonic | https://www.transonic.com/t402-t403-consoles | Transonic TS410 module |
Hemostat | Fisherbrand | 13-820-004 | Locking hemostat with at least 5 cm tip length |
Heparin Sodium | McKesson Packaging Services | 949513 | 1000 U/mL concentration |
Hoffman clamp | Humboldt | H8720 | Fine-threaded clamp |
IV bag (compliant blood reservoir) | Qosina | 51494 | Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer |
Lint-free wipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimtech Science Wipers |
Magnetic stirrer | INTLLAB | MS-500 | Or similar |
Male luer lock, barbed | Qosina | 11549 | Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate; |
Manometer (digital) | Sper Scientific | 840081 | SPER-840081 or similar |
Nylon filtering mesh | McMaster-Carr | 9318T21 | 100-μm (0.0039") opening size |
Ovine blood | Lampire | 7209004 | Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight |
Plastic bag heat sealer | Uline | H-190 | Uline H-190 or similar (without cutter) |
Silicone rubber adhesive | Smooth-On | B00IRC1YI0 | Sil-Poxy or similar |
Syringe w/ luer lock, 1 mL | Fisher Scientific | 14-955-646 | Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes |
Syringe w/ luer lock, 3 mL | Fisher Scientific | 14-955-457 | Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes |
Syringe w/ luer lock, 60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes |
Transfusion filter | Haemonetics Corporation | SQ40S/SQ40NS | Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter |
TRIS Buffered Saline | Thermo Scientific Chemicals | AAJ62938K2 | TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4 |
Tubing | Tygon | ADF00017 | Tygon ND-100-65 tubing (medical grade) |
Ultrasonic flow sensor | Transonic | https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors | Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at 24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65) |
Ultrasonic sonicator (optional) | Branson Ultrasonics | CPX952238R | Branson CPX2800H or similar |
VAD system | PediaFlow | PF5 | The VAD system to be tested; includes the pump and the controller |
Whole Blood Coagulation System | Werfen | https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite | Hemochron Signature Elite or Signature Jr |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved