체외(In Vitro ) 심실 보조 장치에 대한 혈전증 검사

요약

우리는 재순환 테스트 플랫폼 내에서 심실 보조 장치(VAD)에서 혈전증을 유도하기 위한 벤치탑 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 혈류 경로에서 혈전성 핫스팟을 식별하는 역할을 하며 동물 모델에서 전임상 테스트에 앞서 혈전 저항성을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.

초록

혈전증의 위험은 심실 보조 장치(VAD)의 개발 및 임상 사용에서 중요한 관심사로 남아 있습니다. 주로 동물 연구를 통한 VAD 혈전원성에 대한 전통적인 평가는 비용과 시간이 많이 들고 윤리적 문제를 야기하며 궁극적으로 인간의 결과를 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 당사는 혈전증을 유발하고 혈류 경로 내에서 잠재적인 고위험 영역을 식별하도록 설계된 공격적인 체외 테스트 프로토콜을 개발했습니다. Maruyama 등의 연구에서 영감을 받은 이 프로토콜은 수정된 항응고 전략을 사용하고 쉽게 구할 수 있는 구성 요소를 활용하여 VAD의 체외 혈액 검사를 수행하는 대부분의 실험실에서 사용할 수 있습니다. 우리는 소형 자기 부상 소아 VAD(PediaFlow PF5)의 반복적인 테스트와 개선을 통해 이 방법의 유용성을 입증했습니다. 이 방법은 초기 VAD 프로토타입의 설계 및 제조 결함으로 인한 혈전성 핫스팟을 식별하는 데 효과적이었으며, 동물 연구로 진행하기 전에 표적 개선을 가능하게 했습니다. 박동성 흐름의 부재 및 헌혈자 혈액 특성의 영향을 포함한 한계에도 불구하고 이 프로토콜은 초기 단계의 VAD 개발 및 위험 완화를 위한 실용적인 도구 역할을 합니다.

서문

심실 보조 장치(VAD)는 진행성 심부전 환자 관리의 표준 치료법이 되었지만, 혈전증과 뇌졸중의 위험은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다 ^1,2. VAD 내 혈전증은 일반적으로 전임상 동물 연구 중에 평가되며, 이는 가치가 있지만 상당한 비용과 물류 문제를 야기합니다. 이러한 연구는 자원 집약적이고 시간이 많이 소요되며 단일 결함으로 인해 전체 테스트가 손상되고 추가 시험이 필요하기 쉽습니다. 이는 재정적 부담을 증가시킬 뿐만 아니라 반복적인 동물 실험의 필요성으로 인해 윤리적 문제를 야기합니다.

혈소판 침착 및 혈전^{증을 예측}하기 위한 많은 수치 모델이 존재하지만3,4,5,6 VAD ^7,8,9와 같은 거시적 장치에서 혈전증 형성을 시뮬레이션하는 데 적합한 모델은 소수에 불과합니다. 더욱이 기존 모델은 불가피하게 이상화된 표면과 단순화된 "방수" 형상을 가정하며, 이는 실제 펌프 어셈블리의 복잡성과 불완전성을 정확하게 반영하지 못합니다. 혈소판-표면 상호 작용을 고려할 때 이러한 거시적 모델은 일반적으로 균일하게 규정된 재료 특성(일반적으로 표면-플럭스 경계 조건에서 계수로 모델링됨)을 사용합니다10,11,12. 따라서 수치 모형은 혈액을 이용한 실험적 검사를 완전히 대체할 수 없습니다.

재료 선택과 표면 마감은 모두 VAD 표면의 혈소판 접착에 중요한 역할을 합니다 13,14,15,16,17. 거친 반점이나 불규칙성과 같은 결점은 혈소판 부착과 혈전 형성을 촉진할 수 있습니다. 또한, 유로의 성분 사이의 틈새는 혈전증의 약질로 작용할 수 있으며, 혈전이 형성되고 성장할 수 있는 보호된 환경을 제공할 수 있습니다^18,19. 조립 중 그리스, 윤활제 또는 실런트를 사용하면 이러한 물질이 유로로 스며들어 혈액과 상호 작용하여 합병증의 위험을 더욱 높일 수 있으므로 위험할 수 있습니다.

따라서 VAD가 동물 실험 또는 임상적 사용을 받기 전에 VAD의 혈전 저항성을 안정적으로 평가할 수 있는 잘 정의된 체외 테스트 프로토콜이 필요합니다. 용혈 평가를 위해 널리 채택된 ASTM 표준이 있지만,²⁰ 임상적으로 관련된 작동 조건 하에서 VAD의 혈전원성 검사에 대해서는 그러한 표준이 존재하지 않습니다²¹. 혈액 펌프를 위한 체외 혈전증 검사의 타당성을 입증하는 30년 전의 독창적인 연구에도 불구하고 ^22,23,24,25 동물 실험은 현재까지 혈전증을 평가하기 위한 사실상의 관행으로 지속되어 왔습니다²⁶. 시험관 내 방법의 광범위한 채택을 가로막는 장애물은 테스트 결과에 영향을 미칠 수 있는 수많은 교란 요인과 함께 응고의 복잡한 특성일 가능성이 높으며, 이로 인해 방법론적 한계 및 절차적 오류로 인해 발생하는 아티팩트와 고유한 펌프 혈전성을 구별하는 것이 어렵기 때문입니다.

이를 통해 실험가들이 함정을 피할 수 있는 지침으로 상세한 프로토콜을 공유하게 되었고, 이에 따라 체외 테스트의 사용을 촉진하고 동물 연구에 대한 의존도를 완화할 수 있었습니다. Maruyama et ^al.27에서 파생된 본 명세서에 기술된 프로토콜은^5세대 PediaFlow(PF5) 소아 VAD^28,29의 설계 과정에서 개선되고 검증되었습니다. 이 테스트 방법은 동물 실험에 앞서 VAD 프로토타입의 잠재적인 혈전 유발 위험을 체계적으로 식별하고 해결하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 양 전혈은 상업용 공급업체에서 얻은 것이므로 코넬 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 검토가 필요하지 않았습니다.

1. 테스트 흐름 루프의 구성

참고: 이 프로토콜에 사용되는 루프 구성 요소 및 기타 모든 재질의 자세한 목록은 재료 표를 참조하십시오.

1. 정맥(IV) 백을 수정합니다.
   1. 플라스틱 히트 씰러를 사용하여 그림 1과 같이 IV 백의 부피와 모양을 조정하도록 수정합니다.
      참고: 백의 모양은 탈airing을 용이하게 하고 백을 유체 라인^30,31을 가로질러 지혈제로 고정할 수 있습니다. 밀봉 라인의 위치는 VAD와 튜브의 프라이밍 부피에 따라 선택되어 총 프라이밍 부피 150mL를 달성합니다.
   2. 가방 상단에 4mm 절개를 만들어 통풍구를 삽입합니다. 절개 부위에 미늘이 있는 암컷 루어 자물쇠를 삽입하고 RTV 실리콘 고무 접착제로 부위를 밀봉합니다. 루어 잠금 장치에 단방향 스톱콕을 부착합니다.
2. 그림 1과 같이 변형된 IV 백, 폴리염화비닐(PVC) 튜브, 폴리카보네이트 철조망 커넥터, 3방향 및 1방향 스톱콕을 사용하여 테스트 루프를 조립합니다.
3. 압력 압력계를 연결합니다.
   1. 6인치 연장선을 입구 및 출구 쪽 압력 포트에 연결합니다. 연장선의 다른 쪽 끝에 단방향 마개를 부착합니다.
      알림: 스톱콕을 사용하면 4.3 단계에서 설명한 대로 펌프를 시작하기 전에 압력계 튜브를 분리하여 연장선에 유체를 프라이밍할 수 있습니다.
   2. 각 1/8" 내경(ID) 튜브의 한쪽 끝을 압력계 미늘에 연결하고 다른 쪽 끝에 수 루어 피팅을 삽입합니다.
   3. 수 루어 피팅을 단방향 스톱콕에 연결합니다. 압력 판독을 활성화하려면 스톱콕을 엽니다.
4. cl을 적용하십시오.amp-온 초음파 유량 프로브를 사용하여 유속을 측정합니다.
5. Hoffman cl을 놓습니다.amp 흐름 저항을 조절하기 위해 출구 압력 포트의 원위부에 놓습니다.

2. 염화칼슘(CaCl₂) 용액의 준비

1. 분말 CaCl₂ 를 1x TRIS 완충 식염수(pH 7.4)에 용해시켜 1M 용액을 준비합니다. 인산염 함유 완충액(예: PBS 또는 DPBS)은 칼슘과 인산염이 반응하여 불용성 침전물을 형성하므로 피하십시오.
2. CaCl₂ 를 대량으로 준비하는 경우, CaCl₂ 분말의 용해는 발열 과정이므로 여러 단계로 점진적으로 첨가하십시오.
3. 필요한 경우 염산(HCl) 또는 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 용액의 pH를 6-8로 적정합니다.

3. 혈액의 준비

참고: 이 연구에 사용된 난혈은 재료 표에 나열된 상업용 공급업체에서 얻었습니다. 혈액은 14-G 바늘을 사용하여 채취했으며, 동물은 표준 농업용 서 있는 자세로 구속되었습니다. 채취 과정은 바늘 삽입에서 완료까지 10-12분이 걸렸습니다. 혈액을 14 부 CPD에서 86 부 혈액 (CPD 제형 : 26.3 g / L Na-Citrate, 25.2 g의 포도당, 3 g / L 시트르산 및 2.2 g / L Na 인산염)으로 항응고시켰다. 혈액 주머니는 얼음 팩이 든 단열 용기에 밤새 배송되었으며 채취 후 24시간 이내에 실험에 사용되었습니다.

1. 사용할 헌혈자의 혈액을 준비합니다.
   1. 혈액 주머니를 틸팅 플랫폼에 15-30분 동안 놓고 혈액을 부드럽게 혼합하고 실온(RT)에 도달하도록 합니다.
   2. 마그네틱 교반 막대를 혈액 전달을 위해 지정된 폴리카보네이트 비커 또는 용기에 넣습니다.
   3. 수혈 필터를 통해 혈액을 비커로 전달하여 거대 응집체를 제거합니다. 세포 구성 요소의 손상을 방지하기 위해 혈액을 부드럽게 다루십시오. 자유 낙하를 방지하고 세포 외상을 최소화하기 위해 용기 벽을 따라 혈액을 붓습니다.
      알림: 큰 혈전이 있거나 필터가 막히면 혈액을 버리십시오.
   4. 비커나 용기를 자기 교반기에 놓고 혈액 표면이 큰 소용돌이를 형성하지 않고 부드럽게 회전하기 시작할 때까지 속도를 조정합니다. 최소 5분 동안 계속 저어줍니다.
   5. 헤마토크릿 및 혈소판 수를 측정하여 값이 종의 정상 범위 내에 있는지 확인합니다.
2. 적정을 수행하여 목표 CaCl₂ 농도를 측정합니다.
   참고: 구연산 혈액은 혈액 응고 및 혈전증 검사를 가능하게 하기 위해 재석회화되며, 폭주하는 응고를 방지하기 위해 헤파린이 첨가됩니다. 테스트 시작을 위한 목표 활성화 응고 시간(ACT)은 300초입니다. 이 섹션에 제공된 참조 ACT 값은 기증자 양의 혈액을 사용하여 얻은 것이며 수집 중에 사용된 항응고제의 종류와 수준에 따라 달라질 수 있습니다. 또한 ACT 측정은 기기 ^32,33,34마다 다를 수 있습니다. 특정 실험실 설정에 대한 최적의 ACT 범위를 설정하기 위해 몇 가지 시행착오가 필요할 수 있습니다.
   1. 원료 용액의 오염을 방지하기 위해 준비된 1M CaCl₂ 용액 2mL와 헤파린 나트륨(1000U/mL) 0.5mL를 제조업체의 포장에서 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 혈액 10mL를 14mL 폴리프로필렌 시험관에 옮깁니다. 그러한 튜브 4개를 준비하십시오.
   3. 혈액 내 헤파린 농도 0.5 U/mL를 달성하려면 10 mL 혈액 샘플에 5 μL의 헤파린 나트륨을 첨가합니다.
   4. 혈액 내 칼슘 농도를 5mM로 달성하려면 10mL 혈액 샘플에 50μL의 1M CaCl₂ 용액을 추가합니다. 분주하는 동안 피펫 팁을 소용돌이쳐 CaCl₂ 를 더 넓은 영역에 분배합니다.
   5. 즉시 튜브를 10회 뒤집고 수평으로(평평한 표면 또는 손바닥 사이) 굴린 다음 10회 더 뒤집어 완전한 혼합을 보장합니다.
   6. 제조업체의 지침에 따라 현장 진료 전혈 응고 시스템을 사용하여 ACT를 측정합니다. 초기 ACT의 범위는 일반적으로 400-500초 사이입니다.
   7. 헤파린 농도를 일정하게 유지하면서 CaCl₂ 농도를 증가시켜(약 7-8mM까지) ACT를 300초로 달성합니다.
   8. 별도의 혈액 튜브에서 최종 농도와 결과 ACT를 확인합니다.

4. 사전 테스트 절차

참고: 이 섹션에 설명된 모든 단계는 섹션 5 및 6에 적용됩니다. 소 혈청 알부민(BSA) 또는 혈액 루프에 혈액이 있는 펌프를 작동하기 전에 다음 단계를 수행하십시오. 기계적 스트레스를 최소화하기 위해 중력 공급을 사용하여 혈관 간에 혈액을 전달합니다. 주사기 플런저를 사용하여 혈액을 구동하면 과도한 압력이 발생할 수 있으므로 피하십시오. 또한 세포 구성 요소의 손상을 방지하기 위해 좁은 구멍을 통해 혈액을 조절하지 마십시오.

1. 테스트 루프 채우기 및 배출
   1. 주입 포트에 30인치 연장선을 부착하고 60mL 주사기 배럴을 깔때기로 연결합니다. 통풍구 역할을 하는 저수지 마개를 엽니다.
   2. 깔때기에 액체를 붓고 필요에 따라 올려 파일링 속도를 높입니다. 루프 1-2cm 아래 백 상단의 통풍구를 채웁니다. 통풍구와 주입구 마개를 닫습니다.
   3. 배수하려면 통풍구와 주입구 마개를 열고 깔때기를 벤치 높이 아래로 내립니다. 펌프를 배수구 위로 올려 남은 유체를 배출합니다.
2. 테스트 루프 방열기
   알림: 펌프를 시작하기 전에 루프에 BSA 또는 혈액을 채울 때 이 절차를 수행하십시오.
   1. 루프의 어느 곳에도 공기가 갇히지 않았는지 확인하십시오. 튜브와 저장소를 부드럽게 두드리고 짜서 표면의 기포를 제거합니다.
   2. 축류 혈액 펌프를 평가하는 경우 수직 위치로 회전하여 부력을 통해 공기를 방출합니다. 원심 펌프를 사용하는 경우 거꾸로 뒤집고 회전하여 2차 흐름 경로에 공기가 갇히지 않도록 합니다.
   3. 튜브의 수평 부분과 튜브와 커넥터 사이의 접합부를 면밀히 검사하여 기포가 없는지 확인합니다.
   4. IV 백을 짜서 유체 레벨을 상단의 좁은 부분에 가깝게 가져오고 유체 라인을 가로질러 지혈제로 백을 고정하여 유체-공기 인터페이스를 제거합니다. 통풍구 마개를 닫습니다.
3. 압력 라인과 샘플링 포트 프라이밍
   1. 압력선 끝에 있는 스톱콕을 닫고 압력계 튜브를 제거한 다음 3mL 주사기를 부착합니다. 마개를 열고 연장선(약 4cm)에 1-2mL의 액체를 끌어들입니다.
   2. 스톱콕을 닫고 주사기를 분리한 다음 압력계 튜브를 다시 연결합니다. 마개를 열어 압력 판독을 활성화합니다.
   3. 주사기를 사용하여 샘플링 포트를 프라임합니다.
4. 주입 및 샘플링 포트 청소
   1. 보푸라기가 없는 물티슈를 세 개의 동일한 조각으로 자르거나 찢습니다. 한 조각의 모서리를 비틀어 팁을 만들고 포트에 삽입하여 잔여 혈액을 흡수합니다.
   2. 두 번째 조각을 비틀어 식염수를 적신 다음 젖은 팁을 포트에 삽입합니다. 포트 주위를 비틀어 남아 있는 모든 피를 제거합니다.
   3. 세 번째 단편을 사용하여 포트에 남아 있는 식염수를 흡수합니다.
      알림: 혈액을 채취한 직후 이 세척 절차를 수행하십시오.ample 또는 포트에 잔류 혈액이 있을 때마다 수행하십시오.

5. 혈액 접촉 표면을 부동태화하기

1. 루프를 1% BSA 용액으로 채우고 VAD를 작동하여 최소 30분 동안 순환시킵니다.
2. 루프에 누출이 있는지 검사하고 필요한 경우 다시 조립하십시오.
3. 혈액 희석을 방지하기 위해 BSA 용액을 완전히 배출하십시오.

6. 혈전증 검사

1. 테스트 루프를 준비합니다.
   1. 혈액 150mL로 루프를 채웁니다.
   2. 루프의 공기를 제거하고 압력 라인과 샘플링 포트를 4.2-4.4 단계에 설명된 대로 프라이밍합니다.
   3. 펌프를 저속으로 시작하고 약 5초 동안 작동하여 펌프 내부에 갇힌 기포를 제거한 다음 펌프를 정지합니다.
   4. 가방에 기포가 나타나면 4.2단계를 반복하여 디에어링을 다시 수행하십시오.
   5. 루프의 혈액을 순환시키기 위해 저속으로 펌프를 다시 시작하십시오.
2. 루프의 혈액에 헤파린을 첨가하십시오.
   1. 테스트 중 취급이 용이하도록 제조업체 포장에서 1mL의 헤파린 나트륨(1000 U/mL)과 1.5 mL의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA; 0.5 M)을 별도의 튜브로 옮깁니다.
   2. 3방향 스톱콕의 가로 포트를 사용하여 주사기를 사용하여 루프에 물질을 투여합니다. 마개의 수 루어 잠금 장치를 돌려 주입 포트가 위쪽을 향하도록 하여 상단의 기포를 가둡니다.
   3. 혈액 150mL에 헤파린 나트륨 75U를 첨가하여 루프에서 0.5U/mL의 헤파린 농도를 달성합니다. 75U의 헤파린(1000U/mL 농도를 사용하는 경우 75μL)을 마이크로피펫에 흡인하고 피펫을 분주하고 주사기 플런저를 당겨 3mL 주사기에 분주합니다. 모든 액체가 엎질러지지 않고 옮겨졌는지 확인하십시오.
   4. 루어 잠금 장치를 통해 주사기를 주입 포트에 부착하되 포트가 위를 향하고 주사기 끝이 수직으로 아래를 향하도록 합니다. 주사기 플런저를 당겨 혈액으로 채우고 헤파린을 혈액과 혼합하면서 주사기로 공기를 흡입합니다. 기포가 주사기 상단으로 올라오도록 합니다. 혼합물을 루프에 주입하여 공기가 들어가지 않도록 합니다.
   5. 주사기를 4-5회 왕복 운반하여 헤파린화된 혈액이 포트의 공간에 국한되지 않도록 합니다. 루프에 공기가 들어가지 않도록 하십시오.
3. 루프에서 혈액의 ACT를 적정합니다.
   1. 헤파린과 동일한 절차를 사용하여 150mL의 혈액에 750μL의 1M CaCl₂ 용액을 첨가하여 루프에서 5mM의 초기 칼슘 농도를 달성합니다.
      1. 높은 칼슘 농도에 노출된 혈액은 주사기에서 응고되기 시작할 수 있습니다. 잔류 공기를 제거한 후 신속하게 유체를 주입하십시오. 선택적으로, 주사기의 CaCl₂ 를 TRIS 완충 식염수 1ml로 희석하여 조기 응고의 위험을 줄입니다.
   2. 주입된 CaCl₂ 가 초기 ACT를 측정하기 위해 혈액 샘플을 채취하기 전에 최소 2분 동안 루프에서 순환하도록 합니다.
   3. 샘플링 포트에 1mL 주사기를 부착합니다. 0.5mL의 폐혈을 뽑아 버리면 항구에 정체된 혈액을 제거할 수 있습니다.
   4. 새 1mL 주사기를 부착하고 분석을 위해 0.5mL의 혈액을 채취한 다음 ACT를 측정합니다. 4.4단계의 절차를 사용하여 샘플링 포트를 청소합니다.
   5. 3.2단계의 적정 값을 참조하여 목표 CaCl₂ 농도를 알립니다. 칼슘 농도를 점진적으로 증가시켜 300초의 ACT를 달성합니다. 급격한 응고를 방지하기 위해 한 번에 CaCl₂ 를 전량 추가하지 마십시오.
      참고 :이 연구에 사용 된 테스트에서 5mM의 초기 칼슘 농도는 450 ± 50 초의 ACT를 나타 냈으며 7-8 mM의 최종 농도는 300 ± 20 초의 ACT를 산출했습니다. 이 응답은 다를 수 있지만 테스트 시작 시 ACT를 300초 이하로 낮추는 것을 목표로 합니다.
4. 테스트를 시작합니다.
   1. 루프에서 300초의 ACT가 달성되면 1-h 테스트를 시작합니다. 로터 속도를 수정하고 Hoffman cl을 사용하여 저항을 조절하여 펌프를 원하는 유량과 압력으로 조정합니다.amp.
   2. 6.3.3-6.3.4 단계에 따라 15분마다 ACT를 측정합니다.
   3. ACT가 200초 미만으로 떨어지면 루프에 25U의 헤파린 나트륨을 추가로 주입합니다.
5. 테스트를 종료합니다.
   1. 1 시간이 끝나면 EDTA를 루프에 주입하여 추가 응고를 억제하고 혈액 내 최종 농도 5mM를 목표로합니다. (0.5M EDTA 용액을 사용하는 경우 1.5mL를 주입합니다.)
   2. EDTA가 순환하고 2분 동안 혼합되도록 한 다음 펌프를 멈춥니다.
6. 펌프를 분리하고 세척하십시오.
   1. Clamp 지혈기를 사용하여 펌프 입구와 출구에 연결된 튜브를 배치하고 clamps는 입구 및 출구 미늘에서 3-4cm 떨어져 있습니다.
   2. 튜브를 조심스럽게 분리하여 펌프를 해제하십시오.
   3. 펌프에서 혈액을 배출하고 루프를 용기로 흘립니다.
   4. 펌프 흡입구와 배출구를 통해 식염수를 중력 공급하거나 피펫팅하여 펌프에 남아 있는 혈액을 세척합니다.
      참고: 6.7단계와 6.8단계는 동시에 수행됩니다.
7. 펌프 흐름 경로를 검사합니다.
   1. 내시경/내시경 카메라를 사용하여 펌프 입구와 출구의 이미지를 캡처합니다.
   2. 펌프를 분해합니다(해당되는 경우). 식염수 수조에서 구성 요소를 세척하고 해부 내시경 또는 매크로 렌즈를 사용하여 혈전을 검사합니다.
   3. 문서화를 위해 혈액 접촉 표면을 촬영합니다.
      참고: 일관된 검사와 철저한 문서화는 비교 테스트에 매우 중요합니다.
8. 사용한 혈액을 걸러냅니다.
   1. 캐치 컨테이너의 입구를 덮을 수 있을 만큼 충분히 큰 100μm 나일론 메쉬 천 조각을 자릅니다.
   2. 혈액이 효과적으로 흐를 수 있도록 용기 위에 메쉬를 약간 드레이프하여 놓습니다. 여과 중에 미끄러지지 않도록 메쉬의 가장자리를 고정하십시오.
   3. 사용한 혈액을 나일론 메쉬에 통과시킵니다. 기관의 생물학적 폐기물 처리 지침에 따라 혈액을 폐기하십시오.
   4. 메시에서 포획된 혈전을 검사하고 결과를 문서화합니다.
9. 조직학적 분석을 준비합니다.
   1. 조직학적 분석이 계획되어 있는 경우, 적절한 안전 절차에 따라 포르말린 용액에서 발견된 모든 혈전을 수정하십시오.
      주의 : 포름알데히드를 취급할 때는 항상 흄 후드를 사용하십시오.

7. 청소 절차

1. 흐름 루프를 분해합니다. PVC 혈액 주머니와 튜브를 폐기하십시오.
2. 다른 모든 혈액 접촉 구성 요소(커넥터, 마개, 루어 잠금 장치 등)를 1% 효소 활성 분말 세제 용액에 밤새 담그십시오. 따뜻한 수돗물로 헹구고 DI 물로 헹구고 자연 건조합니다.
   1. 혈전이 남아 있으면 세제 용액의 성분을 초음파 처리하십시오. 철저히 헹구고 자연 건조하십시오.
3. 펌프를 청소하십시오.
   1. 펌프를 분해할 수 있는 경우 혈액 접촉 구성 요소를 1% 다목적 세척제/탈지제 용액으로 담그고 초음파 처리한 다음 1% 효소 활성 분말 세제 용액을 사용합니다.
   2. 펌프를 분해할 수 없는 경우 세척 용액으로 채워진 새 흐름 루프에 연결하고 최소 30분 동안 고속으로 작동하십시오. 필요에 따라 반복합니다.
4. 따뜻한 수돗물로 펌프를 철저히 헹군 다음 DI 물로 씻고 자연 건조합니다.

결과

이 프로토콜을 성공적으로 실행하면 혈소판 침착의 국소적인 영역을 식별할 수 있어 펌프의 흐름 경로 내에서 문제가 있는 지점을 드러낼 수 있습니다. 이 프로토콜을 일관되게 적용하면 이러한 식별된 "핫스팟"을 해결하여 점진적인 개선이 가능합니다.

예를 들어, PediaFlow PF5 VAD를 개발하는 동안 구성 요소의 소형 크기로 인해 고정자 베인의 압력 측?...

토론

전임상 연구가 인간에서 VAD의 혈전발생성을 안정적으로 예측할 수 없기 때문에 새로운 펌프의 최초 인간 대상 임상시험은 항상 불안정한 노력입니다²⁶. 특히, 동물 실험에서 혈전증이 없는 것으로 입증된 일부 VAD는 나중에 임상적 사용에서 유의미한 혈전원성을 보였다³⁶. 혈전증을 유발하기 위해 특별히 고안된 공격적인 체외 테...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr