In vitro Test de thrombose pour les dispositifs d’assistance ventriculaire

Résumé

Nous présentons un protocole de paillasse pour induire une thrombose dans des dispositifs d’assistance ventriculaire (DAV) au sein d’une plate-forme de test en recirculation. Cette méthode sert à identifier les points chauds thrombogènes dans le flux sanguin et peut aider à améliorer la thromborésistance avant les tests précliniques sur des modèles animaux.

Résumé

Le risque de thrombose reste une préoccupation importante dans le développement et l’utilisation clinique des dispositifs d’assistance ventriculaire (DAV). Les évaluations traditionnelles de la thrombogénicité de la DAV, principalement par le biais d’études animales, sont coûteuses et prennent du temps, soulèvent des préoccupations éthiques et, en fin de compte, peuvent ne pas refléter avec précision les résultats humains. Pour remédier à ces limites, nous avons développé un protocole de test in vitro agressif conçu pour provoquer une thrombose et identifier les zones potentiellement à haut risque dans la voie du flux sanguin. Ce protocole, motivé par les travaux de Maruyama et al., utilise une stratégie d’anticoagulation modifiée et utilise des composants facilement disponibles, ce qui le rend accessible à la plupart des laboratoires effectuant des tests sanguins in vitro des DAV. Nous avons démontré l’utilité de cette méthode par des tests itératifs et le perfectionnement d’un DAV pédiatrique miniature à lévitation magnétique (PediaFlow PF5). La méthode s’est avérée efficace pour identifier les points chauds thrombogènes causés par des défauts de conception et de fabrication dans les premiers prototypes de DAV, ce qui a permis d’apporter des améliorations ciblées avant de passer à des études animales. Malgré ses limites, notamment l’absence de flux pulsatile et l’influence des caractéristiques du sang du donneur, ce protocole sert d’outil pratique pour le développement précoce de la DAV et l’atténuation des risques.

Introduction

Les dispositifs d’assistance ventriculaire (DAV) sont devenus une norme de soins dans la prise en charge des patients atteints d’insuffisance cardiaque avancée, mais le risque de thrombose et d’accident vasculaire cérébral reste un défi important ^1,2. La thrombose au sein des DAV est généralement évaluée au cours d’études précliniques sur des animaux, qui, bien que précieuses, présentent des coûts et des défis logistiques substantiels. Ces études sont gourmandes en ressources, prennent du temps et sont susceptibles d’être défectueuses d’un seul défaut, ce qui compromet l’ensemble de l’essai et nécessite des essais supplémentaires. Cela augmente non seulement le fardeau financier, mais soulève également des préoccupations éthiques en raison de la nécessité de tests répétés sur les animaux.

Bien qu’il existe de nombreux modèles numériques pour prédire le dépôt de plaquettes et la thrombose 3,4,5,6, seuls quelques-uns conviennent pour simuler la formation de thrombus dans des dispositifs à grande échelle tels que les DAV ^7,8,9. De plus, les modèles existants supposent inévitablement des surfaces idéalisées et des géométries « étanches » simplifiées, qui ne reflètent pas avec précision les complexités et les imperfections des assemblages de pompes du monde réel. Lorsque les interactions plaquettes-surface sont prises en compte, ces modèles à macro-échelle utilisent généralement des propriétés de matériau uniformément prescrites (généralement modélisées sous la forme d’un coefficient dans les conditions limites de flux de surface)10,11,12. Par conséquent, les modèles numériques ne peuvent pas remplacer complètement les tests expérimentaux avec du sang.

Le choix du matériau et la finition de surface jouent tous deux un rôle essentiel dans l’adhérence plaquettaire sur les surfaces VAD 13,14,15,16,17. Des imperfections telles que des rugosités ou des irrégularités peuvent favoriser l’adhésion des plaquettes et la formation de thrombus. De plus, les crevasses entre les composants de la voie d’écoulement peuvent servir de nidus pour la thrombose, fournissant des environnements protégés où des caillots peuvent se former et se développer^18,19. L’utilisation de graisse, de lubrifiants ou de produits d’étanchéité lors de l’assemblage peut également présenter un risque, car ces substances peuvent s’infiltrer dans la voie d’écoulement et interagir avec le sang, ce qui augmente encore le risque de complications.

Il est donc nécessaire de disposer d’un protocole de test in vitro bien défini capable d’évaluer de manière fiable la thromborésistance des DAV avant qu’ils ne soient soumis à des tests sur des animaux ou à une utilisation clinique. Bien qu’il existe une norme ASTM largement adoptée pour l’évaluation de l’hémolyse²⁰, il n’existe aucune norme de ce type pour les tests de thrombogénicité des DAV dans des conditions de fonctionnement cliniquement pertinentes²¹. Malgré des études fondamentales datant de trois décennies démontrant la faisabilité des tests de thrombose in vitro pour les pompes à sang 22,23,24,25, l’expérimentation animale a persisté comme pratique de facto pour évaluer la thrombose à ce jour ²⁶. L’obstacle à l’adoption plus large des méthodes in vitro a probablement été la nature complexe de la coagulation, avec la multitude de facteurs confondants qui peuvent influencer les résultats des tests, ce qui rend difficile la différenciation de la thrombogénicité intrinsèque de la pompe des artefacts résultant de limitations méthodologiques et d’erreurs de procédure.

Cela nous a motivés à partager un protocole détaillé comme guide pour les expérimentateurs afin d’éviter les pièges, favorisant ainsi l’utilisation des tests in vitro et atténuant la dépendance aux études animales. Le protocole décrit ici, dérivé de Maruyama et ^al.27, a été affiné et validé lors de la conception de la 5^e génération de PediaFlow (PF5) VAD^{pédiatrique 28,29}. Cette méthode d’essai s’est avérée déterminante pour identifier et traiter systématiquement les risques thrombogènes potentiels dans les prototypes de DAV avant les tests sur les animaux.

Protocole

Le sang total ovin utilisé dans cette étude a été obtenu auprès d’un vendeur commercial et, par conséquent, n’a pas nécessité d’examen par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Cornell.

1. Construction de la boucle d’écoulement d’essai

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour une liste détaillée des composants de boucle et de tous les autres matériaux utilisés dans ce protocole.

1. Modifiez le sac intraveineux (IV).
   1. Utilisez une thermosoudeuse en plastique pour modifier un sac IV afin d’ajuster son volume et sa forme, comme illustré à la figure 1.
      REMARQUE : La forme du sac facilite la désaération et permet de serrer le sac avec un hémostat sur la ligne de fluide ^30,31. L’emplacement de la ligne d’étanchéité est choisi en fonction du volume d’amorçage du DAV et du tube pour atteindre un volume total d’amorçage de 150 ml.
   2. Introduisez une bouche d’aération en faisant une incision de 4 mm en haut du sac. Insérez un verrou Luer femelle barbelé dans l’incision et scellez le site avec un adhésif en caoutchouc de silicone RTV. Fixez un robinet d’arrêt unidirectionnel à la serrure Luer.
2. Assemblez la boucle d’essai à l’aide du sac IV modifié, du tube en polychlorure de vinyle (PVC), des connecteurs cannelés en polycarbonate et des robinets d’arrêt à 3 voies et à 1 voie, comme illustré à la figure 1.
3. Connectez le manomètre de pression.
   1. Fixez des lignes d’extension de 6 pouces aux orifices de pression d’entrée et de sortie. Fixez un robinet d’arrêt unidirectionnel à l’autre extrémité de la ligne d’extension.
      REMARQUE : Le robinet d’arrêt permet de déconnecter le tube du manomètre pour amorcer la ligne d’extension avec du liquide avant de démarrer la pompe, comme décrit à l’étape 4.3.
   2. Connectez une extrémité de chaque tube de 1/8" de diamètre intérieur (ID) à une barbillon de manomètre et insérez un raccord Luer mâle à l’autre extrémité.
   3. Connectez les raccords Luer mâles aux robinets d’arrêt unidirectionnels. Ouvrez les robinets d’arrêt pour activer les lectures de pression.
4. Appliquez une sonde de débit à ultrasons pour mesurer le débit.
5. Placez une pince Hoffman distale à l’orifice de pression de sortie pour réguler la résistance à l’écoulement.

2. Préparation de la solution de chlorure de calcium (CaCl₂)

1. Dissoudre le CaCl₂ en poudre dans 1 solution saline tamponnée TRIS (pH 7,4) pour préparer une solution à 1 M. Évitez les tampons contenant du phosphate (par exemple, PBS ou DPBS), car le calcium et le phosphate réagissent pour former un précipité insoluble.
2. Si vous préparez du CaCl₂ en grande quantité, ajoutez la poudre de CaCl₂ progressivement en plusieurs étapes, car sa dissolution est un processus exothermique.
3. Ajustez le pH de la solution à 6-8 en utilisant de l’acide chlorhydrique (HCl) ou de l’hydroxyde de sodium (NaOH) si nécessaire.

3. Préparation du sang

REMARQUE : Le sang d’ovin utilisé dans cette étude a été obtenu auprès d’un fournisseur commercial dont le nom figure dans la table des matières. Le sang a été prélevé à l’aide d’une aiguille 14-G, l’animal étant immobilisé dans une position debout agricole standard. Le processus de collecte a pris 10 à 12 minutes entre l’insertion de l’aiguille et la fin. Le sang a été anticoagulé avec 14 parties de CPD pour 86 parties de sang (formulation CPD : 26,3 g/L de Na-citrate, 25,2 g de dextrose, 3 g/L d’acide citrique et 2,2 g/L de Na phosphate dans de l’eau désionisée). La poche de sang a été expédiée pendant la nuit dans un conteneur isotherme avec des blocs réfrigérants et a été utilisée pour l’expérience dans les 24 heures suivant la collecte.

1. Préparez le sang du donneur pour l’utilisation.
   1. Placez la poche de sang sur une plate-forme basculante pendant 15 à 30 minutes pour mélanger doucement le sang et lui permettre d’atteindre la température ambiante (RT).
   2. Placez une barre d’agitation magnétique dans un bécher en polycarbonate ou un récipient conçu pour le transfert de sang.
   3. Transférez le sang dans le bécher à travers un filtre de transfusion pour éliminer les macroagrégats. Manipulez le sang avec précaution pour éviter d’endommager les composants cellulaires. Versez le sang le long des parois du récipient pour éviter la chute libre et minimiser les traumatismes cellulaires.
      REMARQUE : Jetez le sang si de gros thrombus sont présents ou si le filtre se bouche.
   4. Placez le bécher ou le récipient sur un agitateur magnétique et ajustez la vitesse jusqu’à ce que la surface du sang commence à tourner doucement sans former un gros vortex. Remuez continuellement pendant au moins 5 min.
   5. Mesurez l’hématocrite et le nombre de plaquettes pour vous assurer que les valeurs se situent dans la plage normale pour l’espèce.
2. Effectuer des titrages pour déterminer la concentration cible de CaCl₂ .
   REMARQUE : Le sang citraté est recalcifié pour permettre les tests de coagulation et de thrombose, avec de l’héparine ajoutée pour éviter l’emballement de la coagulation. Le temps de coagulation activé cible (ACT) pour le début de l’essai est de 300 s. Veuillez noter que les valeurs ACT de référence fournies dans cette section ont été obtenues à partir de sang de mouton de donneur et peuvent varier en fonction de l’espèce et du niveau d’anticoagulation utilisé lors du prélèvement. De plus, les mesures de l’ACT peuvent varier entre les instruments^{32, 33 et 34}. Il peut être nécessaire de faire quelques essais et erreurs pour établir la plage ACT optimale pour une configuration de laboratoire spécifique.
   1. Transvaser 2 mL de la solution préparée de 1 M CaCl₂ et 0,5 mL d’héparine sodique (1000 U/mL) de l’emballage du fabricant dans des tubes de microcentrifugation pour éviter la contamination des solutions mères.
   2. Transvasez 10 ml de sang dans des tubes à essai en polypropylène de 14 ml. Préparez quatre tubes de ce type.
   3. Pour atteindre une concentration d’héparine de 0,5 U/mL dans le sang, ajoutez 5 μL d’héparine sodique à l’échantillon de sang de 10 mL.
   4. Pour obtenir une concentration de calcium de 5 mM dans le sang, ajoutez 50 μL de solution de 1 M de CaCl₂ à l’échantillon de sang de 10 mL. Pendant la distribution, faites tourner la pointe de la pipette pour répartir le CaCl₂ sur une zone plus large.
   5. Immédiatement, retournez le tube 10 fois, roulez-le horizontalement (sur une surface plane ou entre les paumes), puis retournez-le 10 fois de plus pour assurer un mélange complet.
   6. Mesurez l’ACT à l’aide d’un système de coagulation du sang total au point de service en suivant les instructions du fabricant. L’ACT initial se situe généralement entre 400 et 500 s.
   7. Tout en maintenant la concentration d’héparine constante, augmentez la concentration de CaCl₂ (à environ 7-8 mM) pour obtenir un ACT de 300 s.
   8. Vérifiez la concentration finale et l’ACT résultant dans un tube de sang séparé.

4. Procédures de pré-test

REMARQUE : Toutes les étapes décrites dans cette section s’appliquent aux sections 5 et 6. Effectuez ces étapes avant d’actionner la pompe avec de l’albumine sérique bovine (BSA) ou du sang dans la boucle. Transférez le sang entre les vaisseaux en utilisant l’alimentation par gravité pour minimiser les contraintes mécaniques. Évitez d’utiliser le piston de la seringue pour faire circuler le sang, car cela peut créer une pression excessive. De plus, évitez d’étrangler le sang à travers des ouvertures étroites pour éviter d’endommager les composants cellulaires.

1. Remplissage et vidange de la boucle d’essai
   1. Fixez une rallonge de 30 pouces à l’orifice d’injection et connectez un corps de seringue de 60 ml comme un entonnoir. Ouvrez le robinet d’arrêt du réservoir pour qu’il fasse office de bouche d’aération.
   2. Versez le liquide dans l’entonnoir, en le soulevant au besoin pour accélérer le limage. Remplissez la boucle jusqu’à 1 à 2 cm sous la bouche d’aération en haut du sac. Fermez les robinets de la bouche d’aération et de l’orifice d’injection.
   3. Pour vidanger, ouvrez les robinets de la bouche d’aération et de l’orifice d’injection et abaissez l’entonnoir sous le niveau de la paillasse. Soulevez la pompe au-dessus de l’orifice de drainage pour évacuer le liquide restant.
2. Désaération de la boucle d’essai
   REMARQUE : Effectuez cette procédure lors du remplissage de la boucle avec du BSA ou du sang avant de démarrer la pompe.
   1. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’air emprisonné dans la boucle. Délogez les bulles d’air sur les surfaces en tapotant et en pressant doucement le tube et le réservoir.
   2. Si vous évaluez une pompe sanguine à flux axial, faites-la pivoter en position verticale pour libérer l’air par flottabilité. Si vous utilisez une pompe centrifuge, retournez-la et faites-la pivoter pour vous assurer qu’aucun air n’est emprisonné dans les voies d’écoulement secondaires.
   3. Inspectez de près les sections horizontales des tubes et les jonctions entre les tubes et les connecteurs pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air.
   4. Pressez le sac IV pour rapprocher le niveau de liquide de la partie étroite supérieure et fixez le sac avec un hémostat sur la conduite de fluide pour éliminer l’interface fluide-air. Fermez le robinet d’arrêt de la bouche d’aération.
3. Amorçage des conduites de pression et de l’orifice d’échantillonnage
   1. Fermez le robinet d’arrêt à l’extrémité des conduites de pression, retirez le tube du manomètre et fixez une seringue de 3 ml. Ouvrez le robinet d’arrêt et aspirez 1 à 2 ml de liquide dans la ligne d’extension (environ 4 cm).
   2. Fermez le robinet d’arrêt, détachez la seringue et reconnectez le tube du manomètre. Ouvrez le robinet d’arrêt pour activer les lectures de pression.
   3. Amorcez l’orifice d’échantillonnage à l’aide d’une seringue.
4. Nettoyage des orifices d’injection et de prélèvement
   1. Coupez ou déchirez une lingette non pelucheuse en trois fragments égaux. Tournez le coin d’un fragment pour former une pointe et insérez-le dans le port pour absorber tout sang résiduel.
   2. Tournez le deuxième fragment, humidifiez-le avec une solution saline et insérez la pointe humide dans le port. Tournez-le autour du port pour éliminer tout le sang restant.
   3. Utilisez le troisième fragment pour absorber toute solution saline résiduelle dans le port.
      REMARQUE : Effectuez cette procédure de nettoyage immédiatement après avoir prélevé un échantillon de sang ou chaque fois que du sang résiduel est présent dans les ports.

5. Passivation des surfaces en contact avec le sang

1. Remplissez la boucle avec une solution BSA à 1 % et actionnez le VAD pour la faire circuler pendant au moins 30 min.
2. Inspectez la boucle pour détecter les fuites et remontez-la si nécessaire.
3. Égouttez complètement la solution BSA pour éviter l’hémodilution.

6. Test de thrombose

1. Préparez la boucle de test.
   1. Remplissez la boucle avec 150 ml de sang.
   2. Désaérez la boucle et amorcez les conduites de pression et l’orifice d’échantillonnage comme décrit aux étapes 4.2 à 4.4.
   3. Démarrez la pompe à basse vitesse et faites-la fonctionner pendant environ 5 secondes pour déloger les bulles d’air emprisonnées à l’intérieur de la pompe, puis arrêtez la pompe.
   4. Si des bulles apparaissent dans le sac, répétez l’étape 4.2 pour effectuer à nouveau le désaération.
   5. Redémarrez la pompe à basse vitesse pour faire circuler le sang dans la boucle.
2. Ajoutez de l’héparine au sang dans la boucle.
   1. Transvaser 1 mL d’héparine sodique (1000 U/mL) et 1,5 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA ; 0,5 M) de l’emballage du fabricant dans des tubes séparés pour faciliter la manipulation pendant l’essai.
   2. Utilisez l’orifice transversal du robinet d’arrêt à 3 voies pour administrer des substances dans la boucle à l’aide d’une seringue. Tournez le luer lock mâle sur le robinet d’arrêt de sorte que l’orifice d’injection soit orienté vers le haut pour piéger les bulles d’air en haut.
   3. Atteignez une concentration d’héparine de 0,5 U/mL dans la boucle en ajoutant 75 U d’héparine sodique à 150 mL de sang. Aspirez 75 U d’héparine (75 μL si vous utilisez une concentration de 1000 U/mL) dans une micropipette et distribuez-le dans une seringue de 3 ml en distribuant simultanément la pipette et en tirant le piston de la seringue. Assurez-vous que tout le liquide est transféré sans renversement.
   4. Fixez la seringue à l’orifice d’injection à l’aide du verrou Luer, l’orifice vers le haut et l’embout de la seringue pointant verticalement vers le bas. Tirez le piston de la seringue pour le remplir de sang et mélangez l’héparine avec le sang tout en aspirant de l’air dans la seringue. Laissez la bulle d’air remonter vers le haut de la seringue. Injectez le mélange dans la boucle en veillant à ce qu’aucun air n’y pénètre.
   5. Faites entrer et sortir le sang de la seringue 4 à 5 fois pour vous assurer que le sang hépariné ne reste pas confiné à l’espace dans le port. Assurez-vous qu’aucun air ne pénètre dans la boucle.
3. Titrez l’ACT du sang dans l’anse.
   1. Atteindre une concentration initiale de calcium de 5 mM dans l’anse en ajoutant 750 μL de solution de 1 M de CaCl₂ à 150 mL de sang en utilisant la même procédure que l’héparine.
      1. Le sang exposé à des concentrations élevées de calcium peut commencer à coaguler dans la seringue. Injectez rapidement le liquide après avoir éliminé l’air résiduel. En option, diluez le CaCl₂ dans la seringue avec 1 ml de solution saline tamponnée TRIS pour réduire le risque de coagulation prématurée.
   2. Laissez le CaCl₂ injecté circuler dans la boucle pendant au moins 2 minutes avant de prélever un échantillon de sang pour mesurer l’ACT initial.
   3. Fixez une seringue de 1 mL à l’orifice d’échantillonnage. Prélevez et jetez 0,5 mL de sang perdu pour éliminer le sang stagnant de l’orifice.
   4. Fixez une nouvelle seringue de 1 ml, prélevez 0,5 ml de sang pour l’analyse et mesurez l’ACT. Nettoyez l’orifice d’échantillonnage en suivant la procédure décrite à l’étape 4.4.
   5. Reportez-vous aux valeurs de titrage de l’étape 3.2 pour informer la concentration cible de CaCl₂ . Augmentez progressivement la concentration de calcium pour obtenir un ACT de 300 s. Évitez d’ajouter la quantité totale de CaCl₂ en une seule fois pour éviter une coagulation rapide.
      REMARQUE : Dans les essais utilisés dans cette étude, la concentration initiale de calcium de 5 mM a donné un ACT de 450 ± 50 s, et la concentration finale de 7-8 mM a donné un ACT de 300 ± 20 s. Bien que cette réponse puisse varier, essayez de ramener l’ACT à 300 s ou moins pour le début du test.
4. Commencez le test.
   1. Une fois que l’ACT de 300 s est atteint dans la boucle, commencez le test de 1 h. Ajustez la pompe au débit et à la pression souhaités en modifiant la vitesse du rotor et en régulant la résistance à l’aide de la pince Hoffman.
   2. Mesurez l’ACT toutes les 15 minutes en suivant les étapes 6.3.3-6.3.4.
   3. Si l’ACT descend en dessous de 200 s, injectez 25 U supplémentaires d’héparine sodique dans la boucle.
5. Terminez le test.
   1. Au bout de 1 h, injecter de l’EDTA dans l’anse pour inhiber la coagulation, en ciblant une concentration finale de 5 mM dans le sang. (Injecter 1,5 mL si vous utilisez une solution d’EDTA 0,5 M.)
   2. Laissez l’EDTA circuler et mélanger pendant 2 min, puis arrêtez la pompe.
6. Débranchez et rincez la pompe.
   1. Clampez le tube relié à l’entrée et à la sortie de la pompe à l’aide d’hémostats, en positionnant les pinces à 3-4 cm des ardillons d’entrée et de sortie.
   2. Débranchez soigneusement le tube pour libérer la pompe.
   3. Videz le sang de la pompe et de la boucle d’écoulement dans un récipient.
   4. Lavez tout sang résiduel de la pompe par alimentation par gravité ou par pipetage de solution saline à l’entrée et à la sortie de la pompe.
      REMARQUE : Les étapes 6.7 et 6.8 sont exécutées simultanément.
7. Inspectez le chemin d’écoulement de la pompe.
   1. Capturez des images de l’entrée et de la sortie de la pompe à l’aide d’un endoscope/caméra endoscopique.
   2. Démontez la pompe (le cas échéant). Lavez les composants dans un bain salin et inspectez les thrombus à l’aide d’une lunette de dissection ou d’une lentille macro.
   3. Photographier les surfaces en contact avec le sang pour la documentation.
      REMARQUE : Une inspection cohérente et une documentation complète sont essentielles pour les essais comparatifs.
8. Filtrez le sang utilisé.
   1. Coupez un morceau de tissu en maille de nylon de 100 μm assez grand pour couvrir l’ouverture d’un récipient de capture.
   2. Placez le filet sur le récipient avec un léger drapé pour permettre au sang de circuler efficacement. Fixez les bords de la maille pour éviter qu’elle ne glisse lors de la filtration.
   3. Faites passer le sang utilisé à travers une maille en nylon. Éliminer le sang conformément aux directives de l’établissement en matière de gestion des déchets biologiques.
   4. Examinez le treillis à la recherche de thrombus capturés et documentez les résultats.
9. Préparez-vous à l’analyse histologique.
   1. Si une analyse histologique est prévue, corrigez tout thrombus trouvé dans la solution de formol en suivant les procédures de sécurité appropriées.
      ATTENTION : Utilisez toujours une hotte lorsque vous manipulez du formaldéhyde.

7. Procédure de nettoyage

1. Démontez la boucle d’écoulement. Jetez la poche de sang et la tubulure en PVC.
2. Faites tremper tous les autres composants en contact avec le sang (connecteurs, robinets, luer locks, etc.) dans une solution détergente en poudre à 1 % d’enzymes pendant la nuit. Rincer à l’eau tiède du robinet, puis à l’eau DI, et sécher à l’air.
   1. S’il reste des caillots, sonicer les composants dans la solution détergente. Rincez abondamment et séchez à l’air.
3. Nettoyez la pompe.
   1. Si la pompe peut être démontée, trempez et sonicez les composants en contact avec le sang avec une solution nettoyante/dégraissante tout usage à 1 %, suivie d’une solution détergente en poudre active à 1 %.
   2. Si la pompe ne peut pas être démontée, connectez-la à une nouvelle boucle d’écoulement remplie de solutions de nettoyage et faites-la fonctionner à grande vitesse pendant au moins 30 min. Répétez l’opération si nécessaire.
4. Rincez abondamment la pompe avec de l’eau tiède du robinet, puis de l’eau DI, et séchez-la à l’air.

Résultats

L’exécution réussie de ce protocole permet d’identifier des zones localisées de dépôt plaquettaire, révélant des points problématiques dans le chemin d’écoulement de la pompe. L’application uniforme de ce protocole permet d’apporter des améliorations progressives en s’attaquant à ces « points chauds » identifiés.

Par exemple, lors du développement du VAD PediaFlow PF5, nous avons rencontré des difficultés pour polir manuellement le...

Discussion

Le premier essai chez l’homme d’une nouvelle pompe est toujours une entreprise précaire, car les études précliniques ne peuvent pas prédire de manière fiable la thrombogénicité des DAV chez l’homme²⁶. Notamment, certains DAV qui ont démontré l’absence de thrombose dans les essais sur les animaux ont par la suite montré une thrombogénicité significative lors d’une utilisation clinique³⁶. Un régime de test in vitro<...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr