В пробирке Тест на тромбоз для вспомогательных желудочковых устройств

Резюме

Мы представляем настольный протокол индуцирования тромбоза в желудочковых вспомогательных устройствах (VAD) на рециркуляционной тестовой платформе. Этот метод служит для выявления тромбогенных горячих точек в пути кровотока и может помочь улучшить тромборезистентность перед доклиническими испытаниями на животных моделях.

Аннотация

Риск тромбоза остается серьезной проблемой при разработке и клиническом использовании желудочковых вспомогательных устройств (VAD). Традиционная оценка тромбогенности VAD, в первую очередь с помощью исследований на животных, является дорогостоящей и трудоемкой, вызывает этические проблемы и, в конечном счете, может неточно отражать результаты для человека. Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали агрессивный протокол тестирования in vitro , предназначенный для провоцирования тромбоза и выявления потенциальных областей высокого риска в пути кровотока. Этот протокол, вдохновленный работой Maruyama et al., использует модифицированную стратегию антикоагуляции и использует легкодоступные компоненты, что делает его доступным для большинства лабораторий, проводящих анализ крови in vitro . Мы продемонстрировали полезность этого метода с помощью итерационного тестирования и усовершенствования миниатюрного педиатрического VAD с магнитной левитацией (PediaFlow PF5). Метод оказался эффективным в выявлении тромбогенных горячих точек, вызванных конструктивными и производственными дефектами в ранних прототипах VAD, что позволило целенаправленно усовершенствовать его до перехода к исследованиям на животных. Несмотря на свои ограничения, в том числе отсутствие пульсирующего кровотока и влияние характеристик донорской крови, этот протокол служит практическим инструментом для ранней стадии развития ВАД и снижения риска.

Введение

Желудочковые вспомогательные устройства (ВАД) стали стандартом лечения пациентов с прогрессирующей сердечной недостаточностью, однако риск тромбоза и инсульта остается серьезной проблемой ^1,2. Тромбоз при VADs обычно оценивается в ходе доклинических исследований на животных, которые, хотя и ценны, сопряжены со значительными затратами и логистическими проблемами. Эти исследования являются ресурсоемкими, трудоемкими и подвержены риску наличия одного дефекта, который ставит под угрозу весь тест и требует дополнительных испытаний. Это не только увеличивает финансовое бремя, но и вызывает этические опасения из-за необходимости повторных испытаний на животных.

Несмотря на то, что существует множество численных моделей для прогнозирования отложения тромбоцитов и тромбоза 3,4,5,6, только некоторые из них подходят для моделирования образования тромбов в макромасштабных устройствах, таких как VADs ^7,8,9. Более того, существующие модели неизбежно предполагают идеализированные поверхности и упрощенную «водонепроницаемую» геометрию, которые не точно отражают сложности и несовершенства реальных насосных узлов. Когда рассматриваются взаимодействия тромбоцитов с поверхностью, в этих макромасштабных моделях обычно используются единообразно заданные свойства материала (обычно моделируемые в виде коэффициента в граничных условиях поверхностного потока)10,11,12. Следовательно, численные модели не могут полностью заменить экспериментальное тестирование с кровью.

Как выбор материала, так и обработка поверхности играют решающую роль в адгезии тромбоцитов на поверхностях VAD 13,14,15,16,17. Дефекты, такие как шероховатые пятна или неровности, могут способствовать адгезии тромбоцитов и образованию тромбов. Кроме того, щели между компонентами на пути потока могут служить очагом тромбоза, обеспечивая защищенную среду, где могут образовываться и расти сгустки^18,19. Использование консистентных смазок, смазочных материалов или герметиков во время сборки также может представлять риск, так как эти вещества могут просачиваться в поток и взаимодействовать с кровью, что еще больше увеличивает риск осложнений.

В связи с этим существует потребность в четко определенном протоколе тестирования in vitro, который может надежно оценить тромборезистентность VADs до того, как они будут подвергнуты испытаниям на животных или клиническому использованию. Несмотря на то, что существует широко принятый стандарт ASTM для оценки гемолиза²⁰, не существует такого стандарта для тестирования тромбогенности VADs в клинически значимых условиях эксплуатации²¹. Несмотря на плодотворные исследования, проведенные три десятилетия назад, демонстрирующие возможность тестирования тромбоза in vitro для кровяных насосов 22,23,24,25, испытания на животных до сих пор остаются фактической практикой оценки тромбоза²⁶. Препятствием для более широкого внедрения методов in vitro, вероятно, является сложный характер коагуляции с множеством искажающих факторов, которые могут влиять на результаты тестов, что затрудняет дифференциацию тромбогенности внутренней помпы от артефактов, возникающих из-за методологических ограничений и процедурных ошибок.

Это побудило нас поделиться подробным протоколом в качестве руководства для экспериментаторов, чтобы избежать ловушек, тем самым способствуя использованию испытаний in vitro и снижая зависимость от исследований на животных. Описанный здесь протокол, полученный из Maruyama et ^al.27, был уточнен и валидирован в ходе разработки педиатрического VAD^28,29 PediaFlow (PF5)^5-го поколения. Этот метод тестирования сыграл важную роль в систематическом выявлении и устранении потенциальных тромбогенных рисков в прототипах VAD перед испытаниями на животных.

протокол

Цельная овечья кровь, использованная в этом исследовании, была получена от коммерческого поставщика и, следовательно, не требовала рассмотрения Комитетом по уходу за животными и их использованию Корнельского университета.

1. Построение тестового контура потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный список компонентов петли и всех других материалов, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Модифицируйте мешок для внутривенного введения (ВВ).
   1. Используйте пластиковый термосварщик для модификации пакета для внутривенных вливаний, чтобы отрегулировать его объем и форму, как показано на рисунке 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Форма мешка облегчает удаление воздуха и позволяет зажимать мешок с помощью гемостата поперек линии жидкости^30,31. Расположение линии герметизации выбирается в зависимости от объема грунтовки VAD и трубки для достижения общего объема грунтовки 150 мл.
   2. Введите вентиляционное отверстие, сделав 4-миллиметровый надрез в верхней части мешка. Вставьте в разрез зазубренный замок с зазубренной внутренней резьбой и заклейте место слоистым каучуковым клеем RTV. Прикрепите односторонний запорный кран к замку Люэра.
2. Соберите испытательный контур с помощью модифицированного пакета для внутривенных вливаний, трубки из поливинилхлорида (ПВХ), соединителей с зазубринами из поликарбоната и 3-ходовых и 1-ходовых запорных кранов, как показано на рисунке 1.
3. Подключите манометр давления.
   1. Прикрепите 6-дюймовые удлинительные тросы к напорным отверстиям на входе и выходе. Прикрепите односторонний запорный кран к другому концу удлинительной линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запорный кран позволяет отсоединить трубку манометра для заполнения удлинительной линии жидкостью перед запуском насоса, как описано в шаге 4.3.
   2. Подсоедините один конец каждой трубки внутреннего диаметра (ID) 1/8 дюйма к штуцеру манометра и вставьте фитинг с наружной резьбой на другом конце.
   3. Подсоедините фитинги люэра с наружной резьбой к односторонним запорным кранам. Откройте запорные краны, чтобы включить показания давления.
4. Примените накладной ультразвуковой датчик потока для измерения расхода.
5. Поместите зажим Хоффмана дистальнее выходного отверстия для регулировки сопротивления потоку.

2. Приготовление раствора хлорида кальция (CaCl₂)

1. Растворите порошкообразный CaCl₂ в 1x TRIS-буферизованном физиологическом растворе (pH 7,4) для приготовления 1 М раствора. Избегайте фосфатсодержащих буферов (например, PBS или DPBS), так как кальций и фосфат вступают в реакцию с образованием нерастворимого осадка.
2. При приготовлении CaCl₂ в больших количествах добавляйте порошок CaCl₂ постепенно в несколько этапов, так как его растворение является экзотермическим процессом.
3. Титруйте pH раствора до 6-8 с помощью соляной кислоты (HCl) или гидроксида натрия (NaOH) при необходимости.

3. Подготовка крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Овечья кровь, использованная в этом исследовании, была получена от коммерческого поставщика, указанного в Таблице материалов. Кровь собирали с помощью иглы 14-G, при этом животное удерживалось в стандартном сельскохозяйственном положении стоя. Процесс сбора занимал 10-12 минут от введения иглы до завершения. Кровь содержали антикоагулянтные препараты с 14 частями CPD на 86 частей крови (состав CPD: 26,3 г/л Na-цитрата, 25,2 г декстрозы, 3 г/л лимонной кислоты и 2,2 г/л Na-фосфата в деионизированной воде [DI]). Мешок с кровью был отправлен на ночь в изолированном контейнере с пакетами со льдом и использован для эксперимента в течение 24 часов после сбора.

1. Подготовьте донорскую кровь к использованию.
   1. Поместите пакет с кровью на наклонную платформу на 15-30 минут, чтобы кровь аккуратно перемешалась и она нагрелась до комнатной температуры (RT).
   2. Поместите магнитную мешалку в поликарбонатный стакан или контейнер, предназначенный для перекачки крови.
   3. Перенесите кровь в стакан через фильтр для переливания крови для удаления макроагрегатов. Обращайтесь с кровью осторожно, чтобы не повредить клеточные компоненты. Вылейте кровь вдоль стенок контейнера, чтобы избежать свободного падения и свести к минимуму травматизацию клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слейте кровь, если присутствуют большие тромбы или если фильтр засоряется.
   4. Поместите стакан или емкость на магнитную мешалку и регулируйте скорость до тех пор, пока поверхность крови не начнет мягко вращаться, не образуя большого вихря. Непрерывно помешивайте не менее 5 минут.
   5. Измерьте количество гематокритов и тромбоцитов, чтобы убедиться, что значения находятся в пределах нормы для данного вида.
2. Выполните титрование для определения целевой концентрации CaCl₂ .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Циттратная кровь рекальцифицируется для обеспечения коагуляции и тестирования на тромбоз, а также добавляется гепарин для предотвращения безудержного свертывания. Целевое активированное время свертывания крови (ACT) для начала теста составляет 300 с. Обратите внимание, что референтные значения ACT, приведенные в этом разделе, были получены с использованием донорской крови овец и могут варьироваться в зависимости от вида и уровня антикоагулянтов, использованных при сборе. Кроме того, измерения ACT могут различаться между приборами 32,33,34. Для определения оптимального диапазона ACT для конкретной лабораторной установки может потребоваться метод проб и ошибок.
   1. Во избежание загрязнения исходных растворов переведите 2 мл приготовленного 1 М раствора CaCl₂ и 0,5 мл гепарина натрия (1000 Ед/мл) из упаковки производителя в микроцентрифужные пробирки.
   2. Перелейте 10 мл крови в полипропиленовые пробирки объемом 14 мл. Подготовьте четыре такие трубочки.
   3. Для достижения концентрации гепарина в крови 0,5 мкЛ/мл добавьте 5 мкл гепарина натрия в образец крови объемом 10 мкл.
   4. Для достижения концентрации кальция в крови 5 мМ добавьте 50 мкл 1 М раствора CaCl₂ в 10 мл крови. Во время дозирования поворачивайте наконечник дозатора, чтобы распределить CaCl₂ по более широкой площади.
   5. Сразу же переверните трубку 10 раз, прокатайте ее горизонтально (на ровной поверхности или между ладонями), затем переверните еще 10 раз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
   6. Измерьте ACT с помощью свертывающей системы цельной крови в месте оказания медицинской помощи, следуя инструкциям производителя. Начальный ACT обычно находится в диапазоне 400-500 с.
   7. Сохраняя концентрацию гепарина постоянной, увеличьте концентрацию CaCl₂ (примерно до 7-8 мМ) для достижения ACT 300 с.
   8. Проверьте конечную концентрацию и полученный ACT в отдельной пробирке с кровью.

4. Процедуры предварительного тестирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, описанные в этом разделе, относятся к разделам 5 и 6. Выполните эти действия перед вводом в действие насоса бычьего сывороточного альбумина (БСА) или крови в петле. Переносите кровь между сосудами с помощью гравитационного питания, чтобы свести к минимуму механическое напряжение. Избегайте использования поршня шприца для отдачи крови, так как это может создать чрезмерное давление. Кроме того, избегайте дросселирования крови через узкие отверстия, чтобы предотвратить повреждение клеточных компонентов.

1. Заполнение и осушение испытательного контура
   1. Подсоедините 30-дюймовый удлинительный трос к порту для инъекций и подключите цилиндр шприца объемом 60 мл в качестве воронки. Откройте запорный кран бачка, чтобы он действовал как вентиляционное отверстие.
   2. Налейте жидкость в воронку, поднимая ее по мере необходимости для ускорения подачи. Заполните петлю на 1-2 см ниже вентиляционного отверстия в верхней части мешка. Закройте запорные краны вентиляционного отверстия и отверстия впрыска.
   3. Чтобы слить воду, откройте запорные краны вентиляционного отверстия и отверстия впрыска и опустите воронку ниже уровня скамейки. Поднимите насос над дренажным отверстием, чтобы слить оставшуюся жидкость.
2. Удаление воздуха из тестового контура
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эту процедуру при заполнении петли BSA или кровью перед запуском насоса.
   1. Убедитесь, что воздух не задерживается нигде в контуре. Удалите пузырьки воздуха с поверхностей, осторожно постукивая и сжимая трубку и резервуар.
   2. При оценке осевого насоса для крови поверните его в вертикальное положение, чтобы выпустить воздух за счет плавучести. Если вы используете центробежный насос, переверните его вверх дном и поворачивайте, чтобы воздух не попал во вторичные потоки.
   3. Внимательно осмотрите горизонтальные участки трубок и соединения между трубками и соединителями, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха.
   4. Сожмите мешок для внутривенных вливаний, чтобы приблизить уровень жидкости к верхней узкой части, и зажмите мешок с помощью гемостата поперек линии жидкости, чтобы устранить границу раздела жидкость-воздух. Закройте запорный кран вентиляционного отверстия.
3. Заливка напорных трубопроводов и отверстия для отбора проб
   1. Закройте запорный кран в конце напорных линий, снимите трубку манометра и прикрепите к нему шприц объемом 3 мл. Откройте запорный кран и наберите 1-2 мл жидкости в удлинительную линию (примерно 4 см).
   2. Закройте запорный кран, отсоедините шприц и снова подсоедините трубку манометра. Откройте запорный кран, чтобы включить показания давления.
   3. Загрунтуйте отверстие для отбора проб с помощью шприца.
4. Очистка отверстий впрыска и отбора проб
   1. Разрежьте или порвите безворсовую салфетку на три равных фрагмента. Закрутите угол одного фрагмента, чтобы сформировать наконечник, и вставьте его в порт, чтобы впитать остатки крови.
   2. Второй фрагмент скрутить, смочить его солевым раствором, а влажный кончик вставить в порт. Поверните его вокруг порта, чтобы удалить всю оставшуюся кровь.
   3. Используйте третий фрагмент, чтобы впитать остатки физиологического раствора в порту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эту процедуру очистки сразу после взятия образца крови или при наличии остатков крови в портах.

5. Пассивация поверхностей, контактирующих с кровью

1. Заполните контур 1% раствором BSA и используйте VAD для циркуляции в течение не менее 30 минут.
2. Осмотрите петлю на наличие утечек и при необходимости соберите ее обратно.
3. Полностью слейте раствор БСА, чтобы избежать гемодилюции.

6. Тестирование на тромбоз

1. Подготовьте тестовый цикл.
   1. Заполните петлю 150 мл крови.
   2. Обеспылите воздух из контура и заправьте напорные трубопроводы и отверстие для отбора проб, как описано в шагах 4.2-4.4.
   3. Запустите насос на низкой скорости и работайте на нем в течение примерно 5 секунд, чтобы выбить все захваченные пузырьки воздуха внутри насоса, затем остановите насос.
   4. Если в пакете появились пузырьки, повторите шаг 4.2, чтобы снова выполнить удаление воздуха.
   5. Перезапустите насос на низкой скорости, чтобы кровь циркулировала в контуре.
2. Добавьте гепарин в кровь в петлю.
   1. Переложите 1 мл гепарина натрия (1000 Ед/мл) и 1,5 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА; 0,5 М) из упаковки производителя в отдельные пробирки для удобства работы во время испытания.
   2. Используйте поперечный порт 3-ходового запорного крана для введения веществ в петлю с помощью шприца. Поверните замок Люэра с наружной резьбой на запорном кране так, чтобы отверстие впрыска было направлено вверх, чтобы улавливать пузырьки воздуха в верхней части.
   3. Добейтесь концентрации гепарина 0,5 Ед/мл в петле путем добавления 75 Ед гепарина натрия на 150 мл крови. Отасуньте 75 ЕД гепарина (75 мкл при использовании концентрации 1000 ЕД/мл) в микропипетку и распределите его в шприц объемом 3 мл, одновременно дозируя пипетку и вытягивая поршень шприца. Убедитесь, что вся жидкость не пролита.
   4. Прикрепите шприц к порту для инъекций с помощью замка Люэра так, чтобы порт был направлен вверх, а кончик шприца направлен вертикально вниз. Возьмите поршень шприца, чтобы наполнить его кровью, и смешайте гепарин с кровью, втягивая воздух в шприц. Дайте воздушному пузырю подняться до верхней части шприца. Впрыскивайте смесь в контур, следя за тем, чтобы воздух не попадал внутрь.
   5. Внесите кровь в шприц и выйдите из него 4-5 раз, чтобы убедиться, что гепаринизированная кровь не остается в пространстве в порту. Следите за тем, чтобы воздух не попадал в контур.
3. Титруйте АКТ крови в петле.
   1. Добейтесь начальной концентрации кальция 5 мМ в петле путем добавления 750 мкл 1 М раствора CaCl₂ на 150 мл крови по той же схеме, что и гепарин.
      1. Кровь, подвергшаяся воздействию высоких концентраций кальция, может начать свертываться в шприце. Быстро впрыскивайте жидкость после удаления остатков воздуха. По желанию разведите CaCl₂ в шприце с 1 мл TRIS-буферизованного физиологического раствора для снижения риска преждевременной коагуляции.
   2. Дайте введенному CaCl₂ циркулировать в петле в течение не менее 2 минут перед взятием образца крови для измерения исходного ACT.
   3. Прикрепите шприц объемом 1 мл к порту для отбора проб. Сберите и слейте 0,5 мл отработанной крови, чтобы удалить стоячую кровь из порта.
   4. Прикрепите новый шприц емкостью 1 мл, возьмите 0,5 мл крови для анализа и измерьте ACT. Очистите порт для забора проб, используя процедуру, описанную в шаге 4.4.
   5. Обратитесь к значениям титрования на шаге 3.2, чтобы получить информацию о целевой концентрации CaCl₂ . Постепенно увеличивайте концентрацию кальция до достижения ACT 300 с. Избегайте добавления полного количества CaCl₂ за один раз, чтобы предотвратить быстрое свертывание крови.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе испытаний, использованных в данном исследовании, начальная концентрация кальция 5 мМ привела к ACT 450 ± 50 с, а конечная концентрация 7-8 мМ дала ACT 300 ± 20 с. Хотя эта реакция может варьироваться, постарайтесь довести ACT до 300 с или ниже к началу теста.
4. Начните тестирование.
   1. После того, как в контуре будет достигнут ACT в 300 с, начните 1-часовое испытание. Отрегулируйте насос до желаемого расхода и давления, изменяя частоту вращения ротора и регулируя сопротивление с помощью зажима Хоффмана.
   2. Измеряйте ACT каждые 15 минут, следуя шагам 6.3.3-6.3.4.
   3. Если ACT падает ниже 200 с, введите в петлю еще 25 ЕД гепарина натрия.
5. Завершите тест.
   1. По истечении 1 ч введите ЭДТА в петлю для ингибирования дальнейшей коагуляции, достигая конечной концентрации 5 мМ в крови. (Введите 1,5 мл при использовании 0,5 М раствора ЭДТА.)
   2. Дайте ЭДТА циркулировать и перемешайте в течение 2 минут, затем остановите насос.
6. Отсоедините и промойте насос.
   1. Зажмите трубку, соединенную с входом и выходом насоса, с помощью гемостатика, расположив хомуты на расстоянии 3-4 см от входных и выпускных штучек.
   2. Осторожно отсоедините трубку, чтобы освободить насос.
   3. Слейте кровь из насоса и слейте петлю в емкость.
   4. Смойте остатки крови из насоса с помощью гравитационной подачи или пипетирования физиологического раствора через входное и выходное отверстия насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 6.7 и 6.8 выполняются одновременно.
7. Осмотрите проточную траекторию насоса.
   1. Сделайте снимки входного и выходного отверстия насоса с помощью камеры эндоскопа/бороскопа.
   2. Разберите насос (если применимо). Промойте компоненты в солевой ванне и осмотрите на наличие тромбов с помощью препарирующего эндоскопа или макрообъектива.
   3. Сфотографируйте поверхности, контактирующие с кровью, для документирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательный контроль и тщательная документация имеют решающее значение для сравнительных испытаний.
8. Отфильтруйте использованную кровь.
   1. Отрежьте кусок нейлоновой сетчатой ткани толщиной 100 мкм достаточно большой, чтобы закрыть отверстие контейнера для улавливания.
   2. Расположите сетку над контейнером с помощью небольшой драпировки, чтобы кровь могла эффективно течь через нее. Закрепите края сетки, чтобы она не соскальзывала во время фильтрации.
   3. Пропустите использованную кровь через капроновую сетку. Утилизируйте кровь в соответствии с рекомендациями учреждения по обращению с биологическими отходами.
   4. Осмотрите сетку на наличие захваченных тромбов и задокументируйте результаты.
9. Подготовьтесь к гистологическому анализу.
   1. Если планируется гистологический анализ, устраните любые тромбы, обнаруженные в растворе формалина, в соответствии с соответствующими процедурами безопасности.
      ВНИМАНИЕ: Всегда используйте вытяжной шкаф при работе с формальдегидом.

7. Порядок уборки

1. Разберите проточную петлю. Выбросьте пакет для крови из ПВХ и трубку.
2. Замочите все остальные компоненты, контактирующие с кровью (соединители, запорные краны, люэровские замки и т. д.) в 1% ферментно-активном порошкообразном растворе моющего средства на ночь. Промойте теплой водой из-под крана, а затем деионизированной водой, и высушите на воздухе.
   1. Если сгустки остались, обработайте компоненты ультразвуком в растворе моющего средства. Тщательно промойте и высушите на воздухе.
3. Очистите насос.
   1. Если насос можно разобрать, замочите и проработайте ультразвуком компоненты, контактирующие с кровью, 1% универсальным раствором очистителя/обезжиривателя, а затем 1% раствором порошкообразного порошка с энзимами.
   2. Если насос не может быть разобран, подключите его к новому проточному контуру, заполненному чистящими растворами, и работайте на высокой скорости не менее 30 минут. При необходимости повторите.
4. Тщательно промойте насос теплой водой из-под крана, а затем деионионной водой, и высушите на воздухе.

Результаты

Успешное выполнение этого протокола позволяет идентифицировать локализованные участки отложения тромбоцитов, выявляя проблемные места в проточной части насоса. Последовательное применение этого протокола позволяет постепенно совершенствоваться за счет устранен...

Обсуждение

Первое испытание нового насоса на людях всегда является рискованным предприятием, поскольку доклинические исследования не могут надежно предсказать тромбогенность VADs у людей²⁶. Примечательно, что некоторые VAD, которые продемонстрировали отсутствие тро?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr