في المختبر اختبار تجلط الدم لأجهزة مساعدة البطين

Summary

نقدم بروتوكولا على الطاولة للحث على تجلط الدم في أجهزة المساعدة البطينية (VAD) داخل منصة اختبار معاد تدويرها. تعمل هذه الطريقة على تحديد النقاط الساخنة للتخثر في مسار تدفق الدم ويمكن أن تساعد في تحسين مقاومة التخثر قبل الاختبارات قبل السريرية في النماذج الحيوانية.

Abstract

لا يزال خطر تجلط الدم مصدر قلق كبير في تطوير أجهزة المساعدة البطينية (VADs) والاستخدام السريري لها. التقييمات التقليدية لتخثر مرض البطن ، من خلال الدراسات التي أجريت على في المقام الأول ، مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وتثير مخاوف أخلاقية ، وقد لا تعكس في النهاية النتائج البشرية بدقة. لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير بروتوكول اختبار قوي في المختبر مصمم لإثارة تجلط الدم وتحديد المناطق المحتملة عالية الخطورة داخل مسار تدفق الدم. يستخدم هذا البروتوكول ، بدافع من عمل Maruyama et al. ، استراتيجية معدلة لمكافحة التخثر ويستخدم المكونات المتاحة بسهولة ، مما يجعله في متناول معظم المختبرات التي تجري اختبارات الدم في المختبر لأجهزة المساعدة البطينية. لقد أظهرنا فائدة هذه الطريقة من خلال الاختبار التكراري وتحسين جهاز المساعدة البطينية للأطفال المصغر المرفوعة مغناطيسيا (PediaFlow PF5). كانت الطريقة فعالة في تحديد النقاط الساخنة للتخثر الناجمة عن عيوب التصميم والتصنيع في النماذج الأولية لجهاز المساعدة البطينية ، مما يتيح التحسينات المستهدفة قبل التقدم إلى الدراسات التي أجريت على. على الرغم من محدوديته ، بما في ذلك عدم وجود تدفق نابض وتأثير خصائص دم المتبرع به ، فإن هذا البروتوكول يعمل كأداة عملية لتطوير VAD في المراحل المبكرة والتخفيف من المخاطر.

Introduction

أصبحت أجهزة المساعدة البطينية (VADs) معيارا للرعاية في إدارة المرضى الذين يعانون من قصور القلب المتقدم ، ومع ذلك لا يزال خطر الإصابة بالجلطة والسكتة الدماغية يمثل تحديا كبيرا^1،2. عادة ما يتم تقييم تجلط الدم داخل أجهزة المساعدة البطينية أثناء الدراسات قبل السريرية التي أجريت على ، والتي ، على الرغم من قيمتها ، إلا أنها تمثل تكاليف كبيرة وتحديات لوجستية. هذه الدراسات كثيفة الاستخدام للموارد وتستغرق وقتا طويلا وعرضة لعيب واحد يعرض الاختبار بأكمله للخطر ويستلزم تجارب إضافية. هذا لا يزيد من العبء المالي فحسب ، بل يثير أيضا مخاوف أخلاقية بسبب الحاجة إلى تكرار الاختبارات على.

على الرغم من وجود العديد من النماذج العددية للتنبؤ بترسب الصفائح الدموية والتخثر^3،4،5،6 ، إلا أن القليل منها فقط مناسب لمحاكاة تكوين الجلطة في الأجهزة ذات الحجم الكلي مثل VADs^7،8،9. علاوة على ذلك ، تفترض النماذج الحالية حتما أسطحا مثالية وهندسة مبسطة "مانعة لتسرب الماء" ، والتي لا تعكس بدقة تعقيدات وعيوب تجميعات المضخات في العالم الحقيقي. عند النظر في تفاعلات سطح الصفائح الدموية ، تستخدم هذه النماذج ذات الحجم الكلي عموما خصائص المواد الموصوفة بشكل موحد (عادة ما يتم نمذجتها كمعامل في الظروف الحدودية للتدفق السطحي) ^10،11،12. وبالتالي ، لا يمكن للنماذج العددية أن تحل محل الاختبارات التجريبية بالدم.

يلعب كل من اختيار المواد وتشطيب السطح أدوارا حاسمة في التصاق الصفائح الدموية على أسطح VAD^{13،14،15،16،17}. يمكن أن تؤدي العيوب مثل البقع الخشنة أو المخالفات إلى تعزيز التصاق الصفائح الدموية وتكوين الجلطة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون الشقوق بين المكونات في مسار التدفق بمثابة nidus للتخثر ، مما يوفر بيئات محمية حيث يمكن أن تتشكل الجلطات وتنمو^18،19. يمكن أن يشكل استخدام الشحوم أو مواد التشحيم أو المواد المانعة للتسرب أثناء التجميع خطرا أيضا ، حيث قد تتسرب هذه المواد إلى مسار التدفق وتتفاعل مع الدم ، مما يزيد من خطر حدوث مضاعفات.

لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول اختبار محدد جيدا في المختبر يمكنه تقييم مقاومة التخثر لأجهزة المساعدة البطينية بشكل موثوق قبل إخضاعها للاختبار على أو الاستخدام السريري. في حين أن هناك معيار ASTM معتمد على نطاق واسع لتقييم انحلال الدم²⁰ ، لا يوجد مثل هذا المعيار لاختبار تجلط الدم لأجهزة المساعدة البطينية في ظل ظروف التشغيل ذات الصلة^{سريريا 21}. على الرغم من الدراسات المنوية التي يعود تاريخها إلى ثلاثة عقود والتي تظهر جدوى اختبار تجلط الدم في المختبر لمضخات الدم^{22،23،24،25} ، فقد استمرت التجارب على كممارسة فعلية لتقييم تجلط الدم حتى الآن²⁶. من المحتمل أن يكون العائق أمام التبني الأوسع للطرق المختبرية هو الطبيعة المعقدة للتخثر ، مع وجود العديد من العوامل المربكة التي يمكن أن تؤثر على نتائج الاختبار ، مما يجعل من الصعب التمييز بين تجلط المضخة الجوهرية والقطع الأثرية الناشئة بسبب القيود المنهجية والأخطاء الإجرائية.

حفزنا هذا على مشاركة بروتوكول مفصل كدليل للتجريبيين لتجنب المزالق ، وبالتالي تعزيز استخدام الاختبار في المختبر والتخفيف من الاعتماد على الدراسات على. تم تنقيح البروتوكول الموصوف هنا ، المشتق من Maruyama et ^al.27 ، والتحقق من صحته أثناء تصميم الجيل^الخامس PediaFlow (PF5) من VAD^{للأطفال 28،29}. أثبتت طريقة الاختبار هذه أنها مفيدة في تحديد ومعالجة مخاطر التخثر المحتملة بشكل منهجي في نماذج VAD الأولية قبل الاختبار على.

Protocol

تم الحصول على دم الأغنام الكامل المستخدم في هذه الدراسة من بائع تجاري ، وبالتالي ، لم يتطلب مراجعة من قبل لجنة رعاية المؤسسي بجامعة كورنيل.

1. بناء حلقة تدفق الاختبار

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على قائمة مفصلة بمكونات الحلقة وجميع المواد الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تعديل الكيس الوريدي (IV).
   1. استخدم مادة مانعة للتسرب حراري بلاستيكية لتعديل كيس وريدي لضبط حجمه وشكله ، كما هو موضح في الشكل 1.
      ملاحظة: يسهل شكل الكيس إزالة التهوية ويسمح بتثبيت الكيس باستخدام hemostat عبر خط السائل^30,31. يتم اختيار موقع خط الختم بناء على حجم فتيلة VAD والأنبوب لتحقيق حجم فتيلة إجمالي يبلغ 150 مل.
   2. أدخل فتحة تهوية عن طريق عمل شق 4 مم في الجزء العلوي من الكيس. أدخل قفل لور أنثوي شائك في الشق وأغلق الموقع بمادة لاصقة مطاطية من السيليكون RTV. قم بتوصيل محبس أحادي الاتجاه بقفل luer.
2. قم بتجميع حلقة الاختبار باستخدام الكيس الوريدي المعدل ، وأنابيب البولي فينيل كلوريد (PVC) ، والموصلات الشائكة المصنوعة من البولي كربونات ، ومحبس 3 اتجاهات و 1 ، كما هو موضح في الشكل 1.
3. قم بتوصيل مقياس ضغط الضغط.
   1. قم بتوصيل خطوط التمديد مقاس 6 بوصات بمنافذ الضغط من جانب المدخل والمخرج. قم بتوصيل محبس أحادي الاتجاه بالطرف الآخر من خط التمديد.
      ملاحظة: يسمح محبس المحطة بفصل أنبوب مقياس الضغط لتجهيز خط التمديد بالسائل قبل بدء تشغيل المضخة ، كما هو موضح في الخطوة 4.3.
   2. قم بتوصيل أحد طرفي كل أنبوب بقطر داخلي 1/8 بوصة (ID) بشريط مقياس الضغط وأدخل تركيبة لورد ذكر في الطرف الآخر.
   3. قم بتوصيل تركيبات اللور الذكور بمحبس أحادي الاتجاه. افتح محبس التثبيت لتمكين قراءات الضغط.
4. قم بتطبيق مسبار التدفق بالموجات فوق الصوتية لقياس معدل التدفق.
5. ضع مشبك هوفمان بعيدا عن منفذ ضغط المخرج لتنظيم مقاومة التدفق.

2. تحضير محلول كلوريد الكالسيوم (CaCl₂)

1. قم بإذابة مسحوق كلوريد الكالسيوم₂ في 1 × محلول ملحي مخزن ب TRIS (درجة الحموضة 7.4) لتحضير محلول 1 متر. تجنب المخازن المؤقتة المحتوية على الفوسفات (على سبيل المثال ، PBS أو DPBS) لأن الكالسيوم والفوسفات يتفاعلان لتشكيل راسب غير قابل للذوبان.
2. في حالة تحضير CaCl₂ بكميات كبيرة ، أضف مسحوق CaCl₂ بشكل تدريجي على عدة خطوات ، حيث أن إذابته عملية طاردة للحرارة.
3. قم بمعايرة درجة الحموضة في المحلول إلى 6-8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك (HCl) أو هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) إذا لزم الأمر.

3. تحضير الدم

ملاحظة: تم الحصول على دم الأغنام المستخدم في هذه الدراسة من بائع تجاري مدرج في جدول المواد. تم جمع الدم باستخدام إبرة 14 جم ، مع تقييد في وضع الوقوف الزراعي القياسي. استغرقت عملية التجميع من 10 إلى 12 دقيقة من إدخال الإبرة إلى الانتهاء. تم مضاد للتخثر في الدم ب 14 جزءا من CPD إلى 86 جزءا من الدم (تركيبة CPD: 26.3 جم / لتر من Na-Citrate ، و 25.2 جم من سكر العنب ، و 3 جم / لتر من حامض الستريك ، و 2.2 جم / لتر من فوسفات الصوديوم في الماء منزوع الأيونات [DI]). تم شحن كيس الدم طوال الليل في حاوية معزولة مع كمادات ثلج وتم استخدامه للتجربة في غضون 24 ساعة من الجمع.

1. تحضير دم المتبرع به للاستخدام.
   1. ضع كيس الدم على منصة مائلة لمدة 15-30 دقيقة لخلط الدم برفق والسماح له بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
   2. ضع قضيب التحريك المغناطيسي في دورق أو حاوية من البولي كربونات مخصصة لنقل الدم.
   3. انقل الدم إلى الدورق من خلال مرشح نقل الدم لإزالة المجاميع الكبيرة. تعامل مع الدم برفق لمنع تلف المكونات الخلوية. صب الدم على طول جدران الحاوية لتجنب السقوط الحر وتقليل الصدمات الخلوية.
      ملاحظة: تخلص من الدم في حالة وجود جلطة كبيرة أو في حالة انسداد المرشح.
   4. ضع الدورق أو الحاوية على محرك مغناطيسي واضبط السرعة حتى يبدأ سطح الدم في الدوران برفق دون تكوين دوامة كبيرة. يقلب باستمرار لمدة 5 دقائق على الأقل.
   5. قم بقياس عدد الهيماتوكريت والصفائح الدموية للتأكد من أن القيم ضمن النطاق الطبيعي للأنواع.
2. قم بإجراء المعايرة لتحديد تركيز CaCl₂ المستهدف.
   ملاحظة: يتم تكلس الدم الكتري لتمكين اختبار التخثر والتخثر ، مع إضافة الهيبارين لمنع التخثر الجامح. وقت التخثر المنشط المستهدف (ACT) لبدء الاختبار هو 300 ثانية. يرجى ملاحظة أن قيم ACT المرجعية الواردة في هذا القسم تم الحصول عليها باستخدام دم الأغنام المتبرع بها وقد تختلف اعتمادا على الأنواع ومستوى مضادات التخثر المستخدمة أثناء الجمع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تختلف قياسات ACT بين الأدوات^32،33،34. قد تكون هناك حاجة إلى بعض التجربة والخطأ لتحديد نطاق ACT الأمثل لإعداد مختبر معين.
   1. نقل 2 مل من محلول 1 M CaCl₂ المحضر و 0.5 مل من الهيبارين الصوديوم (1000 وحدة / مل) من عبوة الشركة المصنعة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة لتجنب تلوث محاليل المخزون.
   2. نقل 10 مل من الدم إلى أنابيب اختبار 14 مل من مادة البولي بروبلين. قم بإعداد أربعة من هذه الأنابيب.
   3. لتحقيق تركيز الهيبارين 0.5 وحدة / مل في الدم ، أضف 5 ميكرولتر من الهيبارين الصوديوم إلى عينة الدم 10 مل.
   4. لتحقيق تركيز كالسيوم يبلغ 5 ملي مولار في الدم ، أضف 50 ميكرولتر من محلول 1 M CaCl₂ إلى عينة الدم 10 مل. أثناء الاستغناء ، قم بتدوير طرف الماصة لتوزيع CaCl₂ على مساحة أوسع.
   5. على الفور ، اقلب الأنبوب 10 مرات ، ولفه أفقيا (على سطح مستو أو بين راحة اليد) ، ثم اقلب 10 مرات أخرى لضمان الخلط الشامل.
   6. قم بقياس ACT باستخدام نظام تخثر الدم الكامل في نقطة الرعاية باتباع تعليمات الشركة المصنعة. يتراوح ACT الأولي عادة بين 400-500 ثانية.
   7. مع الحفاظ على تركيز الهيبارين ثابتا ، قم بزيادة تركيز CaCl₂ (إلى حوالي 7-8 ملي مولار) لتحقيق ACT يبلغ 300 ثانية.
   8. تحقق من التركيز النهائي وACT الناتج في أنبوب منفصل من الدم.

4. إجراءات الاختبار المسبق

ملاحظة: تنطبق جميع الخطوات الموضحة في هذا القسم على القسمين 5 و6. قم بتنفيذ هذه الخطوات قبل تشغيل المضخة باستخدام ألبومين مصل الأبقار (BSA) أو الدم في الحلقة. نقل الدم بين الأوعية باستخدام التغذية بالجاذبية لتقليل الإجهاد الميكانيكي. تجنب استخدام مكبس الحقنة لدفع الدم ، لأن ذلك قد يخلق ضغطا مفرطا. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب اختناق الدم من خلال الفتحات الضيقة لمنع تلف المكونات الخلوية.

1. ملء وتصريف حلقة الاختبار
   1. قم بتوصيل خط تمديد 30 بوصة بمنفذ الحقن وقم بتوصيل برميل حقنة سعة 60 مل كقمع. افتح محبس الخزان ليكون بمثابة فتحة تهوية.
   2. صب السائل في القمع ، ورفعه حسب الحاجة لتسريع الحفظ. املأ الحلقة حتى 1-2 سم أسفل فتحة التهوية في الجزء العلوي من الكيس. أغلق فتحة التهوية ومحبس منفذ الحقن.
   3. للتصريف ، افتح فتحة التهوية ومحبس منفذ الحقن وقم بخفض القمع إلى ما دون مستوى المقعد. ارفع المضخة فوق منفذ الصرف لتفريغ السائل المتبقي.
2. إلغاء تهوية حلقة الاختبار
   ملاحظة: قم بتنفيذ هذا الإجراء عند ملء الحلقة ب BSA أو الدم قبل بدء تشغيل المضخة.
   1. تأكد من عدم وجود هواء محاصر في أي مكان في الحلقة. قم بإزاحة فقاعات الهواء على الأسطح عن طريق النقر برفق على الأنبوب والخزان والضغط عليهما.
   2. في حالة تقييم مضخة دم التدفق المحوري ، قم بتدويرها في وضع رأسي لتحرير أي هواء عن طريق الطفو. إذا كنت تستخدم مضخة طرد مركزي ، فقم بقلبها رأسا على عقب وقم بتدويرها لضمان عدم احتجاز الهواء في مسارات التدفق الثانوية.
   3. افحص عن كثب الأقسام الأفقية للأنابيب والتقاطعات بين الأنابيب والموصلات للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء.
   4. اضغط على الكيس الوريدي لقريب مستوى السائل من الجزء العلوي الضيق وقم بتثبيت الكيس بمرقئ عبر خط السوائل للتخلص من واجهة السائل والهواء. أغلق محبس فتحة التهوية.
3. تجهيز خطوط الضغط ومنفذ أخذ العينات
   1. أغلق المحبس في نهاية خطوط الضغط ، وقم بإزالة أنبوب مقياس الضغط ، وقم بتوصيل حقنة سعة 3 مل. افتح محبس واسحب 1-2 مل من السائل في خط التمديد (حوالي 4 سم).
   2. أغلق المحبس وافصل المحقنة وأعد توصيل أنبوب مقياس الضغط. افتح محبس المحطة لتمكين قراءات الضغط.
   3. قم بتجهيز منفذ أخذ العينات باستخدام حقنة.
4. تنظيف منافذ الحقن وأخذ العينات
   1. قص أو تمزيق منديل خال من النسالة إلى ثلاثة أجزاء متساوية. قم بلف زاوية جزء واحد لتشكيل طرف وإدخاله في المنفذ لامتصاص أي دم متبقي.
   2. قم بلف الجزء الثاني ، وقم بترطيبه بالمحلول الملحي ، وأدخل الطرف المبلل في المنفذ. قم بلفه حول المنفذ لإزالة كل الدم المتبقي.
   3. استخدم الجزء الثالث لامتصاص أي محلول ملحي متبقي في المنفذ.
      ملاحظة: قم بإجراء التنظيف هذا فور سحب عينة الدم أو عند وجود دم متبقي في المنافذ.

5. تخميل الأسطح الملامسة للدم

1. املأ الحلقة بمحلول BSA بنسبة 1٪ وقم بتشغيل VAD لتدويره لمدة 30 دقيقة على الأقل.
2. افحص الحلقة بحثا عن التسريبات وأعد تجميعها إذا لزم الأمر.
3. قم بتصريف محلول BSA تماما لتجنب تخفيف الدم.

6. اختبار التخثر

1. قم بإعداد حلقة الاختبار.
   1. املأ الحلقة ب 150 مل من الدم.
   2. قم بفك هواء الحلقة وقم بتجهيز خطوط الضغط ومنفذ أخذ العينات كما هو موضح في الخطوات 4.2-4.4.
   3. ابدأ تشغيل المضخة بسرعة منخفضة وقم بتشغيلها لمدة 5 ثوان تقريبا لإخراج أي فقاعات هواء محاصرة داخل المضخة ، ثم أوقف المضخة.
   4. إذا ظهرت أي فقاعات في الكيس ، كرر الخطوة 4.2 لإجراء إزالة البث مرة أخرى.
   5. أعد تشغيل المضخة بسرعة منخفضة لتدوير الدم في الحلقة.
2. أضف الهيبارين إلى الدم في الحلقة.
   1. نقل 1 مل من الهيبارين الصوديوم (1000 وحدة / مل) و 1.5 مل من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA ؛ 0.5 م) من عبوة الشركة المصنعة إلى أنابيب منفصلة لسهولة التعامل معها أثناء الاختبار.
   2. استخدم المنفذ العرضي لمحبس ثلاثي الاتجاهات لإدارة المواد في الحلقة باستخدام حقنة. قم بتدوير قفل اللور الذكر على محبس التثبيت بحيث يكون منفذ الحقن متجها لأعلى لاحتجاز فقاعات الهواء في الأعلى.
   3. حقق تركيز الهيبارين 0.5 وحدة / مل في الحلقة عن طريق إضافة 75 وحدة من الهيبارين الصوديوم إلى 150 مل من الدم. قم بشفط 75 وحدة من الهيبارين (75 ميكرولتر في حالة استخدام تركيز 1000 وحدة / مل) في ماصة دقيقة وتوزيعها في حقنة سعة 3 مل عن طريق توزيع الماصة في نفس الوقت وسحب مكبس المحقنة. تأكد من نقل كل السوائل دون انسكاب.
   4. قم بتوصيل المحقنة بمنفذ الحقن عبر قفل اللور ، بحيث يكون المنفذ متجها لأعلى وطرف المحقنة متجها عموديا لأسفل. اسحب مكبس المحقنة لملئه بالدم واخلط الهيبارين بالدم أثناء شفط أي هواء في المحقنة. اسمح لفقاعة الهواء بالارتفاع إلى أعلى المحقنة. حقن الخليط في الحلقة ، مع ضمان عدم دخول الهواء.
   5. نقل الدم داخل وخارج المحقنة 4-5 مرات للتأكد من أن الدم الهباريني لا يبقى محصورا في المساحة الموجودة في المنفذ. تأكد من عدم دخول الهواء إلى الحلقة.
3. معايرة ACT من الدم في حلقة.
   1. حقق تركيزا أوليا للكالسيوم يبلغ 5 ملي مولار في الحلقة عن طريق إضافة 750 ميكرولتر من محلول 1 M CaCl₂ إلى 150 مل من الدم باستخدام نفس إجراء الهيبارين.
      1. قد يبدأ الدم المتعرض لتركيزات عالية من الكالسيوم في التخثر في المحقنة. حقن السائل بسرعة بعد إزالة الهواء المتبقي. اختياريا ، قم بتخفيف CaCl₂ في المحقنة ب 1 مل من محلول ملحي مخزن TRIS لتقليل خطر التخثر المبكر.
   2. اسمح لكلوريد الكالسيوميوم₂ المحقون بالدوران في الحلقة لمدة دقيقتين على الأقل قبل سحب عينة دم لقياس ACT الأولي.
   3. قم بتوصيل حقنة سعة 1 مل بمنفذ أخذ العينات. اسحب 0.5 مل من فضلات الدم وتخلص منها لإزالة الدم الراكد من المنفذ.
   4. قم بتوصيل حقنة جديدة سعة 1 مل ، واسحب 0.5 مل من الدم لتحليلها ، وقم بقياس ACT. قم بتنظيف منفذ أخذ العينات باستخدام الإجراء الوارد في الخطوة 4.4.
   5. راجع قيم المعايرة بالتحليل الحجمي في الخطوة 3.2 لإبلاغ تركيز كلوريد الكالسيوم₂ المستهدف. زيادة تركيز الكالسيوم بشكل تدريجي لتحقيق ACT 300 ثانية. تجنب إضافة الكمية الكاملة من CaCl₂ دفعة واحدة لمنع التخثر السريع.
      ملاحظة: في الاختبار المستخدم في هذه الدراسة ، أدى تركيز الكالسيوم الأولي البالغ 5 ملي مولار إلى ACT من 450 ± 50 ثانية ، وينتج عن التركيز النهائي البالغ 7-8 ملي مولار ACT من 300 ± 20 ثانية. في حين أن هذه الاستجابة قد تختلف ، تهدف إلى جعل ACT إلى أو أقل من 300 ثانية لبدء الاختبار.
4. ابدأ الاختبار.
   1. بمجرد تحقيق ACT البالغ 300 ثانية في الحلقة ، ابدأ اختبار 1-ساعة. اضبط المضخة على معدل التدفق والضغط المطلوبين عن طريق تعديل سرعة الدوار وتنظيم المقاومة باستخدام مشبك هوفمان.
   2. قم بقياس ACT كل 15 دقيقة باتباع الخطوات 6.3.3-6.3.4.
   3. إذا انخفض ACT إلى أقل من 200 ثانية، فقم بحقن 25 وحدة إضافية من الهيبارين الصوديوم في الحلقة.
5. إنهاء الاختبار.
   1. في نهاية 1 ساعة ، قم بحقن EDTA في الحلقة لمنع المزيد من التخثر ، واستهداف تركيز نهائي يبلغ 5 ملي مولار في الدم. (حقن 1.5 مل في حالة استخدام محلول EDTA 0.5 M.)
   2. اترك EDTA يدور ويخلط لمدة دقيقتين ، ثم أوقف المضخة.
6. افصل المضخة واشطفها.
   1. قم بتثبيت الأنبوب المتصل بمدخل ومخرج المضخة باستخدام مرقئ الدم ، ووضع المشابك على بعد 3-4 سم من أشواك المدخل والمخرج.
   2. افصل الأنبوب بعناية لتحرير المضخة.
   3. صفي الدم من المضخة وتدفق حلقة في وعاء.
   4. اغسل أي دم متبقي من المضخة عن طريق تغذية الجاذبية أو سحب المحلول الملحي من خلال مدخل ومخرج المضخة.
      ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوتين 6.7 و6.8 بشكل متزامن.
7. افحص مسار تدفق المضخة.
   1. التقط صورا لمدخل ومخرج المضخة باستخدام كاميرا المنظار / المنظار.
   2. قم بتفكيك المضخة (إن أمكن). اغسل المكونات في حمام ملحي وافحص بحثا عن الجلطة باستخدام منظار تشريح أو عدسة ماكرو.
   3. تصوير الأسطح الملامسة للدم للتوثيق.
      ملاحظة: يعد الفحص المتسق والتوثيق الشامل أمرا بالغ الأهمية للاختبار المقارن.
8. تصفية الدم المستخدم.
   1. قم بقص قطعة من قماش شبكي من النايلون 100 ميكرومتر كبيرة بما يكفي لتغطية فتحة حاوية الصيد.
   2. ضع الشبكة فوق الحاوية مع ستارة طفيفة للسماح للدم بالتدفق من خلالها بشكل فعال. قم بتأمين حواف الشبكة لمنعها من الانزلاق أثناء الترشيح.
   3. مرر الدم المستخدم من خلال شبكة النايلون. تخلص من الدم وفقا لإرشادات المؤسسة لمعالجة النفايات البيولوجية.
   4. افحص الشبكة بحثا عن الجلطة التي تم التقاطها وتوثيق النتائج.
9. استعد للتحليل النسيجي.
   1. إذا تم التخطيط للتحليل النسيجي ، فقم بإصلاح أي جلطة في محلول الفورمالين باتباع إجراءات السلامة المناسبة.
      تنبيه: استخدم دائما غطاء الدخان عند التعامل مع الفورمالديهايد.

7. إجراء التنظيف

1. تفكيك حلقة التدفق. تخلص من كيس الدم والأنابيب البلاستيكية.
2. انقع جميع المكونات الأخرى الملامسة للدم (الموصلات ، محبس القفل ، أقفال اللور ، إلخ) في محلول منظف مسحوق نشط بالإنزيم بنسبة 1٪ طوال الليل. اشطفها بماء الصنبور الدافئ ، متبوعا بماء DI ، وجففها في الهواء.
   1. إذا بقيت الجلطات ، قم بصوتنة المكونات في محلول المنظف. اشطفها جيدا وجففها في الهواء.
3. نظف المضخة.
   1. إذا كان من الممكن تفكيك المضخة ، فقم بنقع المكونات الملامسة للدم وصوتنة بمحلول منظف / مزيل شحوم لجميع الأغراض بنسبة 1٪ ، متبوعا بمحلول منظف مسحوق نشط بالإنزيم بنسبة 1٪.
   2. إذا تعذر تفكيك المضخة ، فقم بتوصيلها بحلقة تدفق جديدة مملوءة بمحاليل التنظيف وقم بتشغيلها بسرعة عالية لمدة 30 دقيقة على الأقل. كرر حسب الضرورة.
4. اشطف المضخة جيدا بماء الصنبور الدافئ ، متبوعا بماء DI ، وجففها في الهواء.

النتائج

يتيح التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول تحديد المناطق الموضعية لترسب الصفائح الدموية ، مما يكشف عن البقع الإشكالية داخل مسار تدفق المضخة. يسمح التطبيق المتسق لهذا البروتوكول بإجراء تحسينات تدريجية من خلال معالجة هذه "النقاط الساخنة" المحددة.

على سبيل المثال...

Discussion

دائما ما تكون التجربة الأولى على الإنسان لمضخة جديدة مسعى محفوفا بالمخاطر ، حيث لا يمكن للدراسات قبل السريرية أن تتنبأ بشكل موثوق بتجلط الدم في أجهزة المساعدة البطينية لدى^{البشر 26}. والجدير بالذكر أن بعض أجهزة المساعدة البطينية التي أظهرت التحرر من تجلط الدم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr