במבחנה בדיקת פקקת למכשירי עזר לחדרים

Summary

אנו מציגים פרוטוקול שולחני לגרימת פקקת במכשירי עזר לחדרים (VAD) בתוך פלטפורמת בדיקה מחזורית. שיטה זו משמשת לזיהוי נקודות חמות טרומבוגניות בנתיב זרימת הדם ויכולה לסייע בשיפור עמידות לפקקת לקראת ניסויים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים.

Abstract

הסיכון לפקקת נותר דאגה משמעותית בפיתוח ושימוש קליני במכשירי עזר לחדרים (VADs). הערכות מסורתיות של פקקת VAD, בעיקר באמצעות מחקרים בבעלי חיים, הן יקרות וגוזלות זמן, מעלות חששות אתיים, ובסופו של דבר עשויות שלא לשקף במדויק את התוצאות האנושיות. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול בדיקה אגרסיבי במבחנה שנועד לעורר פקקת ולזהות אזורים פוטנציאליים בסיכון גבוה בנתיב זרימת הדם. פרוטוקול זה, המונע על ידי עבודתם של Maruyama et al., משתמש באסטרטגיה נוגדת קרישה שונה ומשתמש ברכיבים זמינים, מה שהופך אותו לנגיש לרוב המעבדות המבצעות בדיקות דם חוץ גופיות של VADs. הדגמנו את התועלת של שיטה זו באמצעות בדיקות איטרטיביות ושכלול של VAD ילדים מיניאטורי מרחף מגנטית (PediaFlow PF5). השיטה הייתה יעילה בזיהוי נקודות חמות טרומבוגניות שנגרמו על ידי פגמים בתכנון וייצור באבות טיפוס מוקדמים של VAD, מה שמאפשר שיפורים ממוקדים לפני התקדמות למחקרים בבעלי חיים. למרות מגבלותיו, כולל היעדר זרימה פועמת והשפעת מאפייני הדם של התורם, פרוטוקול זה משמש ככלי מעשי לפיתוח VAD בשלב מוקדם ולהפחתת סיכונים.

Introduction

מכשירי עזר לחדרים (VADs) הפכו לסטנדרט טיפול בחולים עם אי ספיקת לב מתקדמת, אך הסיכון לפקקת ושבץ נותר אתגר משמעותי ^1,2. פקקת בתוך VADs מוערכת בדרך כלל במהלך ניסויים פרה-קליניים בבעלי חיים, שלמרות שהם בעלי ערך, מציגים עלויות משמעותיות ואתגרים לוגיסטיים. מחקרים אלה עתירי משאבים, גוזלים זמן ורגישים לפגם בודד המסכן את הבדיקה כולה ומחייב ניסויים נוספים. זה לא רק מגדיל את הנטל הכספי אלא גם מעלה חששות אתיים עקב הצורך בניסויים חוזרים ונשנים בבעלי חיים.

למרות שקיימים מודלים מספריים רבים לחיזוי שקיעת טסיות דם^ופקקת 3,4,5,6, רק מעטים מתאימים להדמיית היווצרות פקקת במכשירים בקנה מידה מאקרו כגון VADs ^7,8,9. יתר על כן, מודלים קיימים מניחים בהכרח משטחים אידיאליים וגיאומטריות "אטומות למים" פשוטות, שאינן משקפות במדויק את המורכבות והפגמים של מכלולי משאבות בעולם האמיתי. כאשר לוקחים בחשבון אינטראקציות טסיות-משטח, מודלים מקרו-מקרו אלה משתמשים בדרך כלל בתכונות חומר שנקבעו באופן אחיד (בדרך כלל ממודלים כמקדם בתנאי גבול שטף פני השטח)10,11,12. כתוצאה מכך, מודלים מספריים אינם יכולים להוות תחליף מוחלט לניסויים בדם.

גם בחירת החומר וגם גימור פני השטח ממלאים תפקידים קריטיים בהדבקת טסיות הדם על משטחי VAD 13,14,15,16,17. פגמים כגון כתמים מחוספסים או אי סדרים יכולים לקדם הידבקות טסיות דם והיווצרות פקקת. בנוסף, סדקים בין רכיבים בנתיב הזרימה יכולים לשמש כנידוס לפקקת, ולספק סביבות מוגנות שבהן קרישים יכולים להיווצר ולגדול^18,19. השימוש בשומן, חומרי סיכה או חומרי איטום במהלך ההרכבה יכול גם להוות סיכון, מכיוון שחומרים אלו עלולים לחלחל לנתיב הזרימה ולקיים אינטראקציה עם הדם, מה שמגביר עוד יותר את הסיכון לסיבוכים.

לכן, יש צורך בפרוטוקול בדיקה חוץ גופית מוגדר היטב שיכול להעריך באופן אמין את העמידות לפקקת של VADs לפני שהם נתונים לניסויים בבעלי חיים או לשימוש קליני. אמנם קיים תקן ASTM שאומץ באופן נרחב להערכת המוליזה²⁰, אך לא קיים תקן כזה לבדיקת טרומבוגניות של VADs בתנאי הפעלה רלוונטיים מבחינה קלינית²¹. למרות מחקרים מכוננים מלפני שלושה עשורים המראים את ההיתכנות של בדיקת פקקת חוץ גופית למשאבות דם 22,23,24,25, ניסויים בבעלי חיים נמשכו כפרקטיקה דה פקטו להערכת פקקת עד היום ²⁶. המכשול לאימוץ רחב יותר של שיטות במבחנה היה ככל הנראה האופי המורכב של קרישה, עם ריבוי גורמים מבלבלים שיכולים להשפיע על תוצאות הבדיקה, מה שהופך את זה למאתגר להבדיל בין פקקת משאבה פנימית לבין חפצים הנובעים ממגבלות מתודולוגיות וטעויות פרוצדורליות.

זה הניע אותנו לחלוק פרוטוקול מפורט כמדריך לניסויים להימנע ממלכודות, ובכך לקדם את השימוש בבדיקות חוץ גופיות ולהפחית את ההסתמכות על מחקרים בבעלי חיים. הפרוטוקול המתואר כאן, שנגזר מ-Maruyama et ^al.27, שוכלל ותוקף במהלך התכנון של הדור^החמישי של PediaFlow (PF5) VAD^{לילדים 28,29}. שיטת בדיקה זו הוכיחה את עצמה כחיונית בזיהוי וטיפול שיטתי בסיכונים טרומבוגניים פוטנציאליים באבות הטיפוס של VAD לקראת ניסויים בבעלי חיים.

Protocol

דם מלא של בקרים ששימש במחקר זה התקבל מספק מסחרי ולכן לא דרש בדיקה של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קורנל.

1. בניית לולאת זרימת הבדיקה

הערה: עיין בטבלת החומרים לרשימה מפורטת של רכיבי לולאה וכל שאר החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. שנה את השקית התוך ורידית (IV).
   1. השתמש באיטום חום מפלסטיק כדי לשנות שקית IV כדי להתאים את נפחה וצורתה, כפי שמתואר באיור 1.
      הערה: צורת השקית מקלה על הסרת האוויר ומאפשרת להדק את השקית עם המוסטט על פני קו הנוזל^30,31. מיקום קו האיטום נבחר על סמך נפח ההתחלה של ה-VAD והצינורות כדי להשיג נפח תחול כולל של 150 מ"ל.
   2. הכניסו פתח אוורור על ידי ביצוע חתך של 4 מ"מ בחלק העליון של השקית. הכנס מנעול לואר נקבה דוקרני לתוך החתך ואטום את האתר עם דבק גומי סיליקון RTV. חבר תא עצירה חד כיווני למנעול הלואר.
2. הרכיבו את לולאת הבדיקה באמצעות שקית ה-IV שהשתנתה, צינורות פוליוויניל כלוריד (PVC), מחברים דוקרניים מפוליקרבונט ותאי עצירה תלת-כיווניים וחד-כיווניים, כפי שמוצג באיור 1.
3. חבר את מד לחץ הלחץ.
   1. חבר קווי הארכה בגודל 6 אינץ' ליציאות הלחץ בצד הכניסה והיציאה. חבר תא עצירה חד כיווני לקצה השני של קו ההארכה.
      הערה: תא העצירה מאפשר לנתק את צינור המונומטר כדי למלא את קו ההארכה בנוזל לפני הפעלת המשאבה, כמתואר בשלב 4.3.
   2. חבר קצה אחד של כל צינור בקוטר פנימי (ID) בגודל 1/8 אינץ' לדוקרני מנומטר והכנס התאמת לואר זכר לקצה השני.
   3. חבר אביזרי לואר זכריים לעצורים החד-כיווניים. פתח את פקקי העצירה כדי לאפשר קריאות לחץ.
4. החל בדיקת זרימה אולטראסונית מהודקת כדי למדוד את קצב הזרימה.
5. הנח הופמן clamp דיסטלי ליציאת לחץ היציאה כדי לווסת את התנגדות הזרימה.

2. הכנת תמיסת הקלציום כלוריד (CaCl₂)

1. ממיסים אבקת CaCl₂ בתמיסת מלח 1x TRIS (pH 7.4) להכנת תמיסה של 1 M. הימנע ממאגרים המכילים פוספט (למשל, PBS או DPBS) מכיוון שסידן ופוספט מגיבים ליצירת משקעים בלתי מסיסים.
2. אם מכינים CaCl₂ בכמויות גדולות, הוסיפו את אבקת CaCl₂ בהדרגה במספר שלבים, מכיוון שפירוקה הוא תהליך אקסותרמי.
3. יש לטטר את ה-pH של התמיסה ל-6-8 באמצעות חומצה הידרוכלורית (HCl) או נתרן הידרוקסיד (NaOH) במידת הצורך.

3. הכנת דם

הערה: דם הבקר ששימש במחקר זה התקבל מספק מסחרי הרשום בטבלת החומרים. הדם נאסף באמצעות מחט 14 גרם, כאשר החיה מרוסנת בתנוחת עמידה חקלאית סטנדרטית. תהליך האיסוף ארך 10-12 דקות מרגע החדרת המחט ועד לסיומו. הדם עבר נוגדי קרישה עם 14 חלקי CPD ל-86 חלקי דם (פורמולציה CPD: 26.3 גרם/ליטר Na-ציטראט, 25.2 גרם דקסטרוז, 3 גרם/ליטר חומצת לימון ו-2.2 גרם/ליטר Na פוספט במים נטולי יונים [DI]). שקית הדם נשלחה למשך הלילה במיכל מבודד עם שקיות קרח ושימשה לניסוי תוך 24 שעות מרגע האיסוף.

1. הכן את דם התורם לשימוש.
   1. הניחו את שקית הדם על משטח הטיה למשך 15-30 דקות כדי לערבב את הדם בעדינות ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר (RT).
   2. הנח מוט ערבוב מגנטי בכוס פוליקרבונט או במיכל המיועד להעברת הדם.
   3. העבירו את הדם לכוס דרך פילטר עירוי להסרת מקרואגרטים. טפלו בדם בעדינות כדי למנוע נזק לרכיבים התאיים. שפכו את הדם לאורך דפנות המיכל כדי למנוע נפילה חופשית ולמזער טראומה תאית.
      הערה: השלך את הדם אם קיימים פקקת גדולה או אם המסנן נסתם.
   4. הניחו את הכוס או המיכל על מערבל מגנטי והתאימו את המהירות עד שפני הדם מתחילים להסתובב בעדינות מבלי ליצור מערבולת גדולה. מערבבים ברציפות לפחות 5 דקות.
   5. מדוד את ספירת ההמטוקריט וטסיות הדם כדי להבטיח שהערכים נמצאים בטווח הנורמלי עבור המין.
2. בצע טיטרציות כדי לקבוע את ריכוז היעד CaCl₂ .
   הערה: דם מצויט עובר עידן מחדש כדי לאפשר בדיקת קרישה ופקקת, עם תוספת הפרין למניעת קרישה בורחת. זמן הקרישה המופעל היעד (ACT) לתחילת הבדיקה הוא 300 שניות. שימו לב שערכי ה-ACT הייחוס המופיעים בסעיף זה הושגו באמצעות דם כבשים תורם ועשויים להשתנות בהתאם למין ולרמת נוגדי הקרישה המשמשת במהלך האיסוף. בנוסף, מדידות ACT יכולות להשתנות בין מכשירים 32,33,34. ייתכן שיידרשו ניסוי וטעייה כדי לקבוע את טווח ה-ACT האופטימלי עבור מערך מעבדה ספציפי.
   1. העבירו 2 מ"ל מתמיסת 1 M CaCl₂ המוכנה ו-0.5 מ"ל נתרן הפרין (1000 U/mL) מאריזת היצרן לצינורות מיקרו-צנטריפוגה כדי למנוע זיהום של תמיסות המלאי.
   2. העבירו 10 מ"ל דם למבחנות פוליפרופילן של 14 מ"ל. הכן ארבעה צינורות כאלה.
   3. כדי להשיג ריכוז הפרין של 0.5 U/mL בדם, הוסף 5 מיקרוליטר נתרן הפרין לדגימת הדם של 10 מ"ל.
   4. כדי להשיג ריכוז סידן של 5 מ"מ בדם, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת 1 M CaCl₂ לדגימת הדם של 10 מ"ל. בזמן החלוקה, סובב את קצה הפיפטה כדי לפזר את ה-CaCl₂ על פני שטח רחב יותר.
   5. מיד, הפוך את הצינור 10 פעמים, גלגל אותו אופקית (על משטח ישר או בין כפות הידיים), ואז הפוך 10 פעמים נוספות כדי להבטיח ערבוב יסודי.
   6. מדוד את ה-ACT באמצעות מערכת קרישת דם מלא בנקודת טיפול בהתאם להוראות היצרן. ה-ACT הראשוני ינוע בדרך כלל בין 400-500 שניות.
   7. תוך שמירה על ריכוז הפרין קבוע, הגדל את ריכוז CaCl₂ (לכ-7-8 מ"מ) כדי להשיג ACT של 300 שניות.
   8. ודא את הריכוז הסופי ואת ה-ACT המתקבל בצינור דם נפרד.

4. נהלי בדיקה מוקדמת

הערה: כל השלבים המתוארים בסעיף זה חלים על סעיפים 5 ו-6. בצע את השלבים הבאים לפני הפעלת המשאבה עם אלבומין בסרום בקר (BSA) או דם בלולאה. העברת דם בין כלי הדם באמצעות הזנה בכוח הכבידה כדי למזער את הלחץ המכני. הימנע משימוש בבוכנת המזרק כדי להזרים דם, מכיוון שהדבר עלול ליצור לחץ מוגזם. בנוסף, הימנע מחניקת דם דרך פתחים צרים כדי למנוע נזק לרכיבים התאיים.

1. מילוי וניקוז לולאת הבדיקה
   1. חבר קו מאריך של 30 אינץ' ליציאת ההזרקה וחבר חבית מזרק של 60 מ"ל כמשפך. פתח את תא העצירה של המאגר כדי לשמש כפתח אוורור.
   2. שופכים נוזל למשפך, מרימים אותו לפי הצורך כדי להאיץ את התיוק. מלאו את הלולאה עד 1-2 ס"מ מתחת לפתח האוורור בחלק העליון של השקית. סגור את פתחי האוורור ויציאת ההזרקה.
   3. כדי לנקז, פתח את פתחי האוורור ויציאת ההזרקה והורד את המשפך מתחת לגובה הספסל. הרם את המשאבה מעל יציאת הניקוז כדי לפנות את הנוזל שנותר.
2. ביטול שידור לולאת הבדיקה
   הערה: בצע הליך זה בעת מילוי הלולאה ב-BSA או בדם לפני הפעלת המשאבה.
   1. ודא שאין אוויר כלוא בשום מקום בלולאה. עקור בועות אוויר על משטחים על ידי הקשה וסחיטה עדינה של הצינור והמאגר.
   2. אם אתה מעריך משאבת דם בזרימה צירית, סובב אותה למצב אנכי כדי לשחרר אוויר באמצעות ציפה. אם אתה משתמש במשאבה צנטריפוגלית, הפוך אותה הפוך וסובב אותה כדי להבטיח שאוויר לא נלכד בנתיבי זרימה משניים.
   3. בדוק מקרוב את החלקים האופקיים של הצינורות ואת החיבורים בין צינורות למחברים כדי לוודא שאין בועות אוויר.
   4. סחטו את שקית העירוי כדי לקרב את מפלס הנוזל לחלק הצר העליון והדק את השקית עם המוסטט על פני קו הנוזל כדי לחסל את ממשק הנוזל-אוויר. סגור את תא העצירה של פתח האוורור.
3. תחול קווי הלחץ ויציאת הדגימה
   1. סגור את תא העצירה בקצה קווי הלחץ, הסר את צינור המונומטר והצמד מזרק של 3 מ"ל. פתח את תא העצירה ושאב 1-2 מ"ל נוזל לקו ההארכה (כ -4 ס"מ).
   2. סגור את תא העצירה, נתק את המזרק וחבר מחדש את צינור המונומטר. פתח את תא העצירה כדי לאפשר קריאות לחץ.
   3. יש להניח את יציאת הדגימה באמצעות מזרק.
4. ניקוי יציאות ההזרקה והדגימה
   1. חותכים או קורעים מגבון נטול מוך לשלושה שברים שווים. סובב את הפינה של שבר אחד ליצירת קצה והכנס אותו לפתח כדי לספוג שאריות דם.
   2. סובבו את השבר השני, הרטיבו אותו במי מלח והכניסו את הקצה הרטוב ליציאה. סובב אותו סביב היציאה כדי להסיר את כל הדם שנותר.
   3. השתמש בשבר השלישי כדי לספוג שאריות מלח ביציאה.
      הערה: בצע הליך ניקוי זה מיד לאחר שאיבת דם דגימה או בכל פעם שיש שאריות דם ביציאות.

5. פסיביזציה של משטחי המגע עם הדם

1. מלאו את הלולאה בתמיסת BSA של 1% והפעילו את ה-VAD כדי להפיץ אותה למשך 30 דקות לפחות.
2. בדוק את הלולאה לאיתור נזילות והרכיב מחדש במידת הצורך.
3. מסננים את תמיסת ה-BSA לחלוטין כדי למנוע דילול המודילציה.

6. בדיקת פקקת

1. הכן את לולאת הבדיקה.
   1. מלאו את הלולאה ב -150 מ"ל דם.
   2. הוצא את הלולאה מהאוויר ופתח את קווי הלחץ ויציאת הדגימה כמתואר בשלבים 4.2-4.4.
   3. הפעל את המשאבה במהירות נמוכה והפעל אותה במשך כ-5 שניות כדי לעקור בועות אוויר כלואות בתוך המשאבה, ולאחר מכן עצור את המשאבה.
   4. אם מופיעות בועות כלשהן בשקית, חזור על שלב 4.2 כדי לבצע שוב ביטול אוויר.
   5. הפעל מחדש את המשאבה במהירות נמוכה כדי להזרים את הדם בלולאה.
2. הוסף הפרין לדם בלולאה.
   1. העבירו 1 מ"ל של נתרן הפרין (1000 U/mL) ו-1.5 מ"ל של חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA; 0.5 מ') מאריזת היצרן לצינורות נפרדים כדי להקל על הטיפול במהלך הבדיקה.
   2. השתמש ביציאה הרוחבית של תא העצירה התלת-כיווני כדי להזרים חומרים לתוך הלולאה באמצעות מזרק. סובב את מנעול ה-luer הזכר על תא העצירה כך שיציאת ההזרקה פונה כלפי מעלה כדי ללכוד בועות אוויר בחלק העליון.
   3. השג ריכוז הפרין של 0.5 U/mL בלולאה על ידי הוספת 75 U של נתרן הפרין ל-150 מ"ל דם. שאפו 75 יחידות של הפרין (75 מיקרוליטר אם משתמשים בריכוז של 1000 U/mL) לתוך מיקרופיפטה והוציאו אותה למזרק של 3 מ"ל על ידי הוצאת הפיפטה ומשיכת בוכנת המזרק. ודא שכל הנוזל מועבר ללא שפיכה.
   4. חבר את המזרק ליציאת ההזרקה דרך מנעול הלואר, כאשר הפתח פונה כלפי מעלה וקצה המזרק פונה אנכית כלפי מטה. משוך את בוכנת המזרק כדי למלא אותה בדם ולערבב את הפרין עם הדם תוך שאיבת אוויר לתוך המזרק. הניחו לבועת האוויר לעלות לראש המזרק. הזריקו את התערובת לתוך הלולאה, וודאו שלא ייכנס אוויר.
   5. העבירו דם פנימה והחוצה מהמזרק 4-5 פעמים כדי להבטיח שהדם ההפריני לא יישאר מוגבל לחלל בנמל. ודא שלא ייכנס אוויר ללולאה.
3. טיטרט את ה-ACT של הדם בלולאה.
   1. השג ריכוז סידן ראשוני של 5 מ"מ בלולאה על ידי הוספת 750 מיקרוליטר של תמיסת 1 M CaCl₂ ל-150 מ"ל דם באותו הליך כמו הפרין.
      1. דם שנחשף לריכוזי סידן גבוהים עלול להתחיל להיקרש במזרק. הזריק במהירות את הנוזל לאחר הסרת שאריות אוויר. לחלופין, יש לדלל את ה-CaCl₂ במזרק עם 1 מ"ל של מי מלח עם חוצץ TRIS כדי להפחית את הסיכון לקרישה מוקדמת.
   2. אפשר ל-CaCl₂ המוזרק להסתובב בלולאה למשך 2 דקות לפחות לפני שאיבת דגימת דם למדידת ה-ACT הראשוני.
   3. חבר מזרק של 1 מ"ל ליציאת הדגימה. משוך והשליך 0.5 מ"ל של דם פסולת כדי לנקות דם עומד מהנמל.
   4. חבר מזרק חדש של 1 מ"ל, שאב 0.5 מ"ל דם לניתוח ומדוד את ה-ACT. נקה את יציאת הדגימה באמצעות ההליך בשלב 4.4.
   5. עיין בערכי הטיטרציה בשלב 3.2 כדי ליידע את ריכוז היעד CaCl₂ . הגדל בהדרגה את ריכוז הסידן כדי להשיג ACT של 300 שניות. הימנעו מהוספת הכמות המלאה של CaCl₂ בבת אחת כדי למנוע קרישה מהירה.
      הערה: בבדיקה ששימשה במחקר זה, ריכוז הסידן הראשוני של 5 מ"מ הביא ל-ACT של 450 ±-50 שניות, והריכוז הסופי של 7-8 מ"מ הניב ACT של 300 ±-20 שניות. למרות שתגובה זו עשויה להשתנות, שאפו להביא את ה-ACT ל-300 שניות או מתחת לתחילת המבחן.
4. התחל את הבדיקה.
   1. לאחר השגת ה-ACT של 300 שניות בלולאה, התחל את מבחן השעה. כוונן את המשאבה לקצב הזרימה והלחץ הרצויים על ידי שינוי מהירות הרוטור וויסות ההתנגדות באמצעות מהדק הופמן.
   2. מדוד את ה-ACT כל 15 דקות לפי שלבים 6.3.3-6.3.4.
   3. אם ה-ACT יורד מתחת ל-200 שניות, הזריק 25 יחידות נוספות של נתרן הפרין לתוך הלולאה.
5. סיים את המבחן.
   1. בתום שעה אחת, הזריק EDTA לתוך הלולאה כדי לעכב קרישה נוספת, תוך התמקדות בריכוז סופי של 5 מ"מ בדם. (הזרקו 1.5 מ"ל אם משתמשים בתמיסת EDTA של 0.5 מ'.)
   2. הניחו ל-EDTA להסתובב ולערבב במשך 2 דקות, ולאחר מכן עצרו את המשאבה.
6. נתק ושטוף את המשאבה.
   1. Clamp הצינור המחובר לכניסה ויציאת המשאבה באמצעות המוסטטים, ומקם את clamps במרחק של 3-4 ס"מ מדוקרני הכניסה והיציאה.
   2. נתק בזהירות את הצינור כדי לשחרר את המשאבה.
   3. מסננים את הדם מהמשאבה וזורמים לולאה למיכל.
   4. שטפו את כל שאריות הדם מהמשאבה על ידי הזנת כוח הכבידה או פיפטינג מי מלח דרך כניסת ויציאת המשאבה.
      הערה: שלבים 6.7 ו-6.8 מבוצעים בו-זמנית.
7. בדוק את נתיב זרימת המשאבה.
   1. צלם תמונות של כניסת ויציאת המשאבה באמצעות מצלמת אנדוסקופ/בורסקופ.
   2. פרק את המשאבה (אם רלוונטי). שטפו רכיבים באמבט מלח ובדקו אם יש פקקת באמצעות היקף חיתוך או עדשת מאקרו.
   3. צלם משטחים המגעים עם דם לתיעוד.
      הערה: בדיקה עקבית ותיעוד יסודי הם קריטיים לבדיקה השוואתית.
8. מסננים את הדם המשומש.
   1. חותכים חתיכה של בד רשת ניילון בגודל 100 מיקרומטר גדול מספיק כדי לכסות את פתח מיכל התפיסה.
   2. מקם את הרשת מעל המיכל עם וילון קל כדי לאפשר לדם לזרום דרכו ביעילות. אבטח את שולי הרשת כדי למנוע החלקה במהלך הסינון.
   3. העבירו את הדם המשומש דרך רשת ניילון. יש להשליך את הדם בהתאם להנחיות הטיפול בפסולת ביולוגית של המוסד.
   4. בדוק את הרשת לאיתור פקקת שנלכדה ותעד את הממצאים.
9. התכוננו לניתוח היסטולוגי.
   1. אם מתוכנן ניתוח היסטולוגי, תקן כל פקקת שנמצאת בתמיסת הפורמלין בהתאם לנהלי בטיחות מתאימים.
      זהירות: השתמש תמיד במכסה אדים בעת טיפול בפורמלדהיד.

7. נוהל ניקוי

1. פרק את לולאת הזרימה. השלך את שקית הדם והצינורות של PVC.
2. השרו את כל שאר הרכיבים הנוגעים בדם (מחברים, פקקים, מנעולי לואר וכו') בתמיסת אבקת ניקוי פעילה של 1% אנזימים למשך הלילה. יש לשטוף במי ברז חמימים, ולאחר מכן במי DI, ולייבש באוויר.
   1. אם נותרו קרישי דם, סוניקט רכיבים בתמיסת חומר הניקוי. יש לשטוף היטב ולייבש באוויר.
3. נקה את המשאבה.
   1. אם ניתן לפרק את המשאבה, יש להשרות ולהפוך את הרכיבים הבאים במגע עם הדם עם תמיסת ניקוי/מסיר שומנים לכל מטרה 1%, ואחריה תמיסת אבקת ניקוי פעילה של 1%.
   2. אם לא ניתן לפרק את המשאבה, חבר אותה לולאת זרימה חדשה מלאה בתמיסות ניקוי והפעל אותה במהירות גבוהה למשך 30 דקות לפחות. חזור על הפעולה לפי הצורך.
4. יש לשטוף היטב את המשאבה במי ברז חמימים, ולאחר מכן במי DI ולייבש באוויר.

תוצאות

ביצוע מוצלח של פרוטוקול זה מאפשר זיהוי אזורים מקומיים של שקיעת טסיות דם, וחושף נקודות בעייתיות בנתיב הזרימה של המשאבה. יישום עקבי של פרוטוקול זה מאפשר שיפורים מצטברים על ידי טיפול ב"נקודות חמות" שזוהו.

לדוגמה, במהלך הפיתוח של PediaFlow PF5 VAD, נתקלנו באתגרים בליט?...

Discussion

ניסוי ראשון בבני אדם של משאבה חדשה הוא תמיד מאמץ מסוכן, מכיוון שמחקרים פרה-קליניים אינם יכולים לחזות באופן מהימן את הפקקת של VADs בבני אדם²⁶. יש לציין כי כמה VADs שהפגינו חופש מפקקת בניסויים בבעלי חיים הפגינו מאוחר יותר פקקת משמעותית בשימוש קליני³⁶. מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr