Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Resumen

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Resumen

La reprogramación metabólica es un sello distintivo de la activación de monocitos/macrófagos y de la polarización entre los estados proinflamatorios y antiinflamatorios. Por ejemplo, los monocitos/macrófagos proinflamatorios (es decir, similares a M1) muestran una mayor dependencia de la glucólisis anaeróbica y menos de la fosforilación oxidativa mitocondrial, mientras que los macrófagos antiinflamatorios (similares a M2) muestran una mayor dependencia de la oxidación de la glucosa y los ácidos grasos en las mitocondrias. Aquí, describimos protocolos detallados para extraer macrófagos de los dos principales reservorios de monocitos/macrófagos en el cuerpo, el bazo y la médula ósea, así como de tejidos lesionados como el corazón después de un infarto de miocardio.

Los macrófagos o monocitos se extraen por clasificación inmunomagnética mediante el uso de microesferas marcadas con anticuerpos, que se unen fácilmente a las células sin comprometer sus fenotipos. A continuación, las células extraídas se cultivan en placas de 96 pocillos, seguidas de un análisis de flujo extracelular mediante un analizador de flujo metabólico. Tanto la glucólisis como la fosforilación oxidativa mitocondrial se pueden medir simultáneamente en un pequeño número de células (tan solo 2-3 × 10⁵ células). Este método se puede realizar fácilmente en 1 día y produce resultados confiables y repetibles. En última instancia, estos métodos ayudan a mejorar nuestra comprensión de los cambios metabólicos durante las respuestas inmunitarias e inflamatorias a lesiones y enfermedades, lo que podría conducir al desarrollo de nuevas dianas terapéuticas para las vías inmunometabólicas.

Introducción

El inmunometabolismo es un campo en auge que estudia el papel de la reprogramación metabólica en las células inmunitarias a través de diferentes enfermedades patológicas y estados de lesión. Los macrófagos son una parte clave del sistema inmunitario innato que desempeña un papel fundamental en la inflamación, la respuesta a la infección, la presentación de antígenos^{y la} cicatrización de heridas. Comprender cómo los macrófagos se polarizan entre subconjuntos proinflamatorios y antiinflamatorios (similares a M1 y M2) en diferentes estados de enfermedad es un área de investigación continua e intensa. Estudios recientes han identificado la reprogramación metabólica como un mecanismo clave que subyace a la polarización de los macrófagos. El paradigma actual es que, en términos generales, los macrófagos similares a M1 (que suelen ser similares a los monocitos) dependen más de la glucólisis para alimentar las funciones proinflamatorias, mientras que los macrófagos similares a M2 dependen más de la fosforilación oxidativa mitocondrial para sofocar las funciones proinflamatorias y alimentar los procesos antiinflamatorios². Comprender cómo se altera el metabolismo de los macrófagos en diferentes estados de la enfermedad puede proporcionar información sobre posibles terapias que podrían usarse para dirigirse a las vías metabólicas.

A modo de ejemplo, nuestro laboratorio ha investigado ampliamente el papel de la reprogramación metabólica de los macrófagos durante el infarto de miocardio (IM)^3,4,5. Los macrófagos desempeñan un papel clave en la respuesta inflamatoria y de cicatrización de heridas durante el infarto de miocardio y, como tales, experimentan una polarización de fenotipos similares a M1 a M2 a medida que el corazón infartado se remodela para formar tejido cicatricial de reemplazo. Utilizando los métodos descritos en este documento, hemos demostrado que esta polarización se caracteriza por cambios únicos en el metabolismo de la glucosa y la glutamina, y en la función mitocondrial. Describimos métodos para extraer macrófagos cardíacos, así como macrófagos esplénicos y monocitos de médula ósea, que pueden combinarse con análisis de flujo extracelular para evaluar el flujo metabólico ex vivo en un solo día. Esperamos que los métodos descritos ofrezcan un enfoque estandarizado para evaluar los fenotipos metabólicos de las células inmunitarias con el fin de mejorar la reproducibilidad en los laboratorios que estudian este importante tema.

Protocolo

Los métodos a continuación describen los protocolos para extraer macrófagos y realizar análisis ex vivo del flujo metabólico del corazón infartado después del infarto de miocardio, el bazo y la médula ósea (Figura 1). Para el corazón y el bazo del infarto de miocardio, el método de extracción utilizado es idéntico. Todos los protocolos que involucran ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Mississippi (Protocolo # 1371, Mouton).

1. Extracción de macrófagos del corazón y el bazo infartados

NOTA: La extracción de macrófagos tisulares utiliza una estrategia de selección negativa para eliminar primero los neutrófilos, que están marcados con microperlas Ly6G, y luego una estrategia de selección positiva para obtener macrófagos con microperlas CD11b 3,4,5,6. Al realizar este protocolo, trabaje rápidamente y mantenga las celdas frías.

1. Sacrificar al ratón de acuerdo con las directrices institucionales y de la AALAC mediante una sobredosis de isoflurano seguida de la extirpación del corazón.
2. Extirpar el corazón y el bazo rápidamente y pesar los tejidos.
3. Antes del ensayo, prepare el tampón PEB disolviendo EDTA (2 mM) y albúmina sérica bovina al 0,5% (p/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantener frío.
4. Coloque el corazón en una solución salina equilibrada fría de Hank (HBSS). Picar con un bisturí estéril en trozos pequeños.
5. Prepare una solución de digestión que contenga 600 U/mL de colagenasa tipo II y 60 U/mL de DNasa tipo I. Mezcle el tejido en 10 mL de la solución de digestión en un tubo de disociación celular MACS.
   NOTA: Prepare una cantidad suficiente de la solución de digestión para usar 10 mL por cada pañuelo (temperatura ambiente).
6. Incubar los tejidos utilizando el disociador celular según el protocolo del fabricante. Esto incubará el tejido picado a 37 °C con un giro suave durante ~ 1 h para generar una suspensión celular.
7. Coloque la suspensión en tubos cónicos de 15 ml y centrifuga a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
8. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de tampón PEB. Para generar una suspensión unicelular, aplique la suspensión sobre un filtro de 30 μm.
9. Para lisar los glóbulos rojos, agregue 10 ml de 1x solución de lisis de glóbulos rojos. Incubar durante 5-10 min en la oscuridad a 4 °C.
10. Centrifugar la suspensión durante 300 × g durante 10 min a 4 °C.
11. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PEB y cuente las células con un hematitómetro.
12. Centrifugar la suspensión a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
13. Para eliminar los neutrófilos, prepare las microperlas mezclando 90 μL de tampón PEB con 10 μL de microperlas anti-Ly6G por cada 10⁷ células. Mezcle el pellet de celdas con la suspensión de microperlas e incube durante 10 minutos en la oscuridad a 4 °C.
14. Para lavar las microesferas no unidas, añadir 10 mL de tampón PEB y centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
15. Prepare columnas magnéticas (MS o LS) en un soporte magnético. Humedece las columnas añadiendo 0,5-1,0 mL de tampón PEB.
    NOTA: En el caso de los tejidos con abundantes células inmunitarias (es decir, el bazo), la columna magnética puede obstruirse fácilmente y dejar de fluir. Por lo tanto, recomendamos usar columnas LS para el bazo.
16. Vuelva a suspender el pellet de celda en 500 μL de tampón PEB. Agregue la suspensión celular a la columna magnética y deje que las células no marcadas (es decir, los no neutrófilos) pasen a través de ella. Lave la columna 2 veces con 500 μL de tampón PEB. Recoja las células no marcadas (es decir, macrófagos y otras células) en un tubo cónico de 15 ml.
17. Centrifugar la suspensión a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
18. Prepare las microperlas mezclando 90 μL de tampón PEB con 10 μL de microperlas anti-CD11b por cada 10⁷ células. Mezcle el pellet de celdas con la suspensión de microperlas e incube durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C.
19. Repita los pasos 1.13 a 1.15.
20. Los macrófagos marcados se unirán a la columna magnética. Para recogerlos, separe la columna magnética del soporte magnético y colóquela sobre un nuevo tubo cónico de 15 mL.
21. Añadir 1 mL de medio RPMI suplementado con 0,1% de suero fetal bovino (FBS) a la columna. Utilice el émbolo para extraer los macrófagos en el tubo. Cuente los macrófagos con un hematitómetro.
    NOTA: Los macrófagos están ahora en el tubo y listos para su uso en ensayos posteriores.

2. Extracción de monocitos de la médula ósea

NOTA: La extracción de monocitos de la médula ósea utiliza una estrategia de selección negativa en la que los no monocitos, incluidos los linfocitos, las células asesinas naturales, las células dendríticas, las células eritroides y los granulocitos (es decir, los neutrófilos), se marcan y eliminan inmunomagnéticamente.

1. Sacrificar al ratón de acuerdo con las directrices institucionales y de la AALAC mediante una sobredosis de isoflurano seguida de la extirpación del corazón.
2. Retire las patas del mouse. En el HBSS frío, diseccione el músculo lejos de la tibia y el fémur hasta que los huesos estén limpios.
3. Corta con cuidado ambos extremos del hueso. Con una jeringa de 10 mL con una aguja de 27 G, enjuague la médula ósea y colóquela en un tubo cónico de 15 mL con tampón PEB. Centrifugar la suspensión a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
4. Realice los pasos 1.8 a 1.12.
5. Añadir 175 μL de tampón PEB, 25 μL de reactivo bloqueante de FcR y 50 μL de cóctel de biotina-anticuerpo monocitario por cada 5 × 10⁷ de células totales. Incubar durante 5 min en la oscuridad a 4 °C.
6. Lavar añadiendo 10 mL de tampón PEB y centrífuga a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
7. Recoja el gránulo y vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón PEB y 100 μL de microesferas anti-biotina. Incubar durante 10 min en la oscuridad a 4 °C.
8. Prepare columnas magnéticas (LS) en un soporte magnético. Humedece las columnas añadiendo 1,0 mL de tampón PEB.
9. Aplique inmediatamente la suspensión de celdas a la columna. Use un tubo de 15 mL para recoger el flujo, que contiene los monocitos. Los no monocitos se unen a la columna magnética.
10. Lave la columna 2 veces con 1 mL de tampón PEB. Cuente los monocitos con un hematitómetro.
11. Para preparar los monocitos para el siguiente paso, centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C. Para el análisis de flujo, vuelva a suspender el pellet de celda en 1 mL de RPMI + 0,1% FBS. Para la citometría de flujo, mantenga las células en PEB frío y proceda con la tinción.

3. Preparación de las células para el análisis del flujo metabólico

1. Hidratar el cartucho del sensor (el día antes del ensayo)
   1. Retire el cartucho del sensor de su paquete. Retire la placa del sensor (verde) de los pocillos y pipetee 200 μL de fluido calibrante en cada pocillo. Vuelva a colocar la placa del sensor en la parte superior de la placa del cartucho para que los sensores queden sumergidos en el líquido calibrante.
   2. Coloque el cartucho en una incubadora humidificada sin CO₂ (37 °C) durante la noche.
2. Recubrimiento de las células
   1. Coloque las células en una placa de cultivo de 96 pocillos en 200 μl de medio durante al menos 1 h. Deje al menos un pocillo en blanco para las mediciones de fondo (utilice el mismo volumen de medios para los pocillos en blanco).
      NOTA: El número óptimo de células debe determinarse antes de la experimentación. Consulte "Sugerencias para la solución de problemas" en la discusión para obtener más detalles.
   2. Cuando esté listo para realizar el ensayo, prepare el medio de flujo metabólico (es decir, RPMI basal o DMEM sin glucosa, glutamina, piruvato, etc.). Para la prueba de esfuerzo de glucólisis, asegúrese de que el medio basal esté suplementado con 2 mM de glutamina. Para la prueba de esfuerzo mitocondrial, asegúrese de que el medio basal esté suplementado con 2 mM de glutamina, 10 mM de glucosa y 1 mM de piruvato.
   3. Reemplace con cuidado el medio viejo por uno nuevo pipeteando lentamente (tenga cuidado de no desprender ninguna célula). Revise las células bajo un microscopio para asegurarse de que aún estén presentes.
   4. Coloque la placa celular en una incubadora humidificada sin CO₂ (37 °C).
3. Carga de la placa de fundente
   1. Recupere el cartucho del sensor hidratado/placa de flujo de la incubadora.
   2. Prepare los compuestos de prueba para la glucólisis o la prueba de esfuerzo mitocondrial.
      1. Glucólisis: Usando medios basales de glucólisis, cree soluciones madre disolviendo glucosa en 3 mL, oligomicina en 270 μL (100 μM) y 2-desoxiglucosa en 3 mL. Cree una solución de oligomicina de trabajo de 10 μM.
      2. Mitocondrial: Utilizando medios basales mitocondriales, cree soluciones madre disolviendo oligomicina en 630 μL (100 μM), cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) en 720 μL (100 μM) y rotenona/antimicina A en 540 μL (50 μM). Cree soluciones funcionales de oligomicina (0,5-2,5 μM), FCCP (0,125-2,0 μM) y rotenona/antimicina A (0,5 μM).
         NOTA: Hemos encontrado que 1,5 μM de oligomicina y 2,0 μM de FCCP producen los mejores resultados.
   3. Cargue los compuestos de prueba en los puertos utilizando los siguientes volúmenes: puerto A-20 μL, puerto B-22 μL, puerto C-25 μL, puerto D-27 μL. Opcional: Cargue el fármaco o compuesto de elección en el puerto A y pruebe los compuestos en los puertos B, C y D para evaluar los efectos agudos sobre la glucólisis o la respiración mitocondrial. Si no está usando un medicamento o compuesto adicional, deje vacío el puerto D.
4. Ejecución del ensayo
   1. Abra el software y seleccione Prueba de esfuerzo mitocondrial.
      NOTA: Este programa también se puede utilizar para la prueba de esfuerzo de glucólisis, ya que se mide la tasa de acidificación extracelular (ECAR).
   2. Seleccione los pozos que se utilizarán. Para restar el fondo, asegúrese de que al menos 1 pozo no tenga celdas.
   3. Ejecute el programa. Cargue la placa de fundente sin la tapa para que la placa esté calibrada (~20 min).
   4. Después de calibrar la placa, el software dará un mensaje para cargar la placa de celda. Saque la placa de celdas de la incubadora, retire la parte inferior de la placa de flujo y coloque la placa de celdas en el soporte. Presione ejecutar. El ensayo tardará ~2,5 h en completarse.
   5. Analice los resultados utilizando el software de flujo metabólico⁷ u otro software analítico de su elección.

Resultados

El número típico de células obtenido de los diferentes tejidos depende del tamaño, la edad y el sexo del animal. Para un ratón macho adulto (es decir, 16 semanas de edad, ~30 g), el bazo puede producir 3,0-4,0 × 10⁶ macrófagos, mientras que la médula ósea (dos tibias y dos fémures) suele producir 1,0-1,5 × 10⁶ monocitos (Figura 2A). El corazón infartado también suele producir números altos, dependiendo del día posterior a...

Discusión

Nuestro método detalla la extracción rápida de macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, que luego se pueden utilizar para realizar análisis posteriores, como el análisis de flujo metabólico extracelular. La combinación de estos dos métodos es una herramienta poderosa que puede cuantificar los cambios metabólicos en los macrófagos bajo diferentes estados de enfermedad o lesión, o estados metabólicos como el ejercicio. Si bien nuestro método se centró...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine