インビトロ 補助人工心臓の血栓症検査

要約

再循環試験プラットフォーム内の補助人工心臓(VAD)で血栓症を誘発するためのベンチトッププロトコルを提示します。この方法は、血流経路の血栓形成ホットスポットを特定するのに役立ち、動物モデルでの前臨床試験に先立って血栓抵抗性を改善するのに役立ちます。

要約

血栓症のリスクは、補助人工心臓(VAD)の開発と臨床使用において依然として大きな懸念事項です。VAD血栓形成性の従来の評価は、主に動物実験を通じて行われ、費用と時間がかかり、倫理的な懸念を引き起こし、最終的にはヒトの転帰を正確に反映していない可能性がある。これらの制限に対処するために、血栓症を誘発し、血流経路内の潜在的な高リスク領域を特定するように設計された積極的な in vitro 試験プロトコルを開発しました。このプロトコルは、丸山らの研究に動機付けられており、修正された抗凝固戦略を採用し、容易に入手可能なコンポーネントを利用しているため、VADの in vitro 血液検査を実施するほとんどの研究室で利用できます。私たちは、小型の磁気浮上型小児VAD(PediaFlow PF5)の反復試験と改良を通じて、この方法の有用性を実証しました。この方法は、初期のVADプロトタイプの設計および製造上の欠陥によって引き起こされる血栓形成ホットスポットを特定するのに効果的であり、動物実験に進む前に的を絞った改善を可能にしました。拍動性の流れの欠如やドナーの血液特性の影響などの制限にもかかわらず、このプロトコルは、初期段階のVAD開発とリスク軽減のための実用的なツールとして機能します。

概要

補助人工心臓(VAD)は、進行性心不全患者の管理における標準治療となっていますが、血栓症や脳卒中のリスクは依然として大きな課題です^1,2。VAD内の血栓症は通常、前臨床動物試験で評価されますが、これは価値がありますが、かなりのコストと物流上の課題があります。これらの研究は、リソースと時間がかかり、1つの欠陥によって試験全体が損なわれ、追加の試験が必要になる可能性があります。これは、経済的な負担を増大させるだけでなく、動物実験を繰り返す必要があるため、倫理的な懸念も生じます。

血小板沈着と血栓症^{を予測する}ための多くの数値モデルが存在する^{が、VADs 7,8,9}のようなマクロスケールのデバイスで血栓形成をシミュレートするのに適したものはごくわずかである。さらに、既存のモデルは必然的に理想的な表面と単純化された「水密」形状を前提としており、実際のポンプアセンブリの複雑さと不完全性を正確に反映していません。血小板-表面相互作用を考慮すると、これらのマクロスケールモデルは、一般に、均一に規定された材料特性(通常は表面-磁束境界条件の係数としてモデル化される)10,11,12を使用する。したがって、数値モデルは血液による実験的試験を完全に置き換えることはできません。

材料の選択と表面仕上げの両方が、VAD表面13,14,15,16,17の血小板接着において重要な役割を果たします。ざらざらした斑点や凹凸などの欠陥は、血小板の付着と血栓形成を促進する可能性があります。さらに、流路内のコンポーネント間の隙間は、血栓症の病巣として機能し、血栓が形成されて成長する可能性のある保護された環境を提供する可能性があります^18,19。組み立て中にグリース、潤滑剤、またはシーラントを使用すると、これらの物質が流路に浸透して血液と相互作用し、合併症のリスクがさらに高まる可能性があるため、リスクをもたらす可能性があります。

したがって、VADが動物実験または臨床使用を受ける前に、VADの血栓抵抗性を確実に評価できる、明確に定義されたin vitro試験プロトコルが必要です。溶血の評価には広く採用されているASTM規格があるが²⁰、臨床的に関連性のある手術条件下でのVADの血栓形成性試験にはそのような規格は存在しない²¹。血液ポンプ22,23,24,25のin vitro血栓症試験の実現可能性を実証する30年前にさかのぼる独創的な研究にもかかわらず、動物実験は今日まで血栓症を評価するための事実上の慣行として存続してきました²⁶。in vitro法の広範な採用の障害は、凝固の複雑な性質である可能性が高く、試験結果に影響を与える可能性のある多数の交絡因子があり、内因性ポンプ血栓形成性と方法論的制限や手続き上のエラーによって生じるアーティファクトを区別することが困難になっています。

これにより、実験家が落とし穴を避けるためのガイドとして詳細なプロトコルを共有するようになり、in vitro試験の使用を促進し、動物実験への依存を軽減することになりました。本明細書に記載のプロトコルは、Maruyamaら²⁷から派生したもので、第^5世代PediaFlow(PF5)小児用VAD28,29の設計中に改良され、検証された。この試験方法は、動物実験に先立ってVADプロトタイプの潜在的な血栓形成リスクを体系的に特定し、対処するのに役立ちました。

プロトコル

この研究で使用されたヒツジの全血は、商業業者から入手したため、コーネル大学の動物管理委員会による審査は必要ありませんでした。

1. テストフローループの構築

注:このプロトコルで使用されるループコンポーネントとその他すべての材料の詳細なリストについては、 材料の表 を参照してください。

1. 静脈内(IV)バッグを変更します。.
   1. プラスチック製のヒートシーラーを使用してIVバッグを改造し、 図1に示すように、その容量と形状を調整します。
      注:バッグの形状は、空気の脱気を容易にし、バッグを流体ライン^30,31を横切って止血器でクランプすることを可能にする。シーリングラインの位置は、VADとチューブのプライミング量に基づいて選択され、合計プライミング量は150mLになります。
   2. バッグの上部に4mmの切込みを入れて、通気孔を導入します。とげのあるメスルアーロックを切開部に挿入し、RTVシリコーンゴム接着剤でサイトをシールします。ルアーロックに一方向ストップコックを取り付けます。
2. 図1に示すように、変更されたIVバッグ、ポリ塩化ビニル(PVC)チューブ、ポリカーボネート製バーブコネクタ、3方向および1方向ストップコックを使用してテストループを組み立てます。
3. 圧力計を接続します。
   1. 6インチの延長線を入口側と出口側の圧力ポートに取り付けます。延長線のもう一方の端に一方向の活栓を取り付けます。
      注意: ストップコックを使用すると、ステップ4.3で説明されているように、ポンプを始動する前に延長ラインを液体でプライミングするために、圧力計チューブを切断できます。
   2. 各1/8インチ内径(ID)チューブの一方の端をマノメーターバーブに接続し、もう一方の端にオスのルアーフィッティングを挿入します。
   3. オスのルアーフィッティングを一方向ストップコックに接続します。ストップコックを開いて、圧力の読み取りを有効にします。
4. クランプオン式超音波フロープローブを当てて、流量を測定します。
5. ホフマンクランプを出口圧力ポートの遠位に配置して、流動抵抗を調整します。

2.塩化カルシウム(CaCl₂)溶液の調製

1. 粉末状CaCl₂ を1x TRIS緩衝生理食塩水(pH 7.4)に溶解し、1 M溶液を調製します。リン酸塩含有緩衝液(PBSやDPBSなど)は、カルシウムとリン酸塩が反応して不溶性沈殿物を形成するため、避けてください。
2. CaCl₂ を大量に調製する場合は、CaCl 2粉末の溶解が発熱プロセスであるため、CaCl₂ 粉末を数ステップで段階的に加えます。
3. 必要に応じて、塩酸(HCl)または水酸化ナトリウム(NaOH)を使用して、溶液のpHを6〜8に滴定します。

3.血液の調製

注:この研究で使用されたヒツジの血液は、 材料表に記載されている商業ベンダーから入手しました。血液は14Gの針を使用して採取され、動物は標準的な農業用立位で拘束されました。採取作業は、針の挿入から完了まで10〜12分かかりました。血液は、14 部の CPD から 86 部の血液 (CPD 製剤: 26.3 g/L クエン酸 Na-Citrate、25.2 g のデキストロース、3 g/L クエン酸、および 2.2 g/L の Na リン酸を脱イオン [DI] 水中に含ませて抗凝固しました)。血液バッグは、アイスパック付きの断熱容器に入れて一晩輸送され、収集から24時間以内に実験に使用されました。

1. ドナーの血液を使用できるように準備します。
   1. 血液バッグを傾斜プラットフォームに15〜30分間置き、血液を穏やかに混合し、室温(RT)に到達させます。
   2. マグネチックスターバーをポリカーボネートビーカーまたは血液移送用に指定された容器に入れます。
   3. 輸血フィルターを介して血液をビーカーに移し、マクロ凝集体を除去します。細胞成分の損傷を防ぐために、血液を優しく扱ってください。容器の壁に沿って血液を注ぎ、自由落下を防ぎ、細胞の外傷を最小限に抑えます。
      注:大きな血栓が存在する場合、またはフィルターが詰まっている場合は、血液を廃棄してください。
   4. ビーカーまたは容器をマグネチックスターラーに置き、血液の表面が大きな渦を形成せずに穏やかに回転し始めるまで速度を調整します。少なくとも5分間連続して攪拌します。
   5. ヘマトクリット値と血小板数を測定して、値が種の正常範囲内にあることを確認します。
2. 滴定を行い、目標CaCl₂ 濃度を決定します。
   注:クエン酸血液は、凝固および血栓症の検査を可能にするために再石灰化され、ヘパリンは暴走凝固を防ぐために添加されます。テスト開始の目標活性化凝固時間(ACT)は300秒です。このセクションで提供される参照ACT値は、ドナーの羊の血液を使用して取得されたものであり、採取中に使用される種や抗凝固剤のレベルによって異なる場合があることに注意してください。さらに、ACT測定は機器間で異なる場合があります^32,33,34。特定のラボのセットアップに最適なACT範囲を確立するには、試行錯誤が必要になる場合があります。
   1. 調製した1 M CaCl₂ 溶液2 mLとヘパリンナトリウム0.5 mL(1000 U / mL)をメーカーのパッケージから微量遠心チューブに移し、ストック溶液の汚染を防ぎます。
   2. 10mLの血液を14mLのポリプロピレン試験管に移します。そのようなチューブを4つ用意します。
   3. 血中のヘパリン濃度を0.5 U/mLにするには、10 mLの血液サンプルに5 μLのヘパリンナトリウムを加えます。
   4. 血液中のカルシウム濃度を5 mMにするには、10 mLの血液サンプルに50 μLの1 M CaCl₂ 溶液を加えます。分注中は、ピペットチップを回転させてCaCl₂ をより広い範囲に分散させます。
   5. すぐに、チューブを10回反転させ、水平(平らな面または手のひらの間)に転がし、さらに10回反転させて完全に混合します。
   6. 製造元の指示に従って、ポイントオブケア全血凝固システムを使用してACTを測定します。初期ACTは通常、400〜500秒の範囲です。
   7. ヘパリン濃度を一定に保ちながら、CaCl₂ 濃度を増加(約7〜8 mM)して、ACTを300秒にします。
   8. 最終濃度と結果として生じるACTを別の血液チューブで確認します。

4. 事前テスト手順

注: このセクションで説明するすべての手順は、セクション 5 と 6 に適用されます。これらの手順は、ウシ血清アルブミン(BSA)またはループ内の血液でポンプを操作する前に実行してください。重力供給を使用して血管間で血液を移動させ、機械的ストレスを最小限に抑えます。シリンジプランジャーを使用して血液を送り込むと、過度の圧力がかかる可能性があるため、避けてください。さらに、細胞成分の損傷を防ぐために、狭い開口部から血液を絞めないでください。

1. テストループの充填と排出
   1. 注入口に30インチの延長ラインを取り付け、60mLシリンジバレルを漏斗として接続します。リザーバーの活栓を開いて、通気孔として機能します。
   2. 漏斗に液体を注ぎ、必要に応じて持ち上げてファイリングをスピードアップします。バッグ上部の通気口から1〜2cm下までループを埋めます。通気口と注入ポートの活栓を閉じます。
   3. 排水するには、通気口と注入ポートの活栓を開き、漏斗をベンチレベルより下に下げます。ポンプを排水口より上に上げて、残りの液体を排出します。
2. テストループのエア解除
   注意: ポンプを開始する前にループをBSAまたは血液で満たす場合は、この手順を実行してください。
   1. ループ内のどこにも空気が溜まっていないことを確認します。チューブとリザーバーを軽くたたいて絞ることにより、表面の気泡を取り除きます。
   2. 軸流血液ポンプを評価する場合は、垂直位置に回転させて、浮力を介して任意の空気を放出します。遠心ポンプを使用する場合は、ポンプを逆さまにして回転させ、二次流路に空気が閉じ込められないようにします。
   3. チューブの水平部分とチューブとコネクタの間の接合部を綿密に検査して、気泡が存在しないことを確認します。
   4. IVバッグを絞って液体レベルを上部の狭い部分に近づけ、液体ラインを横切って止血器でバッグをクランプして、流体と空気の界面を排除します。通気口の活栓を閉じます。
3. 圧力ラインとサンプリングポートの下塗り
   1. 圧力ラインの端にあるストップコックを閉じ、圧力計チューブを取り外し、3mLシリンジを取り付けます。活栓を開き、延長線(約4cm)に1〜2mLの液体を吸い込みます。
   2. ストップコックを閉じ、シリンジを取り外し、圧力計チューブを再度接続します。ストップコックを開いて、圧力の読み取りを有効にします。
   3. シリンジを使用してサンプリングポートをプライミングします。
4. 注入ポートとサンプリングポートのクリーニング
   1. 糸くずの出ないワイプを3等分にカットまたは裂きます。片片の角をひねって先端を作り、ポートに挿入して残留血液を吸収します。
   2. 2番目のフラグメントをひねり、生理食塩水で湿らせ、濡れた先端をポートに挿入します。ポートの周りでひねって、残っているすべての血液を取り除きます。
   3. 3番目のフラグメントを使用して、ポートに残っている生理食塩水を吸収します。
      注意: このクリーニング手順は、採血直後、またはポートに残留血液が存在する場合は必ず実行してください。

5.血液接触面の不動態化

1. ループに1% BSA溶液を充填し、VADを少なくとも30分間循環させるように操作します。
2. ループに漏れがないか検査し、必要に応じて再組み立てします。
3. 血液希釈を避けるために、BSA溶液を完全に排出します。

6.血栓症検査

1. テストループを準備します。
   1. ループに150mLの血液を入れます。
   2. ループの空気を抜き、圧力ラインとサンプリングポートをプライミングします ampステップ4.2-4.4で説明されているように。
   3. ポンプを低速で始動し、約5秒間運転してポンプ内に閉じ込められた気泡を取り除いた後、ポンプを停止します。
   4. バッグに気泡が浮かんでいる場合は、手順4.2を繰り返して、再度空気抜きを行ってください。
   5. ポンプを低速で再起動して、ループ内の血液を循環させます。
2. ループ内の血液にヘパリンを追加します。
   1. 1 mL のヘパリンナトリウム(1000 U/mL)と 1.5 mL のエチレンジアミン四酢酸(EDTA;0.5 M)をメーカーのパッケージから別のチューブに移し、試験中の取り扱いを容易にします。
   2. 3方向活栓の横ポートを使用して、注射器を使用してループに物質を投与します。ストップコックのオス型ルアーロックを回転させて、注入口が上を向くようにして、上部に気泡を閉じ込めます。
   3. 150 mLの血液に75 Uのヘパリンナトリウムを添加することにより、ループで0.5 U/mLのヘパリン濃度を達成します。75 Uのヘパリン(1000 U/mLの濃度を使用する場合は75 μL)をマイクロピペットに吸引し、ピペットの分注とシリンジプランジャーの引き込みを同時に行い、3 mLシリンジに分注します。すべての液体がこぼれないように移動していることを確認します。
   4. シリンジをルアーロックを介して注入ポートに取り付け、ポートを上に向けてシリンジの先端を垂直に下に向けて取り付けます。シリンジプランジャーを引いて血液で満たし、シリンジに空気を吸引しながらヘパリンを血液と混合します。気泡がシリンジの上部まで上昇するのを待ちます。混合物をループに注入し、空気が入らないようにします。
   5. 血液をシリンジに4〜5回出し入れして、ヘパリン化された血液がポートのスペースに閉じ込められないようにします。ループに空気が入らないようにします。
3. ループ内の血液のACTを滴定します。
   1. ヘパリンと同じ手順で、1 M CaCl₂ 溶液750 μLを血液150 mLに加えることで、ループ内のカルシウム濃度を5 mMにすることを目指します。
      1. 高濃度のカルシウムにさらされた血液は、注射器で凝固し始める可能性があります。残留空気を取り除いた後、速やかに液体を注入してください。必要に応じて、シリンジ内のCaCl₂ を1 mLのTRIS緩衝生理食塩水で希釈して、早期凝固のリスクを減らします。
   2. 注入されたCaCl₂ をループ内を少なくとも2分間循環させてから、血液サンプルを採取して初期ACTを測定します。
   3. 1 mLシリンジをサンプリングポートに取り付けます。0.5mLの廃血を採取して廃棄し、ポートから滞留した血液を取り除きます。
   4. 新しい1 mLシリンジを取り付け、分析用に0.5 mLの血液を採取し、ACTを測定します。
   5. ステップ3.2の滴定値を参照して、目標CaCl₂ 濃度をお知らせください。カルシウム濃度を段階的に増やして、300 秒の ACT を達成します。急速な凝固を防ぐために、CaCl₂ の全量を一度に追加することは避けてください。
      注:この研究で使用した試験では、5 mMの初期カルシウム濃度は450 ± 50秒のACTをもたらし、7〜8 mMの最終濃度は300 ± 20秒のACTをもたらしました。この応答は異なる場合がありますが、テストの開始時に ACT を 300 秒以下にすることを目指します。
4. テストを開始します。
   1. ループで 300 秒の ACT が達成されたら、1 時間テストを開始します。ホフマンクランプを使用してローター速度を変更し、抵抗を調整することにより、ポンプを希望の流量と圧力に調整します。
   2. 手順6.3.3〜6.3.4に従って、15分ごとにACTを測定します。
   3. ACTが200秒を下回った場合は、ループに追加の25Uのヘパリンナトリウムを注入します。
5. テストを終了します。
   1. 1時間の終わりに、EDTAをループに注入してさらなる凝固を阻害し、血液中の最終濃度5 mMを目標とします。(0.5 M EDTA溶液を使用する場合は、1.5 mLを注入します。
   2. EDTAを循環させて2分間混合してから、ポンプを停止します。
6. ポンプを取り外して洗い流します。
   1. cl 止血器を使用してポンプの入口と出口に接続されたチューブをcl 、clを配置しますamp 入口と出口のバーブから3〜4cm離れて。
   2. チューブを慎重に外して、ポンプを解放します。
   3. ポンプとフローループから血液を容器に排出します。
   4. ポンプの入口と出口から生理食塩水を重力供給またはピペッティングして、ポンプから残留血液を洗い流します。
      注: 手順 6.7 と 6.8 は同時に実行されます。
7. ポンプの流路を点検します。
   1. 内視鏡/ボアスコープカメラを使用して、ポンプの入口と出口の画像をキャプチャします。
   2. ポンプを分解します(該当する場合)。生理食塩水浴で成分を洗浄し、解剖スコープまたはマクロレンズを使用して血栓を検査します。
   3. 血液に接触する表面を撮影して文書化します。
      注:比較テストには、一貫した検査と徹底的な文書化が重要です。
8. 使用した血液をろ過します。
   1. キャッチコンテナの開口部を覆うのに十分な大きさの100μmのナイロンメッシュ生地をカットします。
   2. メッシュを容器の上に少しドレープして配置し、血液が容器を効果的に流れるようにします。ろ過中にメッシュが滑らないように、メッシュの端を固定します。
   3. 使用した血液をナイロンメッシュに通します。血液は、施設の生物学的廃棄物処理ガイドラインに従って廃棄してください。
   4. メッシュで捕捉された血栓を調べ、結果を文書化します。
9. 組織学的解析の準備をします。
   1. 組織学的分析が計画されている場合は、適切な安全手順に従ってホルマリン溶液に見つかった血栓を固定します。.
      注意: ホルムアルデヒドを取り扱うときは、常にドラフトを使用してください。

7. 清掃手順

1. フローループを分解します。PVC血液バッグとチューブを廃棄します。
2. 他のすべての血液接触成分(コネクター、ストップコック、ルアーロックなど)を1%酵素活性粉末洗剤溶液に一晩浸します。温かい水道水ですすぎ、続いてDI水ですすぎ、風乾します。
   1. 血栓が残っている場合は、洗剤溶液中の成分を超音波処理します。よくすすぎ、風乾します。
3. ポンプを清掃します。
   1. ポンプを分解できる場合は、血液接触成分を1%中力クリーナー/脱脂剤溶液に浸して超音波処理し、続いて1%酵素活性粉末洗剤溶液に浸します。.
   2. ポンプを分解できない場合は、洗浄液を充填した新しいフローループに接続し、ポンプを30分以上高速で運転してください。必要に応じて繰り返します。
4. ポンプを温かい水道水で十分にすすぎ、次にDI水で洗い流し、風乾します。

結果

このプロトコルを成功裏に実行すると、血小板沈着の局所領域を特定でき、ポンプの流路内の問題のあるスポットが明らかになります。このプロトコルを一貫して適用することで、これらの特定された「ホットスポット」に対処することにより、段階的な改善が可能になります。

例えば、PediaFlow PF5 VADの開発中、ステータベーンの圧力側を手作?...

ディスカッション

新しいポンプのファースト・イン・ヒューマン試験は、前臨床試験でヒトのVADの血栓形成性を確実に予測できないため、常に不安定な試みである²⁶。特に、動物実験で血栓症からの自由を実証した一部のVADは、後に臨床使用で有意な血栓形成性を示しました³⁶。血栓症を誘発するために特別に設計された積極的な in vitro 試験?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr