In Vitro Ventriküler Destek Cihazları için Tromboz Testi

Özet

Devridaim test platformu içinde ventriküler destek cihazlarında (VAD) trombozu indüklemek için bir tezgah üstü protokol sunuyoruz. Bu yöntem, kan akış yolundaki trombojenik sıcak noktaları belirlemeye hizmet eder ve hayvan modellerinde klinik öncesi testlerden önce trombodirencin iyileştirilmesine yardımcı olabilir.

Özet

Tromboz riski, ventriküler destek cihazlarının (VAD'ler) geliştirilmesinde ve klinik kullanımında önemli bir endişe kaynağı olmaya devam etmektedir. VAD trombojenisitesinin geleneksel değerlendirmeleri, öncelikle hayvan çalışmaları yoluyla, maliyetli ve zaman alıcıdır, etik kaygıları artırır ve sonuçta insan sonuçlarını doğru bir şekilde yansıtmayabilir. Bu sınırlamaları ele almak için, trombozu provoke etmek ve kan akış yolundaki potansiyel yüksek riskli alanları belirlemek için tasarlanmış agresif bir in vitro test protokolü geliştirdik. Maruyama ve ark.'nın çalışmaları tarafından motive edilen bu protokol, modifiye edilmiş bir antikoagülasyon stratejisi kullanır ve hazır bileşenleri kullanır, bu da onu VAD'lerin in vitro kan testini yapan çoğu laboratuvar için erişilebilir hale getirir. Bu yöntemin faydasını, minyatür manyetik olarak havaya kaldırılmış bir pediatrik VAD'nin (PediaFlow PF5) yinelemeli testi ve iyileştirilmesi yoluyla gösterdik. Yöntem, erken VAD prototiplerindeki tasarım ve üretim kusurlarının neden olduğu trombojenik sıcak noktaların belirlenmesinde etkili olmuş ve hayvan çalışmalarına geçmeden önce hedeflenen iyileştirmeleri mümkün kılmıştır. Pulsatil akışın olmaması ve donör kan özelliklerinin etkisi de dahil olmak üzere sınırlamalarına rağmen, bu protokol erken evre VAD gelişimi ve risk azaltma için pratik bir araç olarak hizmet eder.

Giriş

Ventriküler destek cihazları (VAD'ler) ileri kalp yetmezliği olan hastaların tedavisinde bir bakım standardı haline gelmiştir, ancak tromboz ve inme riski önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir ^1,2. VAD'ler içindeki tromboz tipik olarak, değerli olmakla birlikte, önemli maliyetler ve lojistik zorluklar sunan klinik öncesi hayvan çalışmaları sırasında değerlendirilir. Bu çalışmalar kaynak yoğundur, zaman alıcıdır ve tüm testi tehlikeye atan ve ek denemeler gerektiren tek bir kusura karşı hassastır. Bu sadece mali yükü artırmakla kalmaz, aynı zamanda tekrarlanan hayvan testlerine duyulan ihtiyaç nedeniyle etik kaygıları da gündeme getirir.

Trombosit birikimini ve trombozu tahmin etmek için birçok sayısal model olmasına rağmen 3,4,5,6, ^{VAD 7,8,9} gibi makro ölçekli cihazlarda trombüs oluşumunu simüle etmek için sadece birkaçı uygundur. Dahası, mevcut modeller kaçınılmaz olarak idealize edilmiş yüzeyler ve basitleştirilmiş "su geçirmez" geometriler varsayar ve bu da gerçek dünyadaki pompa tertibatlarının karmaşıklıklarını ve kusurlarını doğru bir şekilde yansıtmaz. Trombosit-yüzey etkileşimleri göz önüne alındığında, bu makro ölçekli modeller genellikle tek tip olarak öngörülen malzeme özelliklerini kullanır (tipik olarak yüzey-akı sınır koşullarında bir katsayı olarak modellenir)10,11,12. Sonuç olarak, sayısal modeller kanla yapılan deneysel testlerin yerini tamamen alamaz.

Hem malzeme seçimi hem de yüzey kalitesi, VAD^{yüzeylerine trombosit} yapışmasında kritik rol oynar 13,14,15,16,17. Pürüzlü noktalar veya düzensizlikler gibi kusurlar trombosit yapışmasını ve trombüs oluşumunu teşvik edebilir. Ek olarak, akış yolundaki bileşenler arasındaki yarıklar tromboz için bir nidus görevi görebilir ve pıhtıların oluşabileceği ve büyüyebileceği korumalı ortamlar sağlayabilir^18,19. Montaj sırasında gres, yağlayıcı veya sızdırmazlık maddelerinin kullanılması da risk oluşturabilir, çünkü bu maddeler akış yoluna sızabilir ve kanla etkileşime girerek komplikasyon riskini daha da artırabilir.

Bu nedenle, hayvan testlerine veya klinik kullanıma tabi tutulmadan önce VAD'lerin trombodirencini güvenilir bir şekilde değerlendirebilen iyi tanımlanmış bir in vitro test protokolüne ihtiyaç vardır. Hemoliz^20'nin değerlendirilmesi için yaygın olarak kabul edilen bir ASTM standardı olmasına rağmen, klinik olarak ilgili çalışma koşulları²¹ altında VAD'lerin trombojenisite testi için böyle bir standart mevcut değildir. Kan pompaları için in vitro tromboz testinin fizibilitesini gösteren otuz yıl öncesine dayanan ufuk açıcı çalışmalara^rağmen 22,23,24,25, hayvan testleri bugüne kadar trombozu değerlendirmek için fiili uygulama olarak devam etmiştir ²⁶. İn vitro yöntemlerin daha geniş çapta benimsenmesinin önündeki engel, muhtemelen pıhtılaşmanın karmaşık doğası olmuştur ve test sonuçlarını etkileyebilecek çok sayıda kafa karıştırıcı faktör ile içsel pompa trombojenisitesini metodolojik sınırlamalar ve prosedürel hatalar nedeniyle ortaya çıkan artefaktlardan ayırt etmeyi zorlaştırmaktadır.

Bu, deneycilerin tuzaklardan kaçınmaları için bir rehber olarak ayrıntılı bir protokolü paylaşmamızı motive etti, böylece in vitro testlerin kullanımını teşvik etti ve hayvan çalışmalarına olan bağımlılığı azalttı. Maruyama ve ^ark.27'den türetilen burada açıklanan protokol, 5^{. nesil} PediaFlow (PF5) pediatrik VAD 28,29'un tasarımı sırasında rafine edilmiş ve doğrulanmıştır. Bu test yönteminin, hayvan testlerinden önce VAD prototiplerindeki potansiyel trombojenik risklerin sistematik olarak tanımlanmasında ve ele alınmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan küçükbaş hayvan tam kanı ticari bir satıcıdan elde edilmiştir ve bu nedenle Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından bir inceleme gerektirmemiştir.

1. Test akış döngüsünün inşası

NOT: Bu protokolde kullanılan döngü bileşenlerinin ve diğer tüm malzemelerin ayrıntılı bir listesi için Malzeme Tablosuna bakın.

1. İntravenöz (IV) torbayı değiştirin.
   1. Şekil 1'de gösterildiği gibi, hacmini ve şeklini ayarlamak için bir IV torbasını değiştirmek için plastik bir ısı yalıtım malzemesi kullanın.
      NOT: Torbanın şekli havanın alınmasını kolaylaştırır ve torbanın sıvı hattı^30,31 boyunca bir hemostat ile kenetlenmesine izin verir. Sızdırmazlık hattının konumu, toplam 150 mL'lik bir astarlama hacmi elde etmek için VAD'ın ve borunun astarlama hacmine göre seçilir.
   2. Torbanın üst kısmında 4 mm'lik bir kesi yaparak bir havalandırma deliği açın. Kesizyona dikenli bir dişi luer kilidi yerleştirin ve bölgeyi RTV silikon kauçuk yapıştırıcı ile kapatın. Luer kilidine tek yönlü bir musluk takın.
2. Şekil 3'de gösterildiği gibi modifiye edilmiş IV torbası, polivinil klorür (PVC) boru, polikarbonat dikenli konektörler ve 1 ve 1 muslukları kullanarak test döngüsünü monte edin.
3. Basınç manometresini bağlayın.
   1. 6 inçlik uzatma hatlarını giriş ve çıkış tarafındaki basınç bağlantı noktalarına takın. Uzatma hattının diğer ucuna tek yönlü bir musluk takın.
      NOT: Vana, adım 4.3'te açıklandığı gibi, pompayı çalıştırmadan önce uzatma hattını sıvıyla doldurmak için manometre borusunun bağlantısının kesilmesine izin verir.
   2. Her 1/8" iç çaplı (ID) borunun bir ucunu bir manometre dikenine bağlayın ve diğer uca bir erkek luer bağlantı parçası yerleştirin.
   3. Erkek luer bağlantı parçalarını tek yönlü musluklara bağlayın. Basınç okumalarını etkinleştirmek için vanaları açın.
4. Akış hızını ölçmek için kelepçeli bir ultrasonik akış probu uygulayın.
5. Akış direncini düzenlemek için çıkış basınç portunun distaline bir Hoffman kelepçesi yerleştirin.

2. Kalsiyum klorür (CaCl₂) çözeltisinin hazırlanması

1. 1 M'lik bir çözelti hazırlamak için toz haline getirilmiş CaCl_2'yi 1x TRIS tamponlu salin (pH 7.4) içinde çözün. Kalsiyum ve fosfat çözünmeyen bir çökelti oluşturmak üzere reaksiyona girdiğinden fosfat içeren tamponlardan (örneğin, PBS veya DPBS) kaçının.
2. CaCl_2'yi büyük miktarlarda hazırlıyorsanız, çözünmesi ekzotermik bir işlem olduğundan, CaCl₂ tozunu birkaç adımda aşamalı olarak ekleyin.
3. Gerekirse hidroklorik asit (HCl) veya sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak çözeltinin pH'ını 6-8'e titre edin.

3. Kanın hazırlanması

NOT: Bu çalışmada kullanılan küçükbaş kanı, Malzeme Tablosunda listelenen ticari bir satıcıdan elde edilmiştir. Kan, 14 G'lik bir iğne kullanılarak toplandı ve hayvan standart bir tarımsal ayakta durma pozisyonunda tutuldu. Toplama işlemi iğne batırılmasından tamamlanmasına kadar 10-12 dakika sürdü. Kan, 14 kısım CPD ila 86 kısım kan ile antikoagüle edildi (CPD formülasyonu: 26.3 g / L Na-Sitrat, 25.2 g dekstroz, 3 g / L sitrik asit ve deiyonize [DI] suda 2.2 g / L Na Fosfat). Kan torbası, gece boyunca buz paketleri ile yalıtılmış bir kapta sevk edildi ve toplandıktan sonraki 24 saat içinde deney için kullanıldı.

1. Donör kanını kullanım için hazırlayın.
   1. Kanı nazikçe karıştırmak ve oda sıcaklığına (RT) ulaşmasını sağlamak için kan torbasını 15-30 dakika boyunca eğilebilir bir platforma yerleştirin.
   2. Kan transferi için belirlenmiş bir polikarbonat kabın içine manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
   3. Makroagregaları çıkarmak için kanı bir transfüzyon filtresinden behere aktarın. Hücresel bileşenlere zarar vermemek için kanı nazikçe tutun. Serbest düşmeyi önlemek ve hücresel travmayı en aza indirmek için kanı kap duvarları boyunca dökün.
      NOT: Büyük trombüs varsa veya filtre tıkanırsa kanı atın.
   4. Beheri veya kabı manyetik bir karıştırıcı üzerine yerleştirin ve kanın yüzeyi büyük bir girdap oluşturmadan hafifçe dönmeye başlayana kadar hızı ayarlayın. En az 5 dakika sürekli karıştırın.
   5. Değerlerin türler için normal aralıkta olduğundan emin olmak için hematokrit ve trombosit sayısını ölçün.
2. Hedef CaCl₂ konsantrasyonunu belirlemek için titrasyonlar gerçekleştirin.
   NOT: Sitrat kan, pıhtılaşma ve tromboz testini sağlamak için yeniden kalsifiye edilir ve kaçak pıhtılaşmayı önlemek için heparin eklenir. Testin başlangıcı için hedef aktif pıhtılaşma süresi (ACT) 300 saniyedir. Bu bölümde verilen referans ACT değerlerinin donör koyun kanı kullanılarak elde edildiğini ve türe ve toplama sırasında kullanılan antikoagülasyon seviyesine bağlı olarak değişebileceğini lütfen unutmayın. Ek olarak, ACT ölçümleri ^32,33,34 cihazları arasında değişebilir. Belirli bir laboratuvar kurulumu için en uygun ACT aralığını belirlemek için biraz deneme yanılma gerekebilir.
   1. Stok çözeltilerinin kontaminasyonunu önlemek için hazırlanan 1 M CaCl₂ çözeltisinin 2 mL'sini ve 0.5 mL heparin sodyumunu (1000 U / mL) üreticinin ambalajından mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
   2. 10 mL kanı 14 mL polipropilen test tüplerine aktarın. Bu tür dört tüp hazırlayın.
   3. Kanda 0.5 U / mL heparin konsantrasyonu elde etmek için, 10 mL kan örneğine 5 μL heparin sodyum ekleyin.
   4. Kanda 5 mM'lik bir kalsiyum konsantrasyonu elde etmek için, 10 mL kan örneğine 50 μL 1 M CaCl₂ çözeltisi ekleyin. Dağıtım sırasında, CaCl_2'yi daha geniş bir alana dağıtmak için pipet ucunu döndürün.
   5. Tüpü hemen 10 kez ters çevirin, yatay olarak yuvarlayın (düz bir yüzeyde veya avuç içi arasında), ardından iyice karıştırmayı sağlamak için 10 kez daha ters çevirin.
   6. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir bakım noktası tam kan pıhtılaşma sistemi kullanarak ACT'yi ölçün. İlk ACT tipik olarak 400-500 s arasında değişecektir.
   7. Heparin konsantrasyonunu sabit tutarken, 300 s'lik bir ACT elde etmek için CaCl₂ konsantrasyonunu (yaklaşık 7-8 mM'ye) artırın.
   8. Son konsantrasyonu ve elde edilen ACT'yi ayrı bir kan tüpünde doğrulayın.

4. Test öncesi prosedürler

NOT: Bu bölümde açıklanan tüm adımlar Bölüm 5 ve 6 için geçerlidir. Pompayı döngüde sığır serumu, albümin (BSA) veya kan ile çalıştırmadan önce bu adımları gerçekleştirin. Mekanik stresi en aza indirmek için yerçekimi beslemesini kullanarak damarlar arasında kan aktarın. Aşırı basınç oluşturabileceğinden, kanı sürmek için şırınga pistonunu kullanmaktan kaçının. Ek olarak, hücresel bileşenlere zarar vermemek için dar açıklıklardan kanı boğmaktan kaçının.

1. Test döngüsünün doldurulması ve boşaltılması
   1. Enjeksiyon portuna 30 inçlik bir uzatma hattı takın ve 60 mL'lik bir şırınga namlusunu huni olarak bağlayın. Havalandırma deliği görevi görmesi için rezervuar vanasını açın.
   2. Sıvıyı huniye dökün ve dosyalamayı hızlandırmak için gerektiği kadar yükseltin. Halkayı, torbanın üst kısmındaki havalandırma deliğinin 1-2 cm altına kadar doldurun. Havalandırma deliğini ve enjeksiyon portu musluklarını kapatın.
   3. Boşaltmak için havalandırma deliğini ve enjeksiyon portu musluklarını açın ve huniyi tezgah seviyesinin altına indirin. Kalan sıvıyı boşaltmak için pompayı drenaj portunun üzerine kaldırın.
2. Test döngüsünün havasının boşaltılması
   NOT: Pompayı çalıştırmadan önce döngüyü BSA veya kanla doldururken bu prosedürü gerçekleştirin.
   1. Döngünün herhangi bir yerinde hava sıkışmadığından emin olun. Boruya ve rezervuara hafifçe vurarak ve sıkarak yüzeylerdeki hava kabarcıklarını çıkarın.
   2. Eksenel akışlı bir kan pompasını değerlendiriyorsanız, kaldırma kuvveti yoluyla herhangi bir havayı serbest bırakmak için dikey konuma döndürün. Santrifüj pompa kullanıyorsanız, ikincil akış yollarında hava sıkışmadığından emin olmak için ters çevirin ve döndürün.
   3. Hava kabarcığı olmadığından emin olmak için borunun yatay bölümlerini ve boru ile konektörler arasındaki bağlantıları yakından inceleyin.
   4. Sıvı seviyesini üst dar kısma yaklaştırmak için IV torbasını sıkın ve sıvı-hava arayüzünü ortadan kaldırmak için torbayı sıvı hattı boyunca bir hemostat ile sıkıştırın. Havalandırma vanasını kapatın.
3. Basınç hatlarının ve numune alma portunun doldurulması
   1. Basınç hatlarının sonundaki vanayı kapatın, manometre hortumunu çıkarın ve 3 mL'lik bir şırınga takın. Vanayı açın ve uzatma hattına (yaklaşık 4 cm) 1-2 mL sıvı çekin.
   2. Vanayı kapatın, şırıngayı çıkarın ve manometre borusunu yeniden bağlayın. Basınç okumalarını etkinleştirmek için vanayı açın.
   3. Örnekleme portunu bir şırınga kullanarak astarlayın.
4. Enjeksiyon ve numune alma portlarının temizlenmesi
   1. Tüy bırakmayan bir mendili üç eşit parçaya kesin veya yırtın. Bir parçanın köşesini bir uç oluşturacak şekilde bükün ve kalan kanı emmek için porta yerleştirin.
   2. İkinci parçayı bükün, tuzlu suyla nemlendirin ve ıslak ucu porta yerleştirin. Kalan tüm kanı çıkarmak için portun etrafında çevirin.
   3. Limanda kalan tuzlu suyu emmek için üçüncü parçayı kullanın.
      NOT: Bu temizleme prosedürünü bir kan örneği çektikten hemen sonra veya portlarda artık kan olduğunda gerçekleştirin.

5. Kanla temas eden yüzeylerin pasifleştirilmesi

1. Döngüyü %1 BSA solüsyonu ile doldurun ve VAD'yi en az 30 dakika dolaştırmak için çalıştırın.
2. Döngüde sızıntı olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse yeniden monte edin.
3. Hemodilüsyonu önlemek için BSA çözeltisini tamamen boşaltın.

6. Tromboz testi

1. Test döngüsünü hazırlayın.
   1. Döngüyü 150 mL kanla doldurun.
   2. Döngüyü havadan alın ve basınç hatlarını ve s'yi doldurunamp4.2-4.4 adımlarında açıklandığı gibi port.
   3. Pompayı düşük bir hızda çalıştırın ve pompa içinde sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için yaklaşık 5 saniye çalıştırın, ardından pompayı durdurun.
   4. Torbada herhangi bir kabarcık oluşursa, hava alma işlemini tekrar gerçekleştirmek için adım 4.2'yi tekrarlayın.
   5. Döngüdeki kanı dolaştırmak için pompayı düşük bir hızda yeniden başlatın.
2. Döngüdeki kana heparin ekleyin.
   1. Test sırasında kullanım kolaylığı için 1 mL heparin sodyum (1000 U/mL) ve 1.5 mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA; 0.5 M) üreticinin ambalajından ayrı tüplere aktarın.
   2. Bir şırınga kullanarak maddeleri döngüye uygulamak için 3 musluğun enine portunu kullanın. Musluk üzerindeki erkek luer kilidini, üstteki hava kabarcıklarını yakalamak için enjeksiyon portu yukarı bakacak şekilde çevirin.
   3. 150 mL kana 75 U heparin sodyum ekleyerek döngüde 0.5 U / mL'lik bir heparin konsantrasyonu elde edin. 75 U heparini (1000 U / mL konsantrasyon kullanılıyorsa 75 μL) bir mikropipete aspire edin ve aynı anda pipeti dağıtarak ve şırınga pistonunu çekerek 3 mL'lik bir şırıngaya dağıtın. Tüm sıvının dökülmeden aktarıldığından emin olun.
   4. Şırıngayı, port yukarı bakacak ve şırınga ucu dikey olarak aşağı bakacak şekilde, luer kilidi aracılığıyla enjeksiyon portuna takın. Şırınga pistonunu kanla doldurmak için çekin ve şırıngaya herhangi bir hava aspire ederken heparini kanla karıştırın. Hava kabarcığının şırınganın üstüne yükselmesine izin verin. Karışımı ilmeğin içine enjekte edin ve hava girmediğinden emin olun.
   5. Heparinize kanın porttaki boşlukla sınırlı kalmamasını sağlamak için şırınganın içine ve dışına 4-5 kez kan akıtın. Döngüye hava girmediğinden emin olun.
3. Döngüdeki kanın ACT'sini titre edin.
   1. Heparin ile aynı prosedürü kullanarak 150 mL kana 750 μL 1 M CaCl₂ çözeltisi ekleyerek döngüde 5 mM'lik bir başlangıç kalsiyum konsantrasyonu elde edin.
      1. Yüksek kalsiyum konsantrasyonlarına maruz kalan kan, şırıngada pıhtılaşmaya başlayabilir. Kalan havayı çıkardıktan sonra sıvıyı hızlı bir şekilde enjekte edin. İsteğe bağlı olarak, erken pıhtılaşma riskini azaltmak için şırıngadaki CaCl_2'yi 1 ml TRIS tamponlu salin ile seyreltin.
   2. İlk ACT'yi ölçmek için bir kan örneği almadan önce enjekte edilen CaCl_2'nin en az 2 dakika döngüde dolaşmasına izin verin.
   3. Örnekleme portuna 1 mL'lik bir şırınga takın. Durgun kanı porttan temizlemek için 0,5 mL atık kan çekin ve atın.
   4. Yeni bir 1 mL şırınga takın, analiz için 0,5 mL kan alın ve ACT'yi ölçün. Adım 4.4'teki prosedürü kullanarak örnekleme portunu temizleyin.
   5. Hedef CaCl₂ konsantrasyonunu bildirmek için adım 3.2'deki titrasyon değerlerine bakın. 300 s'lik bir ACT elde etmek için kalsiyum konsantrasyonunu kademeli olarak artırın. Hızlı pıhtılaşmayı önlemek için CaCl_2'nin tamamını bir kerede eklemekten kaçının.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan testte, 5 mM'lik başlangıç kalsiyum konsantrasyonu 450 ± 50 s'lik ACT ile sonuçlandı ve 7-8 mM'lik nihai konsantrasyon 300 ± 20 s'lik ACT verdi. Bu yanıt değişebilse de, testin başlangıcı için ACT'yi 300 s'ye veya altına getirmeyi hedefleyin.
4. Testi başlatın.
   1. Döngüde 300 s'lik ACT elde edildiğinde, 1 saatlik teste başlayın. Rotor hızını değiştirerek ve Hoffman kelepçesini kullanarak direnci düzenleyerek pompayı istenen akış hızına ve basınca ayarlayın.
   2. 6.3.3-6.3.4 adımlarını izleyerek ACT'yi her 15 dakikada bir ölçün.
   3. ACT 200 s'nin altına düşerse, döngüye 25 U daha heparin sodyum enjekte edin.
5. Testi sonlandırın.
   1. 1 saatin sonunda, daha fazla pıhtılaşmayı önlemek için döngüye EDTA enjekte edin ve kanda 5 mM'lik bir nihai konsantrasyonu hedefleyin. (0,5 M EDTA çözeltisi kullanıyorsanız 1,5 mL enjekte edin.)
   2. EDTA'nın dolaşmasına ve 2 dakika karışmasına izin verin, ardından pompayı durdurun.
6. Pompanın bağlantısını kesin ve yıkayın.
   1. Pompa girişine ve çıkışına bağlı boruyu kanama durdurucular kullanarak kelepçeleyin, kelepçeleri giriş ve çıkış dikenlerinden 3-4 cm uzağa yerleştirin.
   2. Pompayı serbest bırakmak için boruyu dikkatlice ayırın.
   3. Kanı pompadan boşaltın ve döngüyü bir kaba akıtın.
   4. Pompada kalan kanı, pompa giriş ve çıkışından yerçekimi ile besleyerek veya tuzlu su pipetleyerek yıkayın.
      NOT: Adım 6.7 ve 6.8 aynı anda gerçekleştirilir.
7. Pompa akış yolunu kontrol edin.
   1. Bir endoskop / boreskop kamera kullanarak pompa giriş ve çıkışının görüntülerini yakalayın.
   2. Pompayı sökün (varsa). Bileşenleri tuzlu su banyosunda yıkayın ve bir diseksiyon dürbünü veya makro lens kullanarak trombüs olup olmadığını kontrol edin.
   3. Dokümantasyon için kanla temas eden yüzeylerin fotoğrafını çekin.
      NOT: Tutarlı inceleme ve kapsamlı dokümantasyon, karşılaştırmalı testler için kritik öneme sahiptir.
8. Kullanılmış kanı süzün.
   1. Bir toplama kabının açıklığını kaplayacak kadar büyük 100 μm'lik bir naylon örgü kumaş parçası kesin.
   2. Kanın içinden etkili bir şekilde akmasına izin vermek için ağı hafif bir örtü ile kabın üzerine yerleştirin. Filtreleme sırasında kaymasını önlemek için ağın kenarlarını sabitleyin.
   3. Kullanılmış kanı naylon ağdan geçirin. Kanı kurumun biyolojik atık işleme yönergelerine göre atın.
   4. Yakalanan trombüsler için ağı inceleyin ve bulguları belgeleyin.
9. Histolojik analiz için hazırlanın.
   1. Histolojik analiz planlanıyorsa, uygun güvenlik prosedürlerini izleyerek formalin çözeltisinde bulunan herhangi bir trombüsü düzeltin.
      DİKKAT: Formaldehitle çalışırken daima çeker ocak kullanın.

7. Temizleme prosedürü

1. Akış döngüsünü sökün. PVC kan torbasını ve hortumunu atın.
2. Kanla temas eden diğer tüm bileşenleri (konektörler, musluklar, luer kilitleri vb.) gece boyunca %1 enzim aktif toz deterjan solüsyonuna batırın. Ilık musluk suyuyla, ardından DI suyla durulayın ve havayla kurutun.
   1. Pıhtılar kalırsa, deterjan çözeltisindeki bileşenleri sonikleştirin. İyice durulayın ve havayla kurulayın.
3. Pompayı temizleyin.
   1. Pompa demonte edilebiliyorsa, kanla temas eden bileşenleri %1'lik çok amaçlı bir temizleyici/yağ çözücü solüsyonu, ardından %1'lik bir enzim aktif toz deterjan solüsyonu ile ıslatın ve sonikleştirin.
   2. Pompa demonte edilemiyorsa, temizleme solüsyonlarıyla dolu yeni bir akış döngüsüne bağlayın ve en az 30 dakika yüksek hızda çalıştırın. Gerektiği kadar tekrarlayın.
4. Pompayı ılık musluk suyuyla, ardından DI suyla iyice durulayın ve havayla kurutun.

Sonuçlar

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, trombosit birikiminin lokalize alanlarının tanımlanmasını sağlayarak pompanın akış yolundaki sorunlu noktaları ortaya çıkarır. Bu protokolün tutarlı bir şekilde uygulanması, tanımlanan bu "sıcak noktaları" ele alarak artımlı iyileştirmelere izin verir.

Örneğin, PediaFlow PF5 VAD'nin geliştirilmesi sırasında, bileşenlerin minyatür boyutu nedeniyle stator kanatlarının basınç ...

Tartışmalar

Yeni bir pompanın ilk insan denemesi her zaman tehlikeli bir çabadır, çünkü klinik öncesi çalışmalar insanlarda VAD'lerin trombojenisitesini güvenilir bir şekilde tahmin edemez²⁶. Özellikle, hayvan deneylerinde trombozdan kurtulma özgürlüğü gösteren bazı VAD'ler daha sonra klinik kullanımda önemli trombojenisite sergilemiştir³⁶. Trombozu provoke etmek için özel olarak tasarlanmış agresif bir in vitro test...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr