In vitro Teste de trombose para dispositivos de assistência ventricular

Resumo

Apresentamos um protocolo de bancada para induzir trombose em dispositivos de assistência ventricular (DVA) dentro de uma plataforma de teste de recirculação. Este método serve para identificar pontos de acesso trombogênicos no caminho do fluxo sanguíneo e pode ajudar a melhorar a resistência à tromborresistência antes dos testes pré-clínicos em modelos animais.

Resumo

O risco de trombose continua sendo uma preocupação significativa no desenvolvimento e uso clínico de dispositivos de assistência ventricular (DVAs). As avaliações tradicionais da trombogenicidade do DVA, principalmente por meio de estudos em animais, são caras e demoradas, levantam preocupações éticas e, em última análise, podem não refletir com precisão os resultados humanos. Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um protocolo de teste in vitro agressivo projetado para provocar trombose e identificar possíveis áreas de alto risco no caminho do fluxo sanguíneo. Este protocolo, motivado pelo trabalho de Maruyama et al., emprega uma estratégia de anticoagulação modificada e utiliza componentes prontamente disponíveis, tornando-o acessível à maioria dos laboratórios que realizam exames de sangue in vitro de VADs. Demonstramos a utilidade desse método por meio de testes iterativos e refinamento de um VAD pediátrico em miniatura levitado magneticamente (PediaFlow PF5). O método tem sido eficaz na identificação de pontos críticos trombogênicos causados por falhas de projeto e fabricação nos primeiros protótipos de VAD, permitindo melhorias direcionadas antes de avançar para estudos em animais. Apesar de suas limitações, incluindo a ausência de fluxo pulsátil e a influência das características do sangue do doador, este protocolo serve como uma ferramenta prática para o desenvolvimento de DVA em estágio inicial e mitigação de riscos.

Introdução

Os dispositivos de assistência ventricular (DVA) tornaram-se um padrão de tratamento no tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca avançada, mas o risco de trombose e acidente vascular cerebral continua sendo um desafio significativo ^1,2. A trombose dentro dos VADs é normalmente avaliada durante estudos pré-clínicos em animais, que, embora valiosos, apresentam custos substanciais e desafios logísticos. Esses estudos consomem muitos recursos, são demorados e são suscetíveis a um único defeito que compromete todo o teste e necessita de ensaios adicionais. Isso não apenas aumenta a carga financeira, mas também levanta preocupações éticas devido à necessidade de testes repetidos em animais.

Embora existam muitos modelos numéricos para prever deposição de plaquetas e trombose 3,4,5,6, apenas alguns são adequados para simular a formação de trombos em dispositivos de macroescala, como VADs ^7,8,9. Além disso, os modelos existentes inevitavelmente assumem superfícies idealizadas e geometrias "estanques" simplificadas, que não refletem com precisão as complexidades e imperfeições dos conjuntos de bombas do mundo real. Quando as interações plaqueta-superfície são consideradas, esses modelos em macroescala geralmente empregam propriedades de material uniformemente prescritas (normalmente modeladas como um coeficiente nas condições de contorno do fluxo de superfície) ^{10 , 11 , 12} . Consequentemente, os modelos numéricos não podem substituir completamente os testes experimentais com sangue.

Tanto a escolha do material quanto o acabamento da superfície desempenham papéis críticos na adesão plaquetária nas superfícies VAD 13,14,15,16,17. Imperfeições como manchas ásperas ou irregularidades podem promover a adesão plaquetária e a formação de trombos. Além disso, fendas entre componentes no caminho do fluxo podem servir como um nidus para trombose, fornecendo ambientes protegidos onde os coágulos podem se formar e crescer^18,19. O uso de graxa, lubrificantes ou selantes durante a montagem também pode representar um risco, pois essas substâncias podem penetrar no caminho do fluxo e interagir com o sangue, aumentando ainda mais o risco de complicações.

Há, portanto, a necessidade de um protocolo de teste in vitro bem definido que possa avaliar de forma confiável a tromborresistência dos VADs antes de serem submetidos a testes em animais ou uso clínico. Embora exista um padrão ASTM amplamente adotado para a avaliação da hemólise²⁰, não existe tal padrão para o teste de trombogenicidade de VADs sob condições operacionais clinicamente relevantes²¹. Apesar de estudos seminais que datam de três décadas demonstrarem a viabilidade do teste de trombose in vitro para bombas de sangue^{22 , 23 , 24 , 25} , o teste em animais persistiu como a prática de fato para avaliar a trombose até o momento²⁶. O obstáculo para uma adoção mais ampla de métodos in vitro provavelmente tem sido a natureza complexa da coagulação, com a multiplicidade de fatores de confusão que podem influenciar os resultados dos testes, tornando difícil diferenciar a trombogenicidade intrínseca da bomba dos artefatos decorrentes de limitações metodológicas e erros de procedimento.

Isso nos motivou a compartilhar um protocolo detalhado como um guia para os experimentalistas evitarem armadilhas, promovendo assim o uso de testes in vitro e mitigando a dependência de estudos em animais. O protocolo aqui descrito, derivado de Maruyama et ^al.27, foi refinado e validado durante o projeto da DVA pediátrica PediaFlow (PF5) de^5ª geração^28,29. Este método de teste provou ser fundamental na identificação e abordagem sistemática de riscos trombogênicos potenciais nos protótipos VAD antes dos testes em animais.

Protocolo

O sangue total ovino usado neste estudo foi obtido de um fornecedor comercial e, portanto, não exigiu uma revisão pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cornell.

1. Construção do circuito de fluxo de teste

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista detalhada dos componentes do loop e todos os outros materiais usados neste protocolo.

1. Modifique a bolsa intravenosa (IV).
   1. Use um selador térmico de plástico para modificar uma bolsa IV para ajustar seu volume e forma, conforme ilustrado na Figura 1.
      NOTA: O formato da bolsa facilita a desaeração e permite que a bolsa seja pinçada com um hemostático através da linha de fluido^30,31. A localização da linha de vedação é escolhida com base no volume de escorva do VAD e da tubulação para atingir um volume total de escorva de 150 mL.
   2. Introduza uma saída de ar fazendo uma incisão de 4 mm na parte superior da bolsa. Insira uma trava luer fêmea farpada na incisão e sele o local com adesivo de borracha de silicone RTV. Fixe uma torneira unidirecional à trava luer.
2. Monte o circuito de teste usando a bolsa IV modificada, tubulação de cloreto de polivinila (PVC), conectores farpados de policarbonato e torneiras de 3 e 1 vias, conforme mostrado na Figura 1.
3. Conecte o manômetro de pressão.
   1. Conecte linhas de extensão de 6 polegadas às portas de pressão do lado de entrada e saída. Prenda uma torneira unidirecional na outra extremidade da linha de extensão.
      NOTA: A torneira permite desconectar a tubulação do manômetro para escorvar a linha de extensão com fluido antes de ligar a bomba, conforme descrito na etapa 4.3.
   2. Conecte uma extremidade de cada tubo de diâmetro interno (ID) de 1/8" a uma farpa do manômetro e insira um encaixe luer macho na outra extremidade.
   3. Conecte as conexões luer macho às torneiras unidirecionais. Abra as torneiras para permitir as leituras de pressão.
4. Aplique uma sonda de fluxo ultrassônica clamp-on para medir a taxa de fluxo.
5. Coloque um Hoffman clamp distal à porta de pressão de saída para regular a resistência ao fluxo.

2. Preparação da solução de cloreto de cálcio (CaCl₂)

1. Dissolva o CaCl₂ em pó em solução salina tamponada com 1x TRIS (pH 7,4) para preparar uma solução 1 M. Evite tampões contendo fosfato (por exemplo, PBS ou DPBS), pois o cálcio e o fosfato reagem para formar um precipitado insolúvel.
2. Se estiver preparando CaCl₂ em grandes quantidades, adicione o pó de CaCl₂ de forma incremental em várias etapas, pois sua dissolução é um processo exotérmico.
3. Titular o pH da solução para 6-8 usando ácido clorídrico (HCl) ou hidróxido de sódio (NaOH), se necessário.

3. Preparação de sangue

NOTA: O sangue ovino usado neste estudo foi obtido de um fornecedor comercial listado na Tabela de Materiais. O sangue foi coletado com agulha 14-G, com o animal contido em posição ortostática agrícola padrão. O processo de coleta levou de 10 a 12 minutos desde a inserção da agulha até a conclusão. O sangue foi anticoagulado com 14 partes de CPD para 86 partes de sangue (formulação de CPD: 26,3 g/L de Na-Citrato, 25,2 g de dextrose, 3 g/L de ácido cítrico e 2,2 g/L de Na-Fosfato em água deionizada [DI]). A bolsa de sangue foi enviada durante a noite em um recipiente isolado com bolsas de gelo e foi usada para o experimento dentro de 24 h após a coleta.

1. Prepare o sangue do doador para uso.
   1. Coloque a bolsa de sangue em uma plataforma basculante por 15 a 30 minutos para misturar o sangue suavemente e permitir que ele atinja a temperatura ambiente (RT).
   2. Coloque uma barra de agitação magnética em um béquer ou recipiente de policarbonato designado para a transferência de sangue.
   3. Transferir o sangue para o copo através de um filtro de transfusão para remover os macroagregados. Manuseie o sangue suavemente para evitar danos aos componentes celulares. Despeje o sangue ao longo das paredes do recipiente para evitar queda livre e minimizar o trauma celular.
      NOTA: Descarte o sangue se houver trombos grandes ou se o filtro entupir.
   4. Coloque o copo ou recipiente em um agitador magnético e ajuste a velocidade até que a superfície do sangue comece a girar suavemente sem formar um grande vórtice. Mexa continuamente por pelo menos 5 min.
   5. Meça o hematócrito e a contagem de plaquetas para garantir que os valores estejam dentro da faixa normal para a espécie.
2. Realize titulações para determinar a concentração alvo de CaCl₂ .
   NOTA: O sangue citrato é recalcificado para permitir o teste de coagulação e trombose, com heparina adicionada para evitar a coagulação descontrolada. O tempo de coagulação ativado (ACT) alvo para o início do teste é de 300 s. Observe que os valores de referência do ACT fornecidos nesta seção foram obtidos usando sangue de ovelha de doadores e podem variar dependendo da espécie e do nível de anticoagulação usado durante a coleta. Além disso, as medidas do TCA podem variar entre os instrumentos 32,33,34. Algumas tentativas e erros podem ser necessários para estabelecer a faixa ideal de ACT para uma configuração laboratorial específica.
   1. Transfira 2 mL da solução preparada de 1 M CaCl₂ e 0,5 mL de heparina sódica (1000 U / mL) da embalagem do fabricante para tubos de microcentrífuga para evitar a contaminação das soluções de estoque.
   2. Transfira 10 mL de sangue para tubos de ensaio de polipropileno de 14 mL. Prepare quatro desses tubos.
   3. Para atingir uma concentração de 0,5 U/mL de heparina no sangue, adicione 5 μL de heparina sódica à amostra de sangue de 10 mL.
   4. Para atingir uma concentração de cálcio de 5 mM no sangue, adicione 50 μL de solução de CaCl₂ 1 M à amostra de sangue de 10 mL. Durante a dispensação, gire a ponta da pipeta para distribuir o CaCl₂ em uma área mais ampla.
   5. Imediatamente, inverta o tubo 10 vezes, role-o horizontalmente (em uma superfície plana ou entre as palmas das mãos) e inverta mais 10 vezes para garantir uma mistura completa.
   6. Meça o ACT usando um sistema de coagulação de sangue total no local de atendimento seguindo as instruções do fabricante. O ACT inicial normalmente varia entre 400-500 s.
   7. Mantendo a concentração de heparina constante, aumente a concentração de CaCl₂ (para aproximadamente 7-8 mM) para atingir um ACT de 300 s.
   8. Verifique a concentração final e o TCA resultante em um tubo de sangue separado.

4. Procedimentos de pré-ensaio

NOTA: Todas as etapas descritas nesta seção se aplicam às Seções 5 e 6. Execute estas etapas antes de operar a bomba com albumina de soro bovino (BSA) ou sangue na alça. Transfira sangue entre vasos usando alimentação por gravidade para minimizar o estresse mecânico. Evite usar o êmbolo da seringa para conduzir o sangue, pois isso pode criar pressão excessiva. Além disso, evite estrangular o sangue através de aberturas estreitas para evitar danos aos componentes celulares.

1. Enchimento e drenagem do circuito de teste
   1. Conecte uma linha de extensão de 30 polegadas à porta de injeção e conecte um corpo de seringa de 60 mL como um funil. Abra a torneira do reservatório para atuar como uma saída de ar.
   2. Despeje o fluido no funil, levantando-o conforme necessário para acelerar o arquivamento. Encha o laço até 1-2 cm abaixo da saída de ar na parte superior da bolsa. Feche as torneiras da saída de ar e da porta de injeção.
   3. Para drenar, abra as torneiras da saída de ar e da porta de injeção e abaixe o funil abaixo do nível da bancada. Levante a bomba acima da porta de drenagem para evacuar o fluido restante.
2. Desarejar o loop de teste
   NOTA: Execute este procedimento ao preencher o circuito com BSA ou sangue antes de iniciar a bomba.
   1. Certifique-se de que não haja ar preso em nenhum lugar do circuito. Desaloje as bolhas de ar nas superfícies batendo e apertando suavemente a tubulação e o reservatório.
   2. Se estiver avaliando uma bomba de sangue de fluxo axial, gire-a para a posição vertical para liberar o ar por flutuabilidade. Se estiver usando uma bomba centrífuga, vire-a de cabeça para baixo e gire-a para garantir que nenhum ar fique preso nos caminhos de fluxo secundários.
   3. Inspecione de perto as seções horizontais da tubulação e as junções entre a tubulação e os conectores para garantir que não haja bolhas de ar.
   4. Aperte a bolsa IV para aproximar o nível do fluido da parte estreita superior e prenda a bolsa com um hemostático na linha de fluido para eliminar a interface fluido-ar. Feche a torneira de ventilação.
3. Preparação das linhas de pressão e da porta de amostragem
   1. Feche a torneira no final das linhas de pressão, remova a tubulação do manômetro e coloque uma seringa de 3 mL. Abra a torneira e puxe 1-2 mL de fluido para a linha de extensão (aproximadamente 4 cm).
   2. Feche a torneira, retire a seringa e reconecte o tubo do manômetro. Abra a torneira para permitir as leituras de pressão.
   3. Preparar a porta de amostragem com uma seringa.
4. Limpeza das portas de injeção e amostragem
   1. Corte ou rasgue um lenço sem fiapos em três fragmentos iguais. Torça o canto de um fragmento para formar uma ponta e insira-o na porta para absorver qualquer sangue residual.
   2. Torça o segundo fragmento, umedeça-o com soro fisiológico e insira a ponta úmida na porta. Torça-o ao redor da porta para remover todo o sangue restante.
   3. Use o terceiro fragmento para absorver qualquer solução salina residual na porta.
      NOTA: Execute este procedimento de limpeza imediatamente após a coleta de uma amostra de sangue ou sempre que houver sangue residual nas portas.

5. Passivando as superfícies de contato com o sangue

1. Encha o circuito com solução de BSA a 1% e opere o VAD para circulá-lo por pelo menos 30 min.
2. Inspecione o loop quanto a vazamentos e remonte, se necessário.
3. Drene a solução BSA completamente para evitar hemodiluição.

6. Teste de trombose

1. Prepare o loop de teste.
   1. Encha o circuito com 150 mL de sangue.
   2. Desar o circuito e preparar as linhas de pressão e a porta de amostragem conforme descrito nas etapas 4.2 a 4.4.
   3. Ligue a bomba em baixa velocidade e opere-a por cerca de 5 s para desalojar quaisquer bolhas de ar presas dentro da bomba e, em seguida, pare a bomba.
   4. Se aparecerem bolhas no saco, repita o passo 4.2 para realizar a desventilação novamente.
   5. Reinicie a bomba em baixa velocidade para circular o sangue no circuito.
2. Adicione heparina ao sangue na alça.
   1. Transfira 1 mL de heparina sódica (1000 U / mL) e 1,5 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA; 0,5 M) da embalagem do fabricante para tubos separados para facilitar o manuseio durante o teste.
   2. Use a porta transversal da torneira de 3 vias para administrar substâncias no laço usando uma seringa. Gire a trava luer macho na torneira de modo que a porta de injeção fique voltada para cima para reter as bolhas de ar na parte superior.
   3. Atinja uma concentração de heparina de 0,5 U/mL na alça adicionando 75 U de heparina sódica a 150 mL de sangue. Aspire 75 U de heparina (75 μL se estiver usando concentração de 1000 U / mL) em uma micropipeta e dispense-a em uma seringa de 3 mL dispensando simultaneamente a pipeta e puxando o êmbolo da seringa. Certifique-se de que todo o líquido seja transferido sem derramar.
   4. Encaixe a seringa na porta de injeção através da trava luer, com a porta voltada para cima e a ponta da seringa apontando verticalmente para baixo. Puxe o êmbolo da seringa para enchê-lo de sangue e misture a heparina com o sangue enquanto aspira o ar para a seringa. Deixe a bolha de ar subir até o topo da seringa. Injete a mistura no circuito, garantindo que nenhum ar entre.
   5. Transporte o sangue para dentro e para fora da seringa 4-5 vezes para garantir que o sangue heparinizado não fique confinado ao espaço na porta. Certifique-se de que nenhum ar entre no circuito.
3. Titular o ACT de sangue no loop.
   1. Atingir uma concentração inicial de cálcio de 5 mM na alça adicionando 750 μL de solução 1 M CaCl₂ a 150 mL de sangue usando o mesmo procedimento da heparina.
      1. O sangue exposto a altas concentrações de cálcio pode começar a coagular na seringa. Injete rapidamente o fluido após remover o ar residual. Opcionalmente, dilua o CaCl₂ na seringa com 1 ml de solução salina tamponada com TRIS para reduzir o risco de coagulação prematura.
   2. Deixe o CaCl₂ injetado circular no loop por pelo menos 2 minutos antes de coletar uma amostra de sangue para medir o TCA inicial.
   3. Conecte uma seringa de 1 mL à porta de amostragem. Retire e descarte 0,5 mL de sangue residual para limpar o sangue estagnado da porta.
   4. Conecte uma nova seringa de 1 mL, retire 0,5 mL de sangue para análise e meça o TCA. Limpe a porta de amostragem usando o procedimento na etapa 4.4.
   5. Consulte os valores de titulação na etapa 3.2 para informar a concentração alvo de CaCl₂ . Aumente gradualmente a concentração de cálcio para atingir um ACT de 300 s. Evite adicionar a quantidade total de CaCl₂ de uma só vez para evitar a coagulação rápida.
      NOTA: Nos testes utilizados neste estudo, a concentração inicial de cálcio de 5 mM resultou em TCA de 450 ± 50 s, e a concentração final de 7-8 mM rendeu TCA de 300 ± 20 s. Embora essa resposta possa variar, tente trazer o ACT para ou abaixo de 300 s para o início do teste.
4. Comece o teste.
   1. Assim que o ACT de 300 s for alcançado no loop, comece o teste de 1 h. Ajuste a bomba para a vazão e pressão desejadas modificando a velocidade do rotor e regulando a resistência usando o grampo Hoffman.
   2. Meça o ACT a cada 15 minutos seguindo as etapas 6.3.3-6.3.4.
   3. Se o ACT cair abaixo de 200 s, injete mais 25 U de heparina sódica na alça.
5. Finalize o teste.
   1. Ao final de 1 h, injete EDTA na alça para inibir a coagulação adicional, visando uma concentração final de 5 mM no sangue. (Injete 1,5 mL se estiver usando uma solução EDTA 0,5 M.)
   2. Deixe o EDTA circular e misture por 2 min, depois pare a bomba.
6. Desconecte e lave a bomba.
   1. Prenda a tubulação conectada à entrada e saída da bomba usando hemostáticos, posicionando as braçadeiras a 3-4 cm de distância das farpas de entrada e saída.
   2. Desconecte cuidadosamente a tubulação para liberar a bomba.
   3. Drene o sangue da bomba e flua para um recipiente.
   4. Lave qualquer sangue residual da bomba por gravidade ou pipetando solução salina através da entrada e saída da bomba.
      NOTA: As etapas 6.7 e 6.8 são executadas simultaneamente.
7. Inspecione o caminho do fluxo da bomba.
   1. Capture imagens da entrada e saída da bomba usando uma câmera de endoscópio/boroscópio.
   2. Desmonte a bomba (se aplicável). Lave os componentes em um banho de solução salina e inspecione se há trombos usando um escopo de dissecação ou lente macro.
   3. Fotografe superfícies de contato com o sangue para documentação.
      NOTA: Inspeção consistente e documentação completa são essenciais para testes comparativos.
8. Filtre o sangue usado.
   1. Corte um pedaço de tecido de malha de nylon de 100 μm grande o suficiente para cobrir a abertura de um recipiente de captura.
   2. Posicione a malha sobre o recipiente com uma leve cortina para permitir que o sangue flua através dela de forma eficaz. Prenda as bordas da malha para evitar que escorregue durante a filtração.
   3. Passe o sangue usado através de uma malha de nylon. Descarte o sangue de acordo com as diretrizes de manuseio de resíduos biológicos da instituição.
   4. Examine a malha em busca de trombos capturados e documente os achados.
9. Prepare-se para a análise histológica.
   1. Se a análise histológica for planejada, fixe quaisquer trombos encontrados na solução de formalina seguindo os procedimentos de segurança apropriados.
      CUIDADO: Sempre use uma hotte ao manusear formaldeído.

7. Procedimento de limpeza

1. Desmonte o loop de fluxo. Descarte a bolsa de sangue e o tubo de PVC.
2. Mergulhe todos os outros componentes em contato com o sangue (conectores, torneiras, travas luer, etc.) em uma solução de detergente em pó ativo com enzimas a 1% durante a noite. Enxágüe com água morna da torneira, seguida de água DI e seque ao ar.
   1. Se os coágulos permanecerem, sonice os componentes na solução detergente. Enxágue bem e seque ao ar.
3. Limpe a bomba.
   1. Se a bomba puder ser desmontada, mergulhe e sonice os componentes em contato com o sangue com uma solução de limpeza/desengraxante multiuso a 1%, seguida por uma solução de detergente em pó ativo com enzima a 1%.
   2. Se a bomba não puder ser desmontada, conecte-a a um novo circuito de fluxo cheio de soluções de limpeza e opere-a em alta velocidade por pelo menos 30 min. Repita conforme necessário.
4. Enxágue bem a bomba com água morna da torneira, seguida de água DI e seque ao ar.

Resultados

A execução bem-sucedida deste protocolo permite a identificação de áreas localizadas de deposição de plaquetas, revelando pontos problemáticos dentro do caminho de fluxo da bomba. A aplicação consistente deste protocolo permite melhorias incrementais ao abordar esses "pontos críticos" identificados.

Por exemplo, durante o desenvolvimento do PediaFlow PF5 VAD, encontramos desafios no polimento manual do lado da pressão das palhetas do estator devido...

Discussão

O primeiro teste em humanos de uma nova bomba é sempre um esforço precário, pois os estudos pré-clínicos não podem prever com segurança a trombogenicidade dos VADs em humanos²⁶. Notavelmente, alguns VADs que demonstraram ausência de trombose em ensaios com animais exibiram posteriormente trombogenicidade significativa no uso clínico³⁶. Um regime agressivo de testes in vitro projetado especificamente para provocar trombose ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr