In vitro Test della trombosi per dispositivi di assistenza ventricolare

Riepilogo

Presentiamo un protocollo da banco per indurre la trombosi nei dispositivi di assistenza ventricolare (VAD) all'interno di una piattaforma di test a ricircolo. Questo metodo serve a identificare i punti caldi trombogenici nel percorso del flusso sanguigno e può aiutare a migliorare la tromboresistenza prima dei test preclinici su modelli animali.

Abstract

Il rischio di trombosi rimane una preoccupazione significativa nello sviluppo e nell'uso clinico dei dispositivi di assistenza ventricolare (VAD). Le valutazioni tradizionali della trombogenicità del VAD, principalmente attraverso studi sugli animali, sono costose e richiedono tempo, sollevano preoccupazioni etiche e, in ultima analisi, potrebbero non riflettere accuratamente i risultati umani. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un aggressivo protocollo di test in vitro progettato per provocare trombosi e identificare potenziali aree ad alto rischio all'interno del percorso del flusso sanguigno. Questo protocollo, motivato dal lavoro di Maruyama et al., impiega una strategia anticoagulante modificata e utilizza componenti prontamente disponibili, rendendolo accessibile alla maggior parte dei laboratori che conducono test del sangue in vitro dei VAD. Abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo attraverso test iterativi e perfezionamento di un VAD pediatrico miniaturizzato a levitazione magnetica (PediaFlow PF5). Il metodo si è rivelato efficace nell'identificare i punti caldi trombogenici causati da difetti di progettazione e produzione nei primi prototipi di VAD, consentendo miglioramenti mirati prima di passare agli studi sugli animali. Nonostante i suoi limiti, tra cui l'assenza di flusso pulsatile e l'influenza delle caratteristiche del sangue del donatore, questo protocollo funge da strumento pratico per lo sviluppo precoce del VAD e la mitigazione del rischio.

Introduzione

I dispositivi di assistenza ventricolare (VAD) sono diventati uno standard di cura nella gestione dei pazienti con insufficienza cardiaca avanzata, ma il rischio di trombosi e ictus rimane una sfida significativa ^1,2. La trombosi all'interno dei VAD viene in genere valutata durante gli studi preclinici sugli animali che, sebbene preziosi, presentano costi sostanziali e sfide logistiche. Questi studi richiedono molte risorse, richiedono molto tempo e sono suscettibili di un singolo difetto che comprometta l'intero test e richieda ulteriori prove. Ciò non solo aumenta l'onere finanziario, ma solleva anche preoccupazioni etiche dovute alla necessità di ripetere i test sugli animali.

Sebbene esistano molti modelli numerici per prevedere la deposizione piastrinica e la trombosi 3,4,5,6, solo pochi sono adatti per simulare la formazione di trombi in dispositivi su macroscala come i VAD ^7,8,9. Inoltre, i modelli esistenti presuppongono inevitabilmente superfici idealizzate e geometrie semplificate "a tenuta stagna", che non riflettono accuratamente le complessità e le imperfezioni dei gruppi pompa del mondo reale. Quando si considerano le interazioni piastrine-superficie, questi modelli su macroscala generalmente impiegano proprietà del materiale uniformemente prescritte (tipicamente modellate come coefficiente nelle condizioni al contorno superficie-flusso)10,11,12. Di conseguenza, i modelli numerici non possono sostituire completamente i test sperimentali con il sangue.

Sia la scelta del materiale che la finitura superficiale svolgono un ruolo fondamentale nell'adesione piastrinica sulle superfici VAD 13,14,15,16,17. Imperfezioni come macchie ruvide o irregolarità possono favorire l'adesione piastrinica e la formazione di trombi. Inoltre, le fessure tra i componenti nel percorso del flusso possono fungere da nidus per la trombosi, fornendo ambienti protetti in cui i coaguli possono formarsi e crescere^18,19. Anche l'uso di grasso, lubrificanti o sigillanti durante l'assemblaggio può rappresentare un rischio, poiché queste sostanze possono penetrare nel percorso del flusso e interagire con il sangue, aumentando ulteriormente il rischio di complicanze.

C'è, quindi, la necessità di un protocollo di test in vitro ben definito in grado di valutare in modo affidabile la tromboresistenza dei VAD prima che siano sottoposti a test sugli animali o all'uso clinico. Sebbene esista uno standard ASTM ampiamente adottato per la valutazione dell'emolisi²⁰, non esiste uno standard simile per i test di trombogenicità dei VAD in condizioni operative clinicamente rilevanti²¹. Nonostante studi seminali risalenti a tre decenni fa dimostrino la fattibilità del test della trombosi in vitro per le pompe del sangue 22,23,24,25, i test sugli animali hanno persistito come pratica de facto per valutare la trombosi fino ad oggi²⁶. L'ostacolo a una più ampia adozione dei metodi in vitro è stata probabilmente la natura complessa della coagulazione, con la moltitudine di fattori confondenti che possono influenzare i risultati dei test, rendendo difficile differenziare la trombogenicità intrinseca della pompa dagli artefatti derivanti da limitazioni metodologiche ed errori procedurali.

Questo ci ha motivato a condividere un protocollo dettagliato come guida per gli sperimentatori per evitare insidie, promuovendo così l'uso di test in vitro e mitigando la dipendenza dagli studi sugli animali. Il protocollo qui descritto, derivato da Maruyama et ^al.27, è stato perfezionato e convalidato durante la progettazione del VAD^28,29 pediatrico PediaFlow (PF5) di 5a^generazione. Questo metodo di test si è rivelato determinante per identificare e affrontare sistematicamente i potenziali rischi trombogenici nei prototipi VAD prima della sperimentazione animale.

Protocollo

Il sangue intero ovino utilizzato in questo studio è stato ottenuto da un fornitore commerciale e, pertanto, non ha richiesto una revisione da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Cornell University.

1. Costruzione del circuito di flusso di prova

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per un elenco dettagliato dei componenti del loop e di tutti gli altri materiali utilizzati in questo protocollo.

1. Modificare la sacca endovenosa (IV).
   1. Utilizzare una termosigillatrice in plastica per modificare una sacca per flebo per regolarne il volume e la forma, come illustrato nella Figura 1.
      NOTA: La forma della sacca facilita la disaerazione e consente di bloccare la sacca con un emostatico attraverso la linea del fluido^30,31. La posizione della linea di sigillatura viene scelta in base al volume di adescamento del VAD e del tubo per ottenere un volume di adescamento totale di 150 mL.
   2. Introdurre una presa d'aria praticando un'incisione di 4 mm nella parte superiore del sacchetto. Inserire un luer lock femmina spinato nell'incisione e sigillare il sito con adesivo in gomma siliconica RTV. Fissare un rubinetto unidirezionale al luer lock.
2. Assemblare il circuito di prova utilizzando la sacca per flebo modificata, il tubo in cloruro di polivinile (PVC), i connettori spinati in policarbonato e i rubinetti a 3 e 1 via, come mostrato nella Figura 1.
3. Collegare il manometro della pressione.
   1. Collegare le linee di prolunga da 6 pollici alle porte di pressione sul lato di ingresso e di uscita. Fissare un rubinetto unidirezionale all'altra estremità della linea di prolunga.
      NOTA: Il rubinetto consente di scollegare il tubo del manometro per adescare la linea di prolunga con il fluido prima di avviare la pompa, come descritto al punto 4.3.
   2. Collegare un'estremità di ciascun tubo con diametro interno (ID) da 1/8" a una punta del manometro e inserire un raccordo luer maschio all'altra estremità.
   3. Collegare i raccordi luer maschio ai rubinetti unidirezionali. Aprire i rubinetti per abilitare le letture della pressione.
4. Applicare una sonda di flusso a ultrasuoni clamp-on per misurare la portata.
5. Posizionare un morsetto Hoffman distalmente alla porta di pressione di uscita per regolare la resistenza al flusso.

2. Preparazione della soluzione di cloruro di calcio (CaCl₂)

1. Sciogliere il CaCl₂ in polvere in 1x soluzione salina tamponata con TRIS (pH 7,4) per preparare una soluzione 1 M. Evitare tamponi contenenti fosfato (ad es. PBS o DPBS) poiché il calcio e il fosfato reagiscono per formare un precipitato insolubile.
2. Se si prepara CaCl₂ in grandi quantità, aggiungere la polvere di CaCl₂ in modo incrementale in più passaggi, poiché la sua dissoluzione è un processo esotermico.
3. Titolare il pH della soluzione a 6-8 utilizzando acido cloridrico (HCl) o idrossido di sodio (NaOH) se necessario.

3. Preparazione del sangue

NOTA: Il sangue ovino utilizzato in questo studio è stato ottenuto da un fornitore commerciale elencato nella Tabella dei materiali. Il sangue è stato raccolto utilizzando un ago da 14 G, con l'animale trattenuto in una posizione eretta agricola standard. Il processo di raccolta ha richiesto 10-12 minuti dall'inserimento dell'ago al completamento. Il sangue è stato anticoagulato con 14 parti di CPD in 86 parti di sangue (formulazione CPD: 26,3 g/L di Na-citrato, 25,2 g di destrosio, 3 g/L di acido citrico e 2,2 g/L di Na fosfato in acqua deionizzata [DI]). La sacca di sangue è stata spedita durante la notte in un contenitore isolato con impacchi di ghiaccio ed è stata utilizzata per l'esperimento entro 24 ore dalla raccolta.

1. Preparare il sangue del donatore per l'uso.
   1. Posizionare la sacca di sangue su una piattaforma inclinabile per 15-30 minuti per mescolare delicatamente il sangue e lasciarlo raggiungere la temperatura ambiente (RT).
   2. Posizionare un'ancoretta magnetica in un becher o contenitore in policarbonato designato per il trasferimento del sangue.
   3. Trasferire il sangue nel becher attraverso un filtro trasfusionale per rimuovere i macroaggregati. Maneggiare il sangue con delicatezza per evitare danni ai componenti cellulari. Versare il sangue lungo le pareti del contenitore per evitare la caduta libera e ridurre al minimo i traumi cellulari.
      NOTA: Eliminare il sangue se sono presenti trombi di grandi dimensioni o se il filtro si ostruisce.
   4. Posizionare il becher o il contenitore su un agitatore magnetico e regolare la velocità fino a quando la superficie del sangue inizia a girare delicatamente senza formare un grande vortice. Mescolate continuamente per almeno 5 minuti.
   5. Misurare l'ematocrito e la conta piastrinica per assicurarsi che i valori rientrino nell'intervallo normale per la specie.
2. Eseguire le titolazioni per determinare la concentrazione target di CaCl₂ .
   NOTA: Il sangue citrato viene ricalcificato per consentire la coagulazione e i test della trombosi, con l'aggiunta di eparina per prevenire la coagulazione incontrollata. Il tempo di coagulazione attivato (ACT) target per l'inizio del test è di 300 s. Si prega di notare che i valori di ACT di riferimento forniti in questa sezione sono stati ottenuti utilizzando sangue di pecora donata e possono variare a seconda della specie e del livello di anticoagulante utilizzato durante la raccolta. Inoltre, le misure ACT possono variare tra gli strumenti 32,33,34. Potrebbero essere necessari alcuni tentativi ed errori per stabilire l'intervallo ACT ottimale per una specifica configurazione di laboratorio.
   1. Trasferire 2 mL della soluzione preparata di 1 M di CaCl₂ e 0,5 mL di eparina sodica (1000 U/mL) dalla confezione del produttore nelle provette per microcentrifuga per evitare la contaminazione delle soluzioni madre.
   2. Trasferire 10 mL di sangue in provette di polipropilene da 14 mL. Prepara quattro di questi tubi.
   3. Per ottenere una concentrazione di eparina di 0,5 U/mL nel sangue, aggiungere 5 μL di eparina sodica al campione di sangue da 10 mL.
   4. Per ottenere una concentrazione di calcio di 5 mM nel sangue, aggiungere 50 μL di soluzione di CaCl₂ 1 M al campione di sangue da 10 mL. Durante l'erogazione, agitare il puntale della pipetta per distribuire il CaCl₂ su un'area più ampia.
   5. Immediatamente, capovolgere il tubo 10 volte, arrotolarlo orizzontalmente (su una superficie piana o tra i palmi), quindi capovolgerlo altre 10 volte per garantire una miscelazione accurata.
   6. Misurare l'ACT utilizzando un sistema di coagulazione del sangue intero point-of-care seguendo le istruzioni del produttore. L'ACT iniziale varia in genere tra 400 e 500 s.
   7. Mantenendo costante la concentrazione di eparina, aumentare la concentrazione di CaCl₂ (a circa 7-8 mM) per ottenere un ACT di 300 s.
   8. Verificare la concentrazione finale e l'ACT risultante in una provetta di sangue separata.

4. Procedure preliminari al test

NOTA: Tutti i passaggi descritti in questa sezione si applicano alle Sezioni 5 e 6. Eseguire questi passaggi prima di azionare la pompa con albumina sierica bovina (BSA) o sangue nell'ansa. Trasferire il sangue tra i vasi utilizzando l'alimentazione per gravità per ridurre al minimo lo stress meccanico. Evitare di usare lo stantuffo della siringa per guidare il sangue, poiché ciò può creare una pressione eccessiva. Inoltre, evitare di strozzare il sangue attraverso aperture strette per evitare danni ai componenti cellulari.

1. Riempimento e svuotamento del circuito di prova
   1. Collegare una linea di prolunga da 30 pollici alla porta di iniezione e collegare un serbatoio siringa da 60 ml come imbuto. Aprire il rubinetto del serbatoio in modo che funga da presa d'aria.
   2. Versare il liquido nell'imbuto, sollevandolo secondo necessità per velocizzare la limatura. Riempi l'anello fino a 1-2 cm sotto la presa d'aria nella parte superiore della borsa. Chiudere i rubinetti della presa d'aria e della porta di iniezione.
   3. Per drenare, aprire i rubinetti della presa d'aria e della porta di iniezione e abbassare l'imbuto sotto il livello del banco. Sollevare la pompa sopra la porta di scarico per evacuare il fluido rimanente.
2. Disaerazione del ciclo di test
   NOTA: Eseguire questa procedura quando si riempie il circuito con BSA o sangue prima di avviare la pompa.
   1. Assicurarsi che non vi sia aria intrappolata in nessun punto del circuito. Rimuovi le bolle d'aria sulle superfici picchiettando e stringendo delicatamente il tubo e il serbatoio.
   2. Se si valuta una pompa del sangue a flusso assiale, ruotarla in posizione verticale per rilasciare l'aria attraverso la galleggiabilità. Se si utilizza una pompa centrifuga, capovolgerla e ruotarla per assicurarsi che l'aria non rimanga intrappolata nei percorsi del flusso secondario.
   3. Ispezionare attentamente le sezioni orizzontali dei tubi e le giunzioni tra tubi e connettori per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria.
   4. Spremere la sacca per flebo per avvicinare il livello del fluido alla parte stretta superiore e bloccare la sacca con un emostatico attraverso la linea del fluido per eliminare l'interfaccia fluido-aria. Chiudere il rubinetto di arresto della presa d'aria.
3. Adescamento delle linee di pressione e della porta di campionamento
   1. Chiudere il rubinetto all'estremità delle linee di pressione, rimuovere il tubo del manometro e collegare una siringa da 3 ml. Aprire il rubinetto e aspirare 1-2 ml di liquido nella linea di prolunga (circa 4 cm).
   2. Chiudere il rubinetto, staccare la siringa e ricollegare il tubo del manometro. Aprire il rubinetto per abilitare le letture della pressione.
   3. Adescare il sample porta utilizzando una siringa.
4. Pulizia delle porte di iniezione e campionamento
   1. Taglia o strappa una salvietta priva di lanugine in tre frammenti uguali. Ruota l'angolo di un frammento per formare una punta e inseriscilo nella porta per assorbire il sangue residuo.
   2. Attorcigliare il secondo frammento, inumidirlo con soluzione fisiologica e inserire la punta bagnata nella porta. Attorciglialo attorno alla porta per rimuovere tutto il sangue rimasto.
   3. Utilizzare il terzo frammento per assorbire l'eventuale soluzione salina residua nella porta.
      NOTA: Eseguire questa procedura di pulizia immediatamente dopo aver prelevato un campione di sangue o ogni volta che è presente sangue residuo nelle porte.

5. Passivazione delle superfici a contatto con il sangue

1. Riempire l'ansa con una soluzione di BSA all'1% e azionare il VAD per farlo circolare per almeno 30 minuti.
2. Ispezionare l'anello per verificare la presenza di perdite e rimontarlo se necessario.
3. Drenare completamente la soluzione di BSA per evitare l'emodiluizione.

6. Test della trombosi

1. Preparare il ciclo di prova.
   1. Riempire l'ansa con 150 ml di sangue.
   2. Disaerare il circuito e adescare le linee di pressione e la porta di campionamento come descritto nei passaggi 4.2-4.4.
   3. Avviare la pompa a bassa velocità e farla funzionare per circa 5 secondi per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate all'interno della pompa, quindi arrestare la pompa.
   4. Se compaiono delle bolle nel sacchetto, ripetere il passaggio 4.2 per eseguire nuovamente la disaerazione.
   5. Riavviare la pompa a bassa velocità per far circolare il sangue nel circuito.
2. Aggiungi eparina al sangue nell'ansa.
   1. Trasferire 1 mL di eparina sodica (1000 U/mL) e 1,5 mL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; 0,5 M) dalla confezione del produttore in provette separate per facilitarne la manipolazione durante il test.
   2. Utilizzare la porta trasversale del rubinetto a 3 vie per somministrare le sostanze nell'ansa utilizzando una siringa. Ruotare il luer lock maschio sul rubinetto in modo che la porta di iniezione sia rivolta verso l'alto per intrappolare le bolle d'aria nella parte superiore.
   3. Raggiungere una concentrazione di eparina di 0,5 U/mL nell'ansa aggiungendo 75 U di eparina sodica a 150 mL di sangue. Aspirare 75 U di eparina (75 μL se si utilizza una concentrazione di 1000 U/mL) in una micropipetta e dispensarla in una siringa da 3 mL dispensando contemporaneamente la pipetta e tirando lo stantuffo della siringa. Assicurarsi che tutto il liquido venga trasferito senza fuoriuscire.
   4. Collegare la siringa alla porta di iniezione tramite il luer lock, con la porta rivolta verso l'alto e la punta della siringa rivolta verticalmente verso il basso. Aspirare lo stantuffo della siringa per riempirla di sangue e mescolare l'eparina con il sangue aspirando l'aria nella siringa. Lasciare che la bolla d'aria salga verso l'alto della siringa. Iniettare la miscela nel circuito, assicurandosi che non entri aria.
   5. Far entrare e uscire il sangue dalla siringa 4-5 volte per assicurarsi che il sangue eparinizzato non rimanga confinato nello spazio della porta. Assicurarsi che l'aria non entri nel circuito.
3. Titola l'ATTO del sangue nell'ansa.
   1. Raggiungere una concentrazione iniziale di calcio di 5 mM nell'ansa aggiungendo 750 μL di soluzione di CaCl₂ 1 M a 150 mL di sangue utilizzando la stessa procedura dell'eparina.
      1. Il sangue esposto ad alte concentrazioni di calcio può iniziare a coagulare nella siringa. Iniettare rapidamente il fluido dopo aver rimosso l'aria residua. Facoltativamente, diluire il CaCl₂ nella siringa con 1 ml di soluzione salina tamponata con TRIS per ridurre il rischio di coagulazione prematura.
   2. Lasciare che il CaCl₂ iniettato circoli nell'ansa per almeno 2 minuti prima di prelevare un campione di sangue per misurare l'ACT iniziale.
   3. Collegare una siringa da 1 ml alla porta di campionamento. Prelevare ed eliminare 0,5 ml di sangue di scarto per eliminare il sangue stagnante dalla porta.
   4. Collegare una nuova siringa da 1 ml, prelevare 0,5 ml di sangue per l'analisi e misurare l'ACT. Pulire la porta di campionamento utilizzando la procedura descritta al punto 4.4.
   5. Fare riferimento ai valori di titolazione al punto 3.2 per indicare la concentrazione target di CaCl₂ . Aumentare in modo incrementale la concentrazione di calcio per ottenere un ACT di 300 s. Evitare di aggiungere l'intera quantità di CaCl₂ in una sola volta per evitare una rapida coagulazione.
      NOTA: Nei test utilizzati in questo studio, la concentrazione iniziale di calcio di 5 mM ha portato a un ACT di 450 ± 50 s e la concentrazione finale di 7-8 mM ha prodotto un ACT di 300 ± 20 s. Anche se questa risposta può variare, cerca di portare l'ACT a o al di sotto di 300 s per l'inizio del test.
4. Inizia il test.
   1. Una volta raggiunto l'ACT di 300 s nel ciclo, iniziare il test di 1 ora. Regolare la pompa alla portata e alla pressione desiderate modificando la velocità del rotore e regolando la resistenza utilizzando la fascetta Hoffman.
   2. Misurare l'ACT ogni 15 minuti seguendo i passaggi 6.3.3-6.3.4.
   3. Se l'ACT scende al di sotto di 200 s, iniettare altri 25 U di eparina sodica nel circuito.
5. Termina il test.
   1. Al termine di 1 ora, iniettare EDTA nell'ansa per inibire l'ulteriore coagulazione, mirando a una concentrazione finale di 5 mM nel sangue. (Iniettare 1,5 mL se si utilizza una soluzione di EDTA 0,5 M.)
   2. Lasciare circolare l'EDTA e mescolare per 2 minuti, quindi arrestare la pompa.
6. Scollegare e lavare la pompa.
   1. Clamp il tubo collegato all'ingresso e all'uscita della pompa utilizzando emostatici, posizionando i clamps a 3-4 cm di distanza dalle punte di ingresso e uscita.
   2. Scollegare con cautela il tubo per rilasciare la pompa.
   3. Drenare il sangue dalla pompa e defluire in un contenitore.
   4. Lavare il sangue residuo dalla pompa mediante alimentazione per gravità o pipettaggio di soluzione fisiologica attraverso l'ingresso e l'uscita della pompa.
      NOTA: i passaggi 6.7 e 6.8 vengono eseguiti contemporaneamente.
7. Ispezionare il percorso del flusso della pompa.
   1. Acquisisci immagini dell'ingresso e dell'uscita della pompa utilizzando una telecamera per endoscopio/boroscopio.
   2. Smontare la pompa (se applicabile). Lavare i componenti in un bagno salino e ispezionare la presenza di trombi utilizzando un cannocchiale da dissezione o una lente macro.
   3. Fotografare le superfici a contatto con il sangue per la documentazione.
      NOTA: Un'ispezione coerente e una documentazione approfondita sono fondamentali per i test comparativi.
8. Filtra il sangue usato.
   1. Taglia un pezzo di tessuto a rete di nylon da 100 μm abbastanza grande da coprire l'apertura di un contenitore di raccolta.
   2. Posizionare la rete sopra il contenitore con un leggero telo per consentire al sangue di fluire efficacemente attraverso di esso. Fissare i bordi della rete per evitare che scivoli durante la filtrazione.
   3. Passare il sangue usato attraverso una rete di nylon. Smaltire il sangue secondo le linee guida per la gestione dei rifiuti biologici dell'istituto.
   4. Esaminare la rete alla ricerca di trombi catturati e documentare i risultati.
9. Prepararsi per l'analisi istologica.
   1. Se è prevista un'analisi istologica, fissare eventuali trombi presenti nella soluzione di formalina seguendo le procedure di sicurezza appropriate.
      ATTENZIONE: Utilizzare sempre una cappa aspirante quando si maneggia la formaldeide.

7. Procedura di pulizia

1. Smontare il circuito di flusso. Gettare la sacca di sangue in PVC e il tubo.
2. Immergere tutti gli altri componenti a contatto con il sangue (connettori, rubinetti, luer lock, ecc.) in una soluzione detergente in polvere all'1% di enzima attivo per una notte. Sciacquare con acqua tiepida del rubinetto, seguita da acqua deionizzata e asciugare all'aria.
   1. Se rimangono coaguli, sonicare i componenti nella soluzione detergente. Risciacquare abbondantemente e asciugare all'aria.
3. Pulire la pompa.
   1. Se la pompa può essere smontata, immergere e sonicare i componenti a contatto con il sangue con una soluzione detergente/sgrassante multiuso all'1%, seguita da una soluzione detergente in polvere attiva all'1% per gli enzimi.
   2. Se la pompa non può essere smontata, collegarla a un nuovo circuito di flusso riempito con soluzioni detergenti e farla funzionare ad alta velocità per almeno 30 minuti. Ripetere se necessario.
4. Sciacquare accuratamente la pompa con acqua tiepida del rubinetto, seguita da acqua deionizzata e asciugare all'aria.

Risultati

L'esecuzione di questo protocollo consente l'identificazione di aree localizzate di deposizione piastrinica, rivelando punti problematici all'interno del percorso del flusso della pompa. L'applicazione coerente di questo protocollo consente miglioramenti incrementali affrontando questi "punti caldi" identificati.

Ad esempio, durante lo sviluppo del PediaFlow PF5 VAD, abbiamo riscontrato problemi nella lucidatura manuale del lato di pressione delle palette dell...

Discussione

La prima sperimentazione sull'uomo di una nuova pompa è sempre un'impresa precaria, poiché gli studi preclinici non possono prevedere in modo affidabile la trombogenicità dei VAD nell'uomo²⁶. In particolare, alcuni VAD che hanno dimostrato l'assenza di trombosi negli studi sugli animali hanno successivamente mostrato una significativa trombogenicità nell'uso clinico³⁶. Un aggressivo regime di test in vitro, specificamente proge...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr