A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
هنا ، نصف بالتفصيل طرق استخراج البلاعم من نخاع العظام والطحال والقلب الاحتشاء ، وبالتالي تقييم التدفق الأيضي في الخلايا الحية.
إعادة برمجة التمثيل الغذائي هي السمة المميزة لتنشيط الخلايا الأحادية / البلاعم والاستقطاب بين الحالات المؤيدة والمضادة للالتهابات. على سبيل المثال ، تظهر الخلايا الوحيدة / البلاعم المؤيدة للالتهابات (أي الشبيهة ب M1) اعتمادا أكبر على تحلل السكر اللاهوائي واعتمادا أقل على الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا ، في حين أن البلاعم المضادة للالتهابات (الشبيهة ب M2) تظهر اعتمادا أكبر على أكسدة الجلوكوز والأحماض الدهنية في الميتوكوندريا. هنا ، نصف بروتوكولات متعمقة لاستخراج البلاعم من خزاني الخلايا الأحادية / البلاعم الرئيسيين في الجسم ، الطحال ونخاع العظام ، وكذلك الأنسجة المصابة مثل القلب بعد احتشاء عضلة القلب.
يتم استخراج البلاعم أو الخلايا الوحيدة عن طريق الفرز المناعي المغناطيسي باستخدام الميكروبيدات ذات العلامات بالأجسام المضادة ، والتي ترتبط بسهولة بالخلايا دون المساس بأنماطها الظاهرية. ثم يتم زراعة الخلايا المستخرجة في 96 لوحة بئر ، متبوعة بتحليل التدفق خارج الخلية باستخدام محلل التدفق الأيضي. يمكن قياس كل من تحلل السكر والفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا في وقت واحد في أعداد صغيرة من الخلايا (أقل من 2-3 × 105 خلايا). يمكن تنفيذ هذه الطريقة بسهولة في يوم واحد وتنتج نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. في النهاية ، تساعد هذه الأساليب على تعزيز فهمنا للتغيرات الأيضية أثناء الاستجابات المناعية والالتهابية للإصابة والمرض ، مما قد يؤدي إلى تطوير أهداف علاجية جديدة لمسارات التمثيل الغذائي المناعي.
التمثيل الغذائي المناعي هو مجال مزدهر يدرس دور إعادة برمجة التمثيل الغذائي في الخلايا المناعية عبر حالات الأمراض المرضية والإصابات المختلفة. تعتبر البلاعم جزءا أساسيا من الجهاز المناعي الفطري الذي يلعب أدوارا حاسمة في الالتهاب والاستجابة للعدوى وعرض المستضد والتئام الجروح1. إن فهم كيفية استقطاب البلاعم بين المجموعات الفرعية المؤيدة للالتهابات والمضادة للالتهابات (الشبيهة ب M1 و M2) عبر حالات المرض المختلفة هو مجال للتحقيق المستمر والمكثف. حددت الدراسات الحديثة إعادة برمجة التمثيل الغذائي كآلية رئيسية وراء استقطاب البلاعم. النموذج الحالي هو أنه ، بشكل عام ، تعتمد البلاعم الشبيهة ب M1 (والتي عادة ما تكون شبيهة بالخلايا الأحادية) بشكل أكبر على تحلل السكر لتغذية الوظائف المؤيدة للالتهابات ، بينما تعتمد البلاعم الشبيهة ب M2 بشكل أكبر على الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا لتهدئة الوظائف المؤيدة للالتهابات وتغذية العمليات المضادةللالتهابات 2. يمكن أن يوفر فهم كيفية تغيير استقلاب البلاعم في حالات المرض المختلفة نظرة ثاقبة للعلاجات المحتملة التي يمكن استخدامها لاستهداف مسارات التمثيل الغذائي.
على سبيل المثال ، قام مختبرنا بالتحقيق على نطاق واسع في دور إعادة برمجة التمثيل الغذائي للبلاعم أثناء احتشاء عضلة القلب (MI) 3،4،5. تلعب البلاعم دورا رئيسيا في الاستجابة الالتهابية والتئام الجروح أثناء MI ، وعلى هذا النحو ، تخضع للاستقطاب من الأنماط الظاهرية الشبيهة ب M1 إلى M2 حيث يخضع القلب المصاب باحتشاء لإعادة التشكيل لتشكيل نسيج ندبي بديل. باستخدام الطرق الموضحة هنا ، أثبتنا أن هذا الاستقطاب يتميز بتغيرات فريدة في استقلاب الجلوكوز والجلوتامين ، ووظيفة الميتوكوندريا. نصف طرق استخراج البلاعم القلبية ، وكذلك الضامة الطحالية والخلايا الوحيدة لنخاع العظام ، والتي يمكن دمجها مع تحليل التدفق خارج الخلية لتقييم التدفق الأيضي خارج الجسم الحي في يوم واحد. نأمل أن تقدم الطرق الموصوفة نهجا موحدا لتقييم الأنماط الظاهرية الأيضية للخلايا المناعية لتعزيز قابلية التكاثر عبر المختبرات التي تدرس هذا الموضوع المهم.
تصف الطرق أدناه بروتوكولات استخراج البلاعم وإجراء تحليل خارج الجسم الحي للتدفق الأيضي من القلب المصاب بالاحتشاء بعد MI والطحال ونخاع العظام (الشكل 1). بالنسبة لقلب MI والطحال ، فإن طريقة الاستخراج المستخدمة متطابقة. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي تنطوي على الفئران من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي بالمركز الطبي بجامعة ميسيسيبي (البروتوكول # 1371 ، موتون).
1. استخراج البلاعم من القلب والطحال المحتشين
ملاحظة: يستخدم استخراج البلاعم النسيجية استراتيجية اختيار سلبية لإزالة العدلات أولا ، والتي تم تصنيفها بميكروبيدات Ly6G ، ثم استراتيجية اختيار إيجابية للحصول على الضامة باستخدام ميكروبيدات CD11b3،4،5،6. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، اعمل بسرعة وحافظ على برودة الخلايا.
2. استخراج الخلايا الوحيدة من نخاع العظام
ملاحظة: يستخدم استخراج الخلايا الوحيدة من نخاع العظام استراتيجية اختيار سلبية يتم فيها تمييز الخلايا غير الوحيدة ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة وخلايا الكريات الحمراء والخلايا الحبيبية (أي العدلات) ، وإزالتها مغناطيسيا مناعيا.
3. تحضير الخلايا لتحليل التدفق الأيضي
تعتمد أعداد الخلايا النموذجية التي يتم الحصول عليها من الأنسجة المختلفة على حجم وعمره وجنسه. بالنسبة للفأر البالغ (أي 16 أسبوعا ، ~ 30 جم) ، قد ينتج الطحال 3.0-4.0 × 106 ضامة ، بينما ينتج نخاع العظم (اثنان من الظنبوب وعظم الفخذ) عادة 1.0-1.5 × 106 خلايا وحيدة (الش?...
توضح طريقتنا بالتفصيل الاستخراج السريع للبلاعم من نخاع العظام والطحال والقلب المصاب بالاحتشاء ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لإجراء تحليلات مجرى النهر مثل تحليل التدفق الأيضي خارج الخلية. يعد الجمع بين هاتين الطريقتين أداة قوية يمكنها تحديد التغيرات الأيضية في البلاع...
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
يسعدنا أن نعرب عن تقديرنا للتمويل الذي دعم هذا العمل: 166737 المعاهد الوطنية للصحة / NHBLI ، و NIH R00 HL146888 ، و NIH U54HL169191 ، و NIH / NIGMS P20GM104357 ، و NIH / NIGMS P30GM149404 لهذا العمل.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse | Miltenyi Biotec | 130-126-725 | |
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse | Miltenyi Biotec | 130-120-337 | |
Collagenase type II | Worthington | NC9522060 | |
Dnase type I | MillPore Sigma | 11284932001 | |
GentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | MACS cell dissociation tubes |
Hank balanced salt solution | Fisher Scientific | 14-025-076 | |
LS Magnetic Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MS Magnetic Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse | Miltenyi Biotec | 130-100-629 | includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent |
OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Pre-separation filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | |
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 103792-100 | 18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution |
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit | Agilent | 103020-100 | 6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose |
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | 6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A |
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL | Agilent | 103576-100 | no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved