体外研究 心室辅助装置的血栓形成试验

摘要

我们提出了一种台式方案，用于在再循环测试平台内的心室辅助装置 （VAD） 中诱导血栓形成。该方法用于识别血流路径中的血栓形成热点，并有助于在动物模型的临床前测试之前提高血栓抵抗力。

摘要

血栓形成的风险仍然是心室辅助装置 （VAD） 开发和临床使用中的一个重要问题。主要通过动物研究对 VAD 血栓形成性进行的传统评估既昂贵又耗时，会引起伦理问题，最终可能无法准确反映人类结果。为了解决这些限制，我们开发了一种积极的 体外 检测方案，旨在引发血栓形成并确定血流路径中潜在的高风险区域。该协议由 Maruyama 等人的工作推动，采用改进的抗凝策略并利用现成的组件，使其可供 大多数进行 VAD 体外血液检测的实验室使用。我们通过对微型磁悬浮儿科 VAD （PediaFlow PF5） 的迭代测试和改进证明了这种方法的实用性。该方法可有效识别早期 VAD 原型中设计和制造缺陷引起的血栓形成热点，从而在进入动物研究之前进行有针对性的改进。尽管存在其局限性，包括没有搏动流和供体血液特性的影响，但该方案可作为早期 VAD 开发和风险缓解的实用工具。

引言

心室辅助装置 （VAD） 已成为晚期心力衰竭患者管理的护理标准，但血栓形成和中风的风险仍然是一个重大挑战 ^1,2。VAD 内的血栓形成通常在临床前动物研究中进行评估，这虽然很有价值，但会带来巨大的成本和物流挑战。这些研究是资源密集型的、耗时的，并且容易受到单个缺陷的影响，从而影响整个测试并需要额外的试验。这不仅增加了经济负担，而且由于需要反复进行动物试验，还引发了道德问题。

尽管有许多数值模型可用于预测血小板沉积和血栓形成 3,4,5,6，^但只有少数模型适合在 VAD 7、8、9 等宏观设备中模拟血栓形成。此外，现有模型不可避免地会假设理想化的表面和简化的“水密”几何形状，这并不能准确反映真实世界泵组件的复杂性和缺陷。当考虑片状-表面相互作用时，这些宏观尺度模型通常采用统一规定的材料属性（通常建模为表面通量边界条件中的系数）10,11,12。因此，数值模型不能完全替代血液实验测试。

材料选择和表面光洁度在 VAD 表面的血小板粘附中起着关键作用^{13、14、15、16、17}。粗糙点或不规则等缺陷会促进血小板粘附和血栓形成。此外，流路中组分之间的裂缝可以作为血栓形成的病灶，为凝块形成和生长提供受保护的环境^18,19。在组装过程中使用油脂、润滑剂或密封剂也会带来风险，因为这些物质可能会渗入流路并与血液相互作用，从而进一步增加并发症的风险。

因此，需要一个明确的体外检测方案，该方案可以在进行动物试验或临床使用之前可靠地评估 VAD 的血栓形成耐受性。虽然有一个广泛采用的 ASTM 标准来评估溶血²⁰，但在临床相关作条件下 VAD 的血栓形成性测试没有这样的标准²¹。尽管可追溯到三十年前的开创性研究表明对血泵进行体外血栓形成检测的可行性 22,23,24,25，但迄今为止，动物试验一直是评估血栓形成的事实做法²⁶。更广泛采用体外方法的障碍可能是凝血的复杂性，有许多混杂因素会影响测试结果，这使得区分内在泵血栓形成性与由于方法学限制和程序错误而产生的伪影变得具有挑战性。

这促使我们分享一个详细的方案，作为实验人员避免陷阱的指南，从而促进体外测试的使用并减少对动物研究的依赖。此处描述的方案源自 Maruyama 等人 ²⁷，在^第 5 代 PediaFlow （PF5） 儿科 VAD^28,29 的设计过程中进行了改进和验证。事实证明，这种测试方法有助于在动物试验之前系统地识别和解决 VAD 原型中的潜在血栓形成风险。

研究方案

本研究中使用的绵羊全血是从商业供应商处获得的，因此不需要康奈尔大学机构动物护理和使用委员会的审查。

1. 测试流程回路的构建

注：有关本协议中使用的 loop 组件和所有其他材料的详细列表，请参阅 材料表 。

1. 修改静脉 （IV） 袋。
   1. 使用塑料热封机修改 IV 袋以调整其体积和形状，如图 1 所示。
      注意：袋子的形状有助于脱气，并允许用止血钳夹住袋子穿过液体管线^30,31。根据 VAD 和管路的灌注量选择密封管路的位置，以达到 150 mL 的总灌注量。
   2. 通过在袋子顶部做一个 4 毫米的切口来引入通风口。将带倒钩的母鲁尔锁插入切口中，并用 RTV 硅橡胶粘合剂密封该部位。将单向旋塞阀连接到鲁尔锁。
2. 使用改性的静脉输液袋、聚氯乙烯 （PVC） 管、聚碳酸酯倒钩连接器以及 3 通和 1 通旋塞阀组装测试回路，如图 1 所示。
3. 连接压力计。
   1. 将 6 英寸延长线连接到入口侧和出口侧压力端口。将单向旋塞连接到延长线的另一端。
      注意：旋塞阀允许断开压力计管路，以便在启动泵之前用液体灌注延长管，如步骤 4.3 中所述。
   2. 将每个 1/8 英寸内径 （ID） 管的一端连接到压力计倒钩，并将公鲁尔接头插入另一端。
   3. 将外鲁尔接头连接到单向旋塞阀。打开旋塞阀以启用压力读数。
4. 使用夹持式超声波流量探头测量流速。
5. 将 Hoffman 夹放在出口压力端口远端以调节流阻。

2. 氯化钙 （CaCl₂） 溶液的制备

1. 将粉末状 CaCl₂ 溶解在 1x TRIS 缓冲盐水 （pH 7.4） 中，制备 1 M 溶液。避免使用含磷酸盐的缓冲液（例如 PBS 或 DPBS），因为钙和磷酸盐会反应形成不溶性沉淀。
2. 如果大量制备 CaCl₂ ，请分几个步骤逐步添加 CaCl₂ 粉末，因为其溶解是一个放热过程。
3. 如有必要，使用盐酸 （HCl） 或氢氧化钠 （NaOH） 将溶液的 pH 值滴定至 6-8。

3. 血液的制备

注：本研究中使用的绵羊血是从 材料表中列出的商业供应商处获得的。使用 14 G 针头采集血液，将动物束缚在标准的农业站立姿势。采集过程从进针到完成需要 10-12 分钟。血液用 14 份 CPD 对 86 份血液进行抗凝（CPD 制剂：26.3 g/L 柠檬酸钠、25.2 g 葡萄糖、3 g/L 柠檬酸和 2.2 g/L 磷酸钠，溶于去离子 [DI] 水中）。血袋在装有冰袋的绝缘容器中运输过夜，并在采集后 24 小时内用于实验。

1. 准备供体血液以供使用。
   1. 将血袋放在倾斜平台上 15-30 分钟，轻轻混合血液并使其达到室温 （RT）。
   2. 将磁力搅拌棒放入指定用于血液转移的聚碳酸酯烧杯或容器中。
   3. 通过输血过滤器将血液转移到烧杯中，以去除大聚集体。轻柔处理血液，以防止损坏细胞成分。沿容器壁倒入血液，以避免自由落体并最大限度地减少细胞创伤。
      注意： 如果存在大血栓或过滤器堵塞，请丢弃血液。
   4. 将烧杯或容器放在磁力搅拌器上，调整速度，直到血液表面开始轻轻旋转，而不会形成大漩涡。连续搅拌至少 5 分钟。
   5. 测量血细胞比容和血小板计数，以确保值在物种的正常范围内。
2. 进行滴定以确定目标 CaCl₂ 浓度。
   注意：柠檬酸盐血液再钙化以进行凝血和血栓形成检测，并添加肝素以防止凝血失控。测试开始的目标激活凝血时间 （ACT） 为 300 秒。请注意，本节中提供的参考 ACT 值是使用供体绵羊血获得的，可能会因采集过程中使用的物种和抗凝水平而异。此外，ACT 测量值可能因仪器^32、33、34 而异。可能需要反复试验才能为特定实验室设置确定最佳 ACT 范围。
   1. 将 2 mL 制备的 1 M CaCl₂ 溶液和 0.5 mL 肝素钠 （1000 U/mL） 从制造商的包装转移到微量离心管中，以避免储备溶液污染。
   2. 将 10 mL 血液转移到 14 mL 聚丙烯试管中。准备四个这样的管子。
   3. 为了在血液中达到 0.5 U/mL 的肝素浓度，向 10 mL 血液样品中加入 5 μL 肝素钠。
   4. 为了使血液中的钙浓度达到 5 mM，向 10 mL 血液样品中加入 50 μL 1 M CaCl₂ 溶液。分液时，旋转移液器吸头，将 CaCl₂ 分布到更宽的区域。
   5. 立即将试管倒置 10 次，水平滚动（在平坦的表面上或手掌之间），然后再倒置 10 次以确保充分混合。
   6. 按照制造商的说明使用即时全血凝固系统测量 ACT。初始 ACT 通常在 400-500 秒之间。
   7. 在保持肝素浓度恒定的同时，增加 CaCl₂ 浓度（至约 7-8 mM）以达到 300 秒的 ACT。
   8. 在单独的血液管中验证最终浓度和得到的 ACT。

4. 测试前程序

注意：本节中描述的所有步骤都适用于第 5 节和第 6 节。在作含有牛血清白蛋白 （BSA） 或定量环血液的泵之前，请执行这些步骤。使用重力进料在血管之间转移血液，以最大限度地减少机械应力。避免使用注射器柱塞驱动血液，因为这会产生过大的压力。此外，避免通过狭窄的开口限制血液，以防止损坏细胞成分。

1. 填充和排放测试回路
   1. 将 30 英寸延长线连接到进样口，并将 60 mL 点胶针筒作为漏斗连接。打开储液罐旋塞阀以用作排气阀。
   2. 将液体倒入漏斗中，根据需要将其升高以加快填充速度。将环填充到袋子顶部通风口下方 1-2 厘米处。关闭排气口和进样口旋塞阀。
   3. 要排空，请打开排气口和进样口旋塞阀，并将漏斗降低到工作台水平以下。将泵抬高到排污口上方以排出剩余的液体。
2. 取消测试循环
   注：在启动泵之前用 BSA 或血液填充定量环时，请执行此程序。
   1. 确保回路中任何地方都没有空气滞留。通过轻轻敲击和挤压管道和储液槽来去除表面上的气泡。
   2. 如果评估轴流血泵，请将其旋转到垂直位置，以通过浮力释放任何空气。如果使用离心泵，请将其倒置并旋转，以确保没有空气滞留在二次流路中。
   3. 仔细检查管道的水平部分以及管道和连接器之间的连接处，以确保不存在气泡。
   4. 挤压静脉输液袋，使液位接近顶部狭窄部分，并用止血钳夹住液袋穿过液体管路，以消除流体-空气界面。关闭排气阀。
3. 灌注压力管路和取样口
   1. 关闭压力管路末端的旋塞阀，拆下压力计管路，并连接 3 mL 注射器。打开旋塞阀，将 1-2 mL 液体吸入延长线（约 4 cm）。
   2. 关闭旋塞阀，拆下注射器，然后重新连接压力计管路。打开旋塞阀以启用压力读数。
   3. 使用注射器灌注采样口。
4. 清洁进样口和取样口
   1. 将无绒抹布切成或撕成三个相等的碎片。扭转一个碎片的一角形成一个尖端，然后将其插入端口以吸收任何残留的血液。
   2. 扭动第二块，用生理盐水润湿，然后将湿尖端插入端口。将其绕着输液港扭动以去除所有残留的血液。
   3. 使用第三个片段吸收端口中残留的盐水。
      注意：在抽取血液样本后或端口中存在残留血液时立即执行此清洁程序。

5. 钝化与血液接触的表面

1. 用 1% BSA 溶液填充回路并作 VAD 使其循环至少 30 分钟。
2. 检查回路是否有泄漏，必要时重新组装。
3. 完全排空 BSA 溶液以避免血液稀释。

6. 血栓形成检测

1. 准备测试循环。
   1. 用 150 mL 血液填充回路。
   2. 如步骤 4.2-4.4 中所述，对回路进行通风并灌注压力管路和采样口。
   3. 以低速启动泵并运行约 5 秒以去除泵内滞留的气泡，然后停止泵。
   4. 如果袋子中出现任何气泡，请重复步骤 4.2 再次执行脱气。
   5. 以低速重新启动泵，使血液在回路中循环。
2. 将肝素添加到定量环中的血液中。
   1. 将 1 mL 肝素钠 （1000 U/mL） 和 1.5 mL 乙二胺四乙酸 （EDTA;0.5 M） 从制造商的包装转移到单独的试管中，以便于在测试过程中处理。
   2. 使用 3 通旋塞阀的横向端口，通过注射器将物质注入定量环。旋转旋塞阀上的公鲁尔锁，使进样口朝上，以捕获顶部的气泡。
   3. 向 150 mL 血液中加入 75 U 肝素钠，使定量环中的肝素浓度达到 0.5 U/mL。将 75 U 肝素（如果使用 1000 U/mL 浓度，则为 75 μL）吸入微量移液器中，然后通过同时分配移液器和拉出注射器柱塞，将其分配到 3 mL 注射器中。确保转移所有液体而不溢出。
   4. 通过鲁尔锁将注射器连接到进样口，端口朝上，注射器尖端垂直向下。拉动注射器柱塞使其充满血液，并将肝素与血液混合，同时将任何空气吸入注射器中。让气泡上升到注射器的顶部。将混合物注入定量环中，确保没有空气进入。
   5. 将血液从注射器中穿入和穿出 4-5 次，以确保肝素化血液不会局限于端口中的空间。确保没有空气进入回路。
3. 滴定定量环中血液的 ACT。
   1. 使用与肝素相同的程序，向 150 mL 血液中加入 750 μL 1 M CaCl₂ 溶液，使定量环中的初始钙浓度达到 5 mM。
      1. 暴露于高钙浓度的血液可能会开始在注射器中凝固。去除残留空气后迅速注入液体。或者，用 1 ml TRIS 缓冲盐水稀释注射器中的 CaCl₂ 以降低过早凝血的风险。
   2. 让注射的 CaCl₂ 在环中循环至少 2 分钟，然后抽取血样以测量初始 ACT。
   3. 将 1 mL 注射器连接到采样端口。抽取并丢弃 0.5 mL 废血，以清除端口中的停滞血液。
   4. 连接一个新的 1 mL 注射器，抽取 0.5 mL 血液进行分析，并测量 ACT。使用步骤 4.4 中的程序清洁采样端口。
   5. 请参阅步骤 3.2 中的滴定值，以告知目标 CaCl₂ 浓度。逐渐增加钙浓度以达到 300 秒的 ACT。避免一次添加全量的 CaCl₂ ，以防止快速凝血。
      注：在本研究中使用的测试中，5 mM 的初始钙浓度导致 ACT 为 450 ± 50 s，最终浓度为 7-8 mM 产生 300 ± 20 s 的 ACT。虽然这种反应可能会有所不同，但目标是在测试开始时使 ACT 达到或低于 300 秒。
4. 开始测试。
   1. 一旦在循环中达到 300 秒的 ACT，就开始 1 小时测试。通过修改转子速度并使用 Hoffman 夹具调节阻力，将泵调整到所需的流速和压力。
   2. 按照步骤 6.3.3-6.3.4 每 15 分钟测量一次 ACT。
   3. 如果 ACT 降至 200 秒以下，则向回路中额外注入 25 U 肝素钠。
5. 结束测试。
   1. 在 1 小时结束时，将 EDTA 注射到环中以抑制进一步凝血，目标是血液中的终浓度为 5 mM。（如果使用 0.5 M EDTA 溶液，则注射 1.5 mL。
   2. 让 EDTA 循环并混合 2 分钟，然后停止泵。
6. 断开并冲洗泵。
   1. 使用止血钳夹住连接到泵入口和出口的管道，将夹子放置在距离入口和出口倒钩 3-4 cm 的位置。
   2. 小心地断开管道以释放泵。
   3. 将泵中的血液排出，并将流路定量环排入容器中。
   4. 通过重力进料或通过泵入口和出口吸取生理盐水来清洗泵中残留的血液。
      注意：步骤 6.7 和 6.8 同时执行。
7. 检查泵流路。
   1. 使用内窥镜/管道镜摄像头捕获泵入口和出口的图像。
   2. 拆卸泵（如果适用）。在盐水浴中清洗组件，并使用解剖镜或微距镜头检查血栓。
   3. 拍摄与血液接触的表面以进行记录。
      注：一致的检查和全面的文档记录对于比较测试至关重要。
8. 过滤用过的血液。
   1. 剪下一块 100 μm 尼龙网布，足够大以覆盖捕获容器的开口。
   2. 将网片轻轻悬垂地放在容器上，让血液有效地流过它。固定网片的边缘，以防止其在过滤过程中滑动。
   3. 将用过的血液穿过尼龙网。根据该机构的生物废物处理指南处理血液。
   4. 检查网片中捕获的血栓并记录结果。
9. 准备进行组织学分析。
   1. 如果计划进行组织学分析，请按照适当的安全程序修复福尔马林溶液中发现的任何血栓。
      注意： 处理甲醛时，请始终使用通风橱。

7. 清洁程序

1. 拆卸 Flow Loop。丢弃 PVC 血袋和管路。
2. 将所有其他血液接触成分（连接器、旋塞阀、鲁尔锁等）浸泡在 1% 酶活性粉末洗涤剂溶液中过夜。用温自来水冲洗，然后用去离子水冲洗，然后风干。
   1. 如果仍有凝块，请在去污剂溶液中对组分进行超声处理。彻底冲洗并风干。
3. 清洁泵。
   1. 如果泵可以拆卸，则用 1% 通用清洁剂/脱脂剂溶液浸泡和超声处理与血液接触的成分，然后用 1% 酶活性粉末洗涤剂溶液进行超声处理。
   2. 如果泵无法拆卸，请将其连接到装满清洁溶液的新流动回路，并高速运行至少 30 分钟。根据需要重复。
4. 用温自来水彻底冲洗泵，然后用去离子水冲洗，然后风干。

结果

成功执行该方案可以识别血小板沉积的局部区域，揭示泵流路中的问题点。该协议的一致应用允许通过解决这些已识别的 “热点” 来逐步改进。

例如，在开发 PediaFlow PF5 VAD 期间，由于组件的微型尺寸，我们在手动抛光定子叶片的压力侧时遇到了挑战。 体外 血栓测试突出了这个问题，因为沿着叶片根部始终观察到血小板沉积，如图

讨论

新泵的首次人体试验始终是一项不稳定的工作，因为临床前研究无法可靠地预测 VAD 在人体中的血栓形成性²⁶。值得注意的是，一些在动物试验中证明无血栓形成的 VAD 后来在临床使用中表现出显着的血栓形成性³⁶。专为诱发血栓形成而设计的激进 体外 检测方案为在开发过程的早期识别潜在的设计或制造缺陷提供了宝贵的机会。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL test tubes	Falcon	352059	Round bottom polypropylene test tubes with snap-cap
1-way stopcock	Qosina	99759	Female Luer Lock, Male Luer with Spin Lock
3-way stopcock	Qosina	99771	2 Female Luer Locks, Rotating Male Luer Lock
ACT+ cuvettes for Hemochron	Werfen	000JACT+	45/Box
All-purpose cleaner/degreaser	Simple Green	2710200613005	Simple Green Cleaner and Degreaser. Use 1% solution.
Barbed connectors	Qosina	73311	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector
Barbed connectors w/ luer lock	Qosina	73316	Material: polycarbonate; ¼” x ¼” straight connector with luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Scientific Chemicals	AAJ6465522	Or equivalent
Calcium chloride, CaCl2	Thermo Scientific Chemicals	AA89866-30	Anhydrous, ≥96.0% ACS
Dissecting scope (recommended)	Olympus	https://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/	Olympus SZH10 (continuous zoom magnification 7x - 70x) or similar
DPBS (w/o calcium and magnesium)	Gibco	14200075	Dulbecco's phosphate-buffered saline, no calcium, no magnesium, 10X (must be diluted to 1X before use)
EDTA	Quality Biological	351-027-721EA	0.5 M, pH 7.0–8.0 (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Endoscope/borescope/otoscope camera (optional)	Bebird	https://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers	3–4 mm probe diameter
Enzyme-active powdered detergent	Alconox	1304-1	Alconox Tergazyme. Use 1% solution.
Extension Line, 30"	Qosina	36218	30" length,  female luer lock to male luer lock
Extension Line, 6"	Qosina	36212	6" length,  female luer lock to male luer lock
Female luer lock, barbed	Qosina	11548	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Flow meter	Transonic	https://www.transonic.com/t402-t403-consoles	Transonic TS410 module
Hemostat	Fisherbrand	13-820-004	Locking hemostat with at least 5 cm tip length
Heparin Sodium	McKesson Packaging Services	949513	1000 U/mL concentration
Hoffman clamp	Humboldt	H8720	Fine-threaded clamp
IV bag (compliant blood reservoir)	Qosina	51494	Material: PVC, 2 Tube ports 0.258” ID. The 100-ml bag is modified using a heat sealer
Lint-free wipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimtech Science Wipers
Magnetic stirrer	INTLLAB	MS-500	Or similar
Male luer lock, barbed	Qosina	11549	Fits 1/8 inch ID Tubing; material: polycarbonate;
Manometer (digital)	Sper Scientific	840081	SPER-840081 or similar
Nylon filtering mesh	McMaster-Carr	9318T21	100-μm (0.0039") opening size
Ovine blood	Lampire	7209004	Donor whole blood, anticoagulated with ACD 14:86, shipped overnight
Plastic bag heat sealer	Uline	H-190	Uline H-190 or similar (without cutter)
Silicone rubber adhesive	Smooth-On	B00IRC1YI0	Sil-Poxy or similar
Syringe w/ luer lock, 1 mL	Fisher Scientific	14-955-646	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 3 mL	Fisher Scientific	14-955-457	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Syringe w/ luer lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461	Fisherbrand manual syringe without needle for research purposes
Transfusion filter	Haemonetics Corporation	SQ40S/SQ40NS	Haemonetics Corporation SQ40S pall blood transfusion filter
TRIS Buffered Saline	Thermo Scientific Chemicals	AAJ62938K2	TBS 10x (must be diluted to 1X before use), pH 7.4
Tubing	Tygon	ADF00017	Tygon ND-100-65 tubing (medical grade)
Ultrasonic flow sensor	Transonic	https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors	Select appropriate flow sensor model for the tubing size used. ME6PXL clamp-on sensor fits the 3/8” OD tubing. The sensor is calibrated by Transonic for the test fluid (e.g., blood at  24C) and tubing grade (e.g. Tygon ND-100-65)
Ultrasonic sonicator (optional)	Branson Ultrasonics	CPX952238R	Branson CPX2800H or similar
VAD system	PediaFlow	PF5	The VAD system to be tested; includes the pump and the controller
Whole Blood Coagulation System	Werfen	https://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-elite	Hemochron Signature Elite or Signature Jr