In vitro Prueba de trombosis para dispositivos de asistencia ventricular

Resumen

Presentamos un protocolo de sobremesa para inducir trombosis en dispositivos de asistencia ventricular (VAD) dentro de una plataforma de prueba de recirculación. Este método sirve para identificar puntos calientes trombogénicos en la ruta del flujo sanguíneo y puede ayudar a mejorar la tromboresistencia antes de las pruebas preclínicas en modelos animales.

Resumen

El riesgo de trombosis sigue siendo una preocupación importante en el desarrollo y el uso clínico de los dispositivos de asistencia ventricular (DAV). Las evaluaciones tradicionales de la trombogenicidad de la DVA, principalmente a través de estudios en animales, son costosas y requieren mucho tiempo, plantean preocupaciones éticas y, en última instancia, pueden no reflejar con precisión los resultados humanos. Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un protocolo agresivo de pruebas in vitro diseñado para provocar trombosis e identificar posibles áreas de alto riesgo dentro de la ruta del flujo sanguíneo. Este protocolo, motivado por el trabajo de Maruyama et al., emplea una estrategia de anticoagulación modificada y utiliza componentes fácilmente disponibles, lo que lo hace accesible a la mayoría de los laboratorios que realizan análisis de sangre in vitro de los VAD. Demostramos la utilidad de este método a través de pruebas iterativas y el refinamiento de un dispositivo de asistencia ventricular pediátrico en miniatura levitado magnéticamente (PediaFlow PF5). El método ha sido eficaz en la identificación de puntos calientes trombogénicos causados por defectos de diseño y fabricación en los primeros prototipos de VAD, lo que permite mejoras específicas antes de avanzar a los estudios en animales. A pesar de sus limitaciones, incluida la ausencia de flujo pulsátil y la influencia de las características de la sangre del donante, este protocolo sirve como una herramienta práctica para el desarrollo de la VAD en etapas tempranas y la mitigación de riesgos.

Introducción

Los dispositivos de asistencia ventricular (VAD) se han convertido en un estándar de atención en el tratamiento de pacientes con insuficiencia cardíaca avanzada, sin embargo, el riesgo de trombosis y accidente cerebrovascular sigue siendo un desafío importante ^1,2. La trombosis dentro de los VAD generalmente se evalúa durante estudios preclínicos con animales, que, si bien son valiosos, presentan costos sustanciales y desafíos logísticos. Estos estudios requieren muchos recursos, requieren mucho tiempo y son susceptibles de que un solo defecto comprometa toda la prueba y requiera ensayos adicionales. Esto no solo aumenta la carga financiera, sino que también plantea preocupaciones éticas debido a la necesidad de repetir las pruebas con animales.

Aunque existen muchos modelos numéricos para predecir el depósito de plaquetas y la trombosis 3,4,5,6, solo unos pocos son adecuados para simular la formación de trombos en dispositivos a macroescala como los VADs ^7,8,9. Además, los modelos existentes asumen inevitablemente superficies idealizadas y geometrías "estancas" simplificadas, que no reflejan con precisión las complejidades e imperfecciones de los conjuntos de bombas del mundo real. Cuando se consideran las interacciones plaqueta-superficie, estos modelos a macroescala generalmente emplean propiedades de material prescritas uniformemente (típicamente modeladas como un coeficiente en las condiciones límite superficie-flujo)10,11,12. En consecuencia, los modelos numéricos no pueden sustituir por completo a las pruebas experimentales con sangre.

Tanto la elección del material como el acabado de la superficie juegan un papel fundamental en la adhesión de las plaquetas en las superficies VAD 13,14,15,16,17. Las imperfecciones, como las manchas ásperas o las irregularidades, pueden favorecer la adhesión de las plaquetas y la formación de trombos. Además, las grietas entre los componentes en la ruta del flujo pueden servir como un nido para la trombosis, proporcionando entornos protegidos donde se pueden formar y crecer coágulos^18,19. El uso de grasa, lubricantes o selladores durante el montaje también puede suponer un riesgo, ya que estas sustancias pueden filtrarse en la trayectoria del flujo e interactuar con la sangre, lo que aumenta aún más el riesgo de complicaciones.

Por lo tanto, existe la necesidad de un protocolo de pruebas in vitro bien definido que pueda evaluar de forma fiable la tromboresistencia de los VAD antes de que se sometan a pruebas con animales o a su uso clínico. Si bien existe una norma ASTM ampliamente adoptada para la evaluación de la hemólisis²⁰, no existe una norma de este tipo para las pruebas de trombogenicidad de los VAD en condiciones de funcionamiento clínicamente relevantes²¹. A pesar de los estudios seminales que datan de hace tres décadas y demuestran la factibilidad de las pruebas de trombosis in vitro para bombas de sangre 22,23,24,25, la prueba en animales ha persistido como la práctica de facto para evaluar la trombosis hasta la fecha²⁶. El obstáculo para una adopción más amplia de los métodos in vitro ha sido probablemente la naturaleza compleja de la coagulación, con la multitud de factores de confusión que pueden influir en los resultados de las pruebas, lo que dificulta diferenciar la trombogenicidad intrínseca de la bomba de los artefactos que surgen debido a limitaciones metodológicas y errores de procedimiento.

Esto nos motivó a compartir un protocolo detallado como guía para que los experimentalistas eviten trampas, promoviendo así el uso de pruebas in vitro y mitigando la dependencia de los estudios con animales. El protocolo aquí descrito, derivado de Maruyama et ^al.27, fue refinado y validado durante el diseño del VAD pediátrico PediaFlow (PF5) de^5ª generación^28,29. Este método de prueba demostró ser fundamental para identificar y abordar sistemáticamente los riesgos trombogénicos potenciales en los prototipos de VAD antes de las pruebas con animales.

Protocolo

La sangre entera ovina utilizada en este estudio se obtuvo de un proveedor comercial y, por lo tanto, no requirió una revisión por parte del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Cornell.

1. Construcción del bucle de flujo de prueba

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista detallada de los componentes del bucle y todos los demás materiales utilizados en este protocolo.

1. Modifique la bolsa intravenosa (IV).
   1. Use un sellador térmico de plástico para modificar una bolsa intravenosa para ajustar su volumen y forma, como se muestra en la Figura 1.
      NOTA: La forma de la bolsa facilita la desaireación y permite sujetar la bolsa con un hemostático a través de la línea de fluido^30,31. La ubicación de la línea de sellado se elige en función del volumen de cebado del VAD y la tubería para lograr un volumen total de cebado de 150 mL.
   2. Introduce una rejilla de ventilación haciendo una incisión de 4 mm en la parte superior de la bolsa. Inserte un bloqueo luer hembra con púas en la incisión y selle el sitio con adhesivo de caucho de silicona RTV. Coloque una llave de paso unidireccional en la cerradura luer.
2. Ensamble el circuito de prueba utilizando la bolsa IV modificada, la tubería de cloruro de polivinilo (PVC), los conectores de púas de policarbonato y las llaves de paso de 3 y 1 vía, como se muestra en la Figura 1.
3. Conecte el manómetro de presión.
   1. Conecte líneas de extensión de 6 pulgadas a los puertos de presión del lado de entrada y salida. Conecte una llave de paso unidireccional al otro extremo de la línea de extensión.
      NOTA: La llave de paso permite desconectar el tubo del manómetro para cebar la línea de extensión con fluido antes de arrancar la bomba, como se describe en el paso 4.3.
   2. Conecte un extremo de cada tubo de diámetro interior (ID) de 1/8" a una lengüeta de manómetro e inserte un accesorio luer macho en el otro extremo.
   3. Conecte los accesorios luer macho a las llaves de paso unidireccionales. Abra las llaves de paso para habilitar las lecturas de presión.
4. Aplique una sonda de flujo ultrasónica de pinza para medir el caudal.
5. Coloque una abrazadera Hoffman distal al puerto de presión de salida para regular la resistencia al flujo.

2. Preparación de la solución de cloruro de calcio (CaCl₂)

1. Disuelva CaCl₂ en polvo en solución salina tamponada TRIS 1x (pH 7,4) para preparar una solución 1 M. Evite los tampones que contengan fosfato (por ejemplo, PBS o DPBS) ya que el calcio y el fosfato reaccionan para formar un precipitado insoluble.
2. Si prepara CaCl₂ en grandes cantidades, agregue el polvo de CaCl₂ de forma incremental en varios pasos, ya que su disolución es un proceso exotérmico.
3. Ajuste el pH de la solución a 6-8 usando ácido clorhídrico (HCl) o hidróxido de sodio (NaOH) si es necesario.

3. Preparación de la sangre

NOTA: La sangre ovina utilizada en este estudio se obtuvo de un proveedor comercial que figura en la Tabla de Materiales. La sangre se recolectó con una aguja de 14 G, con el animal inmovilizado en una posición de pie agrícola estándar. El proceso de recolección duró de 10 a 12 minutos desde la inserción de la aguja hasta su finalización. La sangre fue anticoagulada con 14 partes de CPD por 86 partes de sangre (formulación de CPD: 26,3 g/L de Na-Citrato, 25,2 g de dextrosa, 3 g/L de ácido cítrico y 2,2 g/L de Na Fosfato en agua desionizada [DI]). La bolsa de sangre se envió durante la noche en un contenedor aislado con bolsas de hielo y se utilizó para el experimento dentro de las 24 horas posteriores a la recolección.

1. Prepare la sangre del donante para su uso.
   1. Coloque la bolsa de sangre en una plataforma inclinable durante 15-30 minutos para mezclar la sangre suavemente y permitir que alcance la temperatura ambiente (RT).
   2. Coloque una barra agitadora magnética en un vaso de policarbonato o en un recipiente designado para la transferencia de sangre.
   3. Transfiera la sangre al vaso de precipitados a través de un filtro de transfusión para eliminar los macroagregados. Manipule la sangre con cuidado para evitar daños a los componentes celulares. Vierta la sangre a lo largo de las paredes del recipiente para evitar la caída libre y minimizar el trauma celular.
      NOTA: Deseche la sangre si hay trombos grandes o si el filtro se obstruye.
   4. Coloque el vaso de precipitados o el recipiente en un agitador magnético y ajuste la velocidad hasta que la superficie de la sangre comience a girar suavemente sin formar un gran vórtice. Revuelva continuamente durante al menos 5 minutos.
   5. Mida el hematocrito y el recuento de plaquetas para asegurarse de que los valores estén dentro del rango normal para la especie.
2. Realice valoraciones para determinar la concentración objetivo de CaCl₂ .
   NOTA: La sangre citrato se recalcifica para permitir la coagulación y las pruebas de trombosis, con heparina añadida para evitar la coagulación descontrolada. El tiempo de coagulación activado (ACT) objetivo para el inicio de la prueba es de 300 s. Tenga en cuenta que los valores de ACT de referencia proporcionados en esta sección se obtuvieron utilizando sangre de oveja donada y pueden variar según la especie y el nivel de anticoagulación utilizado durante la recolección. Además, las mediciones de ACT pueden variar entre instrumentos 32,33,34. Es posible que se requiera un poco de prueba y error para establecer el rango óptimo de ACT para una configuración de laboratorio específica.
   1. Transfiera 2 mL de la solución preparada de CaCl₂ 1 M y 0,5 mL de heparina sódica (1000 U/mL) del embalaje del fabricante a tubos de microcentrífuga para evitar la contaminación de las soluciones madre.
   2. Transfiera 10 mL de sangre a tubos de ensayo de polipropileno de 14 mL. Prepara cuatro de estos tubos.
   3. Para lograr una concentración de heparina de 0,5 U/mL en sangre, agregue 5 μL de heparina sódica a la muestra de sangre de 10 mL.
   4. Para lograr una concentración de calcio de 5 mM en sangre, agregue 50 μL de solución de CaCl₂ 1 M a la muestra de sangre de 10 mL. Mientras dispensa, gire la punta de la pipeta para distribuir el CaCl₂ en un área más amplia.
   5. Inmediatamente, invierta el tubo 10 veces, enróllelo horizontalmente (sobre una superficie plana o entre las palmas de las manos) y luego invierta 10 veces más para asegurar una mezcla completa.
   6. Mida el ACT utilizando un sistema de coagulación de sangre entera en el punto de atención siguiendo las instrucciones del fabricante. El ACT inicial suele oscilar entre 400 y 500 s.
   7. Mientras mantiene constante la concentración de heparina, aumente la concentración de CaCl₂ (a aproximadamente 7-8 mM) para lograr un ACT de 300 s.
   8. Verifique la concentración final y el ACT resultante en un tubo de sangre separado.

4. Procedimientos previos a la prueba

NOTA: Todos los pasos descritos en esta sección se aplican a las Secciones 5 y 6. Realice estos pasos antes de operar la bomba con albúmina sérica bovina (BSA) o sangre en el asa. Transfiera sangre entre vasos mediante alimentación por gravedad para minimizar el estrés mecánico. Evite usar el émbolo de la jeringa para impulsar la sangre, ya que esto puede crear una presión excesiva. Además, evite estrangular la sangre a través de aberturas estrechas para evitar daños a los componentes celulares.

1. Llenado y vaciado del bucle de prueba
   1. Conecte una línea de extensión de 30 pulgadas al puerto de inyección y conecte un cilindro de jeringa de 60 ml como embudo. Abra la llave de paso del depósito para que actúe como ventilación de aire.
   2. Vierta líquido en el embudo, elevándolo según sea necesario para acelerar el limado. Llene el bucle hasta 1-2 cm por debajo de la rejilla de ventilación en la parte superior de la bolsa. Cierre la ventilación de aire y las llaves de paso del puerto de inyección.
   3. Para drenar, abra la ventilación de aire y las llaves de paso del puerto de inyección y baje el embudo por debajo del nivel del banco. Eleve la bomba por encima del puerto de drenaje para evacuar el líquido restante.
2. Desaireación del bucle de prueba
   NOTA: Realice este procedimiento cuando llene el circuito con BSA o sangre antes de encender la bomba.
   1. Asegúrese de que no haya aire atrapado en ninguna parte del circuito. Desaloje las burbujas de aire en las superficies golpeando y apretando suavemente el tubo y el depósito.
   2. Si está evaluando una bomba de sangre de flujo axial, gírela a una posición vertical para liberar el aire a través de la flotabilidad. Si usa una bomba centrífuga, gírela boca abajo y gírela para asegurarse de que no quede aire atrapado en las rutas de flujo secundarias.
   3. Inspeccione de cerca las secciones horizontales de la tubería y las uniones entre la tubería y los conectores para asegurarse de que no haya burbujas de aire.
   4. Apriete la bolsa intravenosa para acercar el nivel del líquido a la parte estrecha superior y sujete la bolsa con un hemostático a través de la línea del fluido para eliminar la interfaz fluido-aire. Cierre la llave de paso de ventilación.
3. Cebado de las líneas de presión y el puerto de muestreo
   1. Cierre la llave de paso al final de las líneas de presión, retire el tubo del manómetro y conecte una jeringa de 3 ml. Abra la llave de paso y extraiga 1-2 ml de líquido en la línea de extensión (aproximadamente 4 cm).
   2. Cierre la llave de paso, separe la jeringa y vuelva a conectar el tubo del manómetro. Abra la llave de paso para habilitar las lecturas de presión.
   3. Prepare el puerto de muestreo con una jeringa.
4. Limpieza de los puertos de inyección y muestreo
   1. Corta o rasga una toallita sin pelusa en tres fragmentos iguales. Gira la esquina de un fragmento para formar una punta e insértala en el puerto para absorber la sangre residual.
   2. Retuerce el segundo fragmento, humedécelo con solución salina e inserta la punta húmeda en el puerto. Gíralo alrededor del puerto para eliminar toda la sangre restante.
   3. Utilice el tercer fragmento para absorber cualquier solución salina residual en el puerto.
      NOTA: Realice este procedimiento de limpieza inmediatamente después de extraer una muestra de sangre o siempre que haya sangre residual en los puertos.

5. Pasivar las superficies en contacto con la sangre

1. Llene el circuito con una solución de BSA al 1% y opere el VAD para que circule durante al menos 30 minutos.
2. Inspeccione el circuito en busca de fugas y vuelva a montarlo si es necesario.
3. Drene completamente la solución de BSA para evitar la hemodilución.

6. Pruebas de trombosis

1. Prepare el bucle de prueba.
   1. Llene el asa con 150 ml de sangre.
   2. Desairee el circuito y cebe las líneas de presión y el puerto de muestreo como se describe en los pasos 4.2-4.4.
   3. Encienda la bomba a baja velocidad y hágala funcionar durante unos 5 segundos para desalojar las burbujas de aire atrapadas dentro de la bomba, luego detenga la bomba.
   4. Si aparecen burbujas en la bolsa, repita el paso 4.2 para volver a realizar la desaireación.
   5. Reinicie la bomba a baja velocidad para que la sangre circule por el circuito.
2. Agregue heparina a la sangre en el asa.
   1. Transfiera 1 mL de heparina sódica (1000 U/mL) y 1,5 mL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 0,5 M) del empaque del fabricante a tubos separados para facilitar su manejo durante la prueba.
   2. Utilice el puerto transversal de la llave de paso de 3 vías para administrar sustancias en el bucle con una jeringa. Gire el bloqueo luer macho en la llave de paso de modo que el puerto de inyección mire hacia arriba para atrapar las burbujas de aire en la parte superior.
   3. Logre una concentración de heparina de 0.5 U/mL en el asa agregando 75 U de heparina sódica a 150 mL de sangre. Aspire 75 U de heparina (75 μL si se utiliza una concentración de 1000 U/mL) en una micropipeta y dispense en una jeringa de 3 mL dispensando simultáneamente la pipeta y extrayendo el émbolo de la jeringa. Asegúrese de que todo el líquido se transfiera sin derramarse.
   4. Conecte la jeringa al puerto de inyección a través del bloqueo luer, con el puerto hacia arriba y la punta de la jeringa apuntando verticalmente hacia abajo. Extraiga el émbolo de la jeringa para llenarlo con sangre y mezcle la heparina con la sangre mientras aspira el aire en la jeringa. Permita que la burbuja de aire suba a la parte superior de la jeringa. Inyecte la mezcla en el asa, asegurándose de que no entre aire.
   5. Transfiera la sangre dentro y fuera de la jeringa 4-5 veces para asegurarse de que la sangre heparinizada no quede confinada al espacio en el puerto. Asegúrese de que no entre aire en el circuito.
3. Titula el ACT de sangre en el bucle.
   1. Logre una concentración inicial de calcio de 5 mM en el asa agregando 750 μL de solución de CaCl₂ 1 M a 150 mL de sangre utilizando el mismo procedimiento que la heparina.
      1. La sangre expuesta a altas concentraciones de calcio puede comenzar a coagularse en la jeringa. Inyecte rápidamente el líquido después de eliminar el aire residual. Opcionalmente, diluya el CaCl₂ en la jeringa con 1 ml de solución salina tamponada con TRIS para reducir el riesgo de coagulación prematura.
   2. Deje que el CaCl₂ inyectado circule en el asa durante al menos 2 minutos antes de extraer una muestra de sangre para medir el TCA inicial.
   3. Conecte una jeringa de 1 ml al puerto de muestreo. Extraiga y deseche 0,5 ml de sangre residual para eliminar la sangre estancada del puerto.
   4. Coloque una nueva jeringa de 1 mL, extraiga 0,5 mL de sangre para su análisis y mida el ACT. Limpie el puerto de muestreo siguiendo el procedimiento del paso 4.4.
   5. Consulte los valores de valoración en el paso 3.2 para informar la concentración objetivo de CaCl₂ . Aumente gradualmente la concentración de calcio para lograr un ACT de 300 s. Evite agregar la cantidad total de CaCl₂ de una sola vez para evitar la coagulación rápida.
      NOTA: En las pruebas utilizadas en este estudio, la concentración inicial de calcio de 5 mM resultó en un ACT de 450 ± 50 s, y la concentración final de 7-8 mM produjo un ACT de 300 ± 20 s. Si bien esta respuesta puede variar, trate de llevar el ACT a 300 s o menos para el inicio de la prueba.
4. Comienza la prueba.
   1. Una vez que se logra el ACT de 300 s en el bucle, comience la prueba de 1 h. Ajuste la bomba al caudal y la presión deseados modificando la velocidad del rotor y regulando la resistencia con la abrazadera Hoffman.
   2. Mida el ACT cada 15 minutos siguiendo los pasos 6.3.3-6.3.4.
   3. Si el ACT cae por debajo de 200 s, inyecte 25 U adicionales de heparina sódica en el asa.
5. Finaliza la prueba.
   1. Al final de 1 h, inyecte EDTA en el asa para inhibir la coagulación adicional, apuntando a una concentración final de 5 mM en sangre. (Inyecte 1,5 mL si usa una solución de EDTA de 0,5 M).
   2. Deje que el EDTA circule y mezcle durante 2 minutos, luego detenga la bomba.
6. Desconecte y enjuague la bomba.
   1. Sujete el tubo conectado a la entrada y salida de la bomba mediante hemostáticos, colocando las abrazaderas a 3-4 cm de distancia de las lengüetas de entrada y salida.
   2. Desconecte con cuidado el tubo para liberar la bomba.
   3. Drene la sangre de la bomba y fluya en un recipiente.
   4. Lave la sangre residual de la bomba mediante alimentación por gravedad o pipeteo con solución salina a través de la entrada y salida de la bomba.
      NOTA: Los pasos 6.7 y 6.8 se realizan simultáneamente.
7. Inspeccione la trayectoria del flujo de la bomba.
   1. Capture imágenes de la entrada y salida de la bomba utilizando una cámara de endoscopio/boroscopio.
   2. Desmonte la bomba (si corresponde). Lave los componentes en un baño de solución salina e inspeccione si hay trombos con un endoscopio de disección o una lente macro.
   3. Fotografíe las superficies en contacto con la sangre para documentarlas.
      NOTA: La inspección constante y la documentación exhaustiva son fundamentales para las pruebas comparativas.
8. Filtra la sangre usada.
   1. Corta un trozo de tela de malla de nailon de 100 μm lo suficientemente grande como para cubrir la abertura de un contenedor de captura.
   2. Coloque la malla sobre el recipiente con una ligera cortina para permitir que la sangre fluya a través de él de manera efectiva. Asegure los bordes de la malla para evitar que se deslice durante la filtración.
   3. Pase la sangre usada a través de la malla de nylon. Deseche la sangre de acuerdo con las pautas de manejo de desechos biológicos de la institución.
   4. Examine la malla en busca de trombos capturados y documente los hallazgos.
9. Prepárese para el análisis histológico.
   1. Si se planea un análisis histológico, fije los trombos encontrados en la solución de formalina siguiendo los procedimientos de seguridad adecuados.
      PRECAUCIÓN: Utilice siempre una campana extractora cuando manipule formaldehído.

7. Procedimiento de limpieza

1. Desmonte el circuito de flujo. Deseche la bolsa de sangre de PVC y el tubo.
2. Remoje todos los demás componentes que entran en contacto con la sangre (conectores, llaves de paso, cerraduras luer, etc.) en una solución de detergente en polvo con 1% de enzimas activas durante la noche. Enjuague con agua tibia del grifo, seguida de agua desionizada y seque al aire.
   1. Si quedan coágulos, sonicate los componentes en la solución de detergente. Enjuague bien y seque al aire.
3. Limpie la bomba.
   1. Si la bomba se puede desmontar, remoje y sonique los componentes en contacto con la sangre con una solución limpiadora/desengrasante multiusos al 1%, seguida de una solución de detergente en polvo con actividad enzimática al 1%.
   2. Si la bomba no se puede desmontar, conéctela a un nuevo circuito de flujo lleno de soluciones de limpieza y hágala funcionar a alta velocidad durante al menos 30 minutos. Repita según sea necesario.
4. Enjuague bien la bomba con agua tibia del grifo, seguida de agua desionizada, y seque al aire.

Resultados

La ejecución exitosa de este protocolo permite la identificación de áreas localizadas de deposición de plaquetas, revelando puntos problemáticos dentro de la trayectoria de flujo de la bomba. La aplicación coherente de este protocolo permite mejoras incrementales al abordar estos "puntos críticos" identificados.

Por ejemplo, durante el desarrollo del PediaFlow PF5 VAD, nos encontramos con desafíos para pulir manualmente el lado de presión de las palet...

Discusión

El primer ensayo en humanos de una nueva bomba es siempre una tarea precaria, ya que los estudios preclínicos no pueden predecir de forma fiable la trombogenicidad de los VAD en humanos²⁶. En particular, algunos VADs que demostraron estar libres de trombosis en ensayos con animales han exhibido posteriormente una trombogenicidad significativa en el uso clínico³⁶. Un régimen agresivo de pruebas in vitro diseñado específicamente...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr