Analyse du flux métabolique ex vivo dans les macrophages spléniques et cardiaques et les monocytes de la moelle osseuse

Résumé

Ici, nous décrivons en détail les méthodes d’extraction des macrophages de la moelle osseuse, de la rate et du cœur infarctus, puis d’évaluation du flux métabolique dans les cellules vivantes.

Résumé

La reprogrammation métabolique est une caractéristique de l’activation des monocytes/macrophages et de la polarisation entre les états pro- et anti-inflammatoires. Par exemple, les monocytes/macrophages pro-inflammatoires (c’est-à-dire de type M1) dépendent davantage de la glycolyse anaérobie et moins de la phosphorylation oxydative mitochondriale, tandis que les macrophages anti-inflammatoires (de type M2) dépendent davantage de l’oxydation du glucose et des acides gras dans les mitochondries. Nous décrivons ici des protocoles approfondis pour extraire les macrophages des deux principaux réservoirs de monocytes/macrophages du corps, la rate et la moelle osseuse, ainsi que des tissus lésés tels que le cœur après un infarctus du myocarde.

Les macrophages ou les monocytes sont extraits par tri immunomagnétique à l’aide de microbilles marquées d’anticorps, qui se lient facilement aux cellules sans compromettre leurs phénotypes. Les cellules extraites sont ensuite cultivées dans des plaques à 96 puits, suivies d’une analyse des flux extracellulaires à l’aide d’un analyseur de flux métabolique. La glycolyse et la phosphorylation oxydative mitochondriale peuvent être mesurées simultanément dans un petit nombre de cellules (aussi peu que 2-3 × 10⁵ cellules). Cette méthode peut facilement être réalisée en 1 jour et produit des résultats fiables et reproductibles. En fin de compte, ces méthodes contribuent à améliorer notre compréhension des changements métaboliques au cours des réponses immunitaires et inflammatoires aux blessures et aux maladies, ce qui pourrait conduire au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour les voies immunométaboliques.

Introduction

L’immunométabolisme est un domaine en plein essor qui étudie le rôle de la reprogrammation métabolique dans les cellules immunitaires à travers différentes maladies pathologiques et états de blessures. Les macrophages sont un élément clé du système immunitaire inné qui joue un rôle essentiel dans l’inflammation, la réponse à l’infection, la présentation de l’antigène et la cicatrisation des plaies¹. Comprendre comment les macrophages se polarisent entre les sous-ensembles pro- et anti-inflammatoires (de type M1 et M2) à travers différents états pathologiques est un domaine de recherche continu et intense. Des études récentes ont identifié la reprogrammation métabolique comme un mécanisme clé sous-jacent à la polarisation des macrophages. Le paradigme actuel est que, d’une manière générale, les macrophages de type M1 (qui sont généralement de type monocyte) dépendent davantage de la glycolyse pour alimenter les fonctions pro-inflammatoires, tandis que les macrophages de type M2 s’appuient davantage sur la phosphorylation oxydative mitochondriale pour réprimer les fonctions pro-inflammatoires et alimenter les processus anti-inflammatoires². Comprendre comment le métabolisme des macrophages est modifié dans différents états pathologiques peut donner un aperçu des thérapies potentielles qui pourraient être utilisées pour cibler les voies métaboliques.

À titre d’exemple, notre laboratoire a étudié de manière approfondie le rôle de la reprogrammation métabolique des macrophages lors d’un infarctus du myocarde (IM)^3,4,5. Les macrophages jouent un rôle clé dans la réponse inflammatoire et la cicatrisation des plaies au cours de l’infarctus du myocarde et, en tant que tels, subissent une polarisation des phénotypes de type M1 vers les phénotypes de type M2 lorsque le cœur infarctus subit un remodelage pour former du tissu cicatriciel de remplacement. En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons démontré que cette polarisation est caractérisée par des changements uniques dans le métabolisme du glucose et de la glutamine, ainsi que dans la fonction mitochondriale. Nous décrivons des méthodes d’extraction de macrophages cardiaques, ainsi que de macrophages spléniques et de monocytes de moelle osseuse, qui peuvent être combinées à l’analyse des flux extracellulaires pour évaluer le flux métabolique ex vivo en une seule journée. Nous espérons que les méthodes décrites offrent une approche standardisée pour évaluer les phénotypes métaboliques des cellules immunitaires afin d’améliorer la reproductibilité dans les laboratoires qui étudient ce sujet important.

Protocole

Les méthodes ci-dessous décrivent des protocoles d’extraction des macrophages et d’analyse ex vivo du flux métabolique du cœur infarctus à la suite d’un infarctus du myocarde, de la rate et de la moelle osseuse (Figure 1). Pour l’infarctus du myocarde cardiaque et de la rate, la méthode d’extraction utilisée est identique. Tous les protocoles impliquant des souris ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université du Mississippi (Protocole #1371, Mouton).

1. Extraction des macrophages du cœur et de la rate infarctus

REMARQUE : L’extraction des macrophages tissulaires utilise une stratégie de sélection négative pour éliminer d’abord les neutrophiles, qui sont marqués avec des microbilles Ly6G, puis une stratégie de sélection positive pour obtenir des macrophages avec des microbilles CD11b 3,4,5,6. Lors de l’exécution de ce protocole, travaillez rapidement et gardez les cellules froides.

1. Euthanasier la souris conformément aux directives de l’AALAC et de l’établissement par surdose d’isoflurane suivie de l’ablation du cœur.
2. Retirez rapidement le cœur et la rate et pesez les tissus.
3. Avant l’essai, préparer le tampon PEB en dissolvant l’EDTA (2 mM) et 0,5 % d’albumine sérique bovine (p/v) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Conserver au froid.
4. Placez le cœur dans la solution saline équilibrée froide de Hank (HBSS). Hacher avec un scalpel stérile en petits morceaux.
5. Préparez une solution de digestion contenant 600 U/mL de collagénase de type II et 60 U/mL de DNase de type I. Mélangez le tissu dans 10 mL de la solution de digestion dans un tube de dissociation cellulaire MACS.
   REMARQUE : Préparez suffisamment de solution de digestion pour utiliser 10 ml pour chaque mouchoir (température ambiante).
6. Incuber les tissus à l’aide du dissociateur cellulaire selon le protocole du fabricant. Cela incubera le tissu haché à 37 °C avec une rotation douce pendant ~1 h pour générer une suspension cellulaire.
7. Déplacer la suspension dans des tubes coniques de 15 mL et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.
8. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon PEB. Pour générer une suspension unicellulaire, appliquez la suspension sur un filtre de 30 μm.
9. Pour lyser les globules rouges, ajoutez 10 ml de 1 solution de lyse des globules rouges. Incuber pendant 5 à 10 min dans l’obscurité à 4 °C.
10. Centrifuger la suspension pendant 300 × g pendant 10 min à 4 °C.
11. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PEB et compter les cellules à l’aide d’un hémacytomètre.
12. Centrifuger la suspension à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.
13. Pour éliminer les neutrophiles, préparez les microbilles en mélangeant 90 μL de tampon PEB avec 10 μL de microbilles anti-Ly6G par 10^{à 7} cellules. Mélangez la pastille cellulaire avec la suspension de microbilles et incubez pendant 10 min dans l’obscurité à 4 °C.
14. Pour éliminer les microbilles non liées, ajouter 10 ml de tampon PEB et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.
15. Préparez des colonnes magnétiques (MS ou LS) sur un support magnétique. Mouillez les colonnes en ajoutant 0,5 à 1,0 mL de tampon PEB.
    REMARQUE : Pour les tissus avec une abondance de cellules immunitaires (c’est-à-dire la rate), la colonne magnétique peut facilement se boucher et cesser de couler. Ainsi, nous recommandons d’utiliser des colonnes LS pour la rate.
16. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon PEB. Ajoutez la suspension cellulaire à la colonne magnétique et laissez passer les cellules non marquées (c’est-à-dire les non-neutrophiles). Lavez la colonne 2x avec 500 μL de tampon PEB. Prélever les cellules non marquées (c.-à-d. les macrophages et autres cellules) dans un tube conique de 15 ml.
17. Centrifuger la suspension à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.
18. Préparez les microbilles en mélangeant 90 μL de tampon PEB avec 10 μL de microbilles anti-CD11b par 10^{à 7} cellules. Mélangez la pastille cellulaire avec la suspension de microbilles et incubez pendant 15 min dans l’obscurité à 4 °C.
19. Répétez les étapes 1.13-1.15.
20. Les macrophages marqués seront liés à la colonne magnétique. Pour les récupérer, détachez la colonne magnétique du support magnétique et placez-la sur un nouveau tube conique de 15 ml.
21. Ajouter 1 mL de milieu RPMI complété par 0,1 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans la colonne. Utilisez le piston pour extraire les macrophages dans le tube. Comptez les macrophages à l’aide d’un hémacytomètre.
    REMARQUE : Les macrophages sont maintenant dans le tube et prêts à être utilisés pour d’autres dosages.

2. Extraction des monocytes de la moelle osseuse

REMARQUE : L’extraction des monocytes de la moelle osseuse utilise une stratégie de sélection négative dans laquelle les non-monocytes, y compris les lymphocytes, les cellules tueuses naturelles, les cellules dendritiques, les cellules érythroïdes et les granulocytes (c’est-à-dire les neutrophiles), sont marqués et éliminés par immunomagnétisme.

1. Euthanasier la souris conformément aux directives de l’AALAC et de l’établissement par surdose d’isoflurane suivie de l’ablation du cœur.
2. Retirez les pattes de la souris. Dans le HBSS froid, disséquez le muscle loin du tibia et du fémur jusqu’à ce que les os soient propres.
3. Coupez soigneusement les deux extrémités de l’os. À l’aide d’une seringue de 10 ml munie d’une aiguille de 27 g, rincer la moelle osseuse dans un tube conique de 15 mL muni d’un tampon PEB. Centrifuger la suspension à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.
4. Effectuez les étapes 1.8 à 1.12.
5. Ajouter 175 μL de tampon PEB, 25 μL de réactif bloquant FcR et 50 μL de cocktail biotine-anticorps monocytaire par 5 × 10⁷ cellules totales. Incuber 5 min dans l’obscurité à 4 °C.
6. Laver en ajoutant 10 mL de tampon PEB et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.
7. Récupérez la pastille et remettez les cellules en suspension dans 500 μL de tampon PEB et 100 μL de microbilles anti-biotine. Incuber 10 min dans l’obscurité à 4 °C.
8. Préparez des colonnes magnétiques (LS) sur un support magnétique. Mouillez les colonnes en ajoutant 1,0 mL de tampon PEB.
9. Appliquez immédiatement la suspension de cellule sur la colonne. À l’aide d’un tube de 15 ml, recueillir le circuit qui contient les monocytes. Les non-monocytes sont liés à la colonne magnétique.
10. Lavez la colonne 2 fois avec 1 mL de tampon PEB. Comptez les monocytes à l’aide d’un hémacytomètre.
11. Pour préparer les monocytes à l’étape suivante, centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C. Pour l’analyse de flux, remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de RPMI + 0,1 % FBS. Pour la cytométrie en flux, conservez les cellules dans du PEB froid et procédez à la coloration.

3. Préparation des cellules pour l’analyse des flux métaboliques

1. Hydrater la cartouche du capteur (la veille du dosage)
   1. Retirez la cartouche du capteur de son emballage. Retirez la plaque du capteur (verte) des puits et pipetez 200 μL de liquide d’étalonnage dans chaque puits. Replacez la plaque du capteur sur le dessus de la plaque de la cartouche afin que les capteurs soient immergés dans le fluide d’étalonnage.
   2. Placez la cartouche dans un incubateur humidifié sans CO₂ (37 °C) pendant la nuit.
2. Placage des cellules
   1. Plaquez les cellules dans une plaque de culture à 96 puits dans 200 μL de milieu pendant au moins 1 h. Laissez au moins un puits vide pour les mesures d’arrière-plan (utilisez le même volume de support pour les puits vides).
      REMARQUE : Le nombre optimal de cellules doit être déterminé avant l’expérimentation. Pour plus de détails, consultez la section « Conseils de dépannage » de la discussion.
   2. Lorsque vous êtes prêt à effectuer le test, préparez le milieu de flux métabolique (c’est-à-dire RPMI ou DMEM basal sans glucose, glutamine, pyruvate, etc.). Pour le test d’effort de glycolyse, assurez-vous que le milieu basal est complété par 2 mM de glutamine. Pour le test d’effort mitochondrial, assurez-vous que le milieu basal est complété par 2 mM de glutamine, 10 mM de glucose et 1 mM de pyruvate.
   3. Remplacez soigneusement l’ancien média par un nouveau média basal en pipetant lentement (attention à ne déloger aucune cellule). Vérifiez les cellules au microscope pour vous assurer qu’elles sont toujours présentes.
   4. Placez la plaque cellulaire dans un incubateur humidifié sans CO₂ (37 °C).
3. Chargement de la plaque de flux
   1. Récupérez la cartouche de capteur d’hydratation/plaque de flux de l’incubateur.
   2. Préparez les composés d’essai pour la glycolyse ou l’essai de stress mitochondrial.
      1. Glycolyse : À l’aide d’un milieu de base de glycolyse, créer des solutions mères en dissolvant du glucose dans 3 ml, de l’oligomycine dans 270 μL (100 μM) et du 2-désoxyglucose dans 3 mL. Créez une solution d’oligomycine fonctionnelle de 10 μM.
      2. Mitochondriale : À l’aide d’un milieu basal mitochondrial, créer des solutions mères en dissolvant l’oligomycine dans 630 μL (100 μM), le cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP) dans 720 μL (100 μM) et la roténone/antimycine A dans 540 μL (50 μM). Créer des solutions fonctionnelles d’oligomycine (0,5 à 2,5 μM), de FCCP (0,125 à 2,0 μM) et de roténone/antimycine A (0,5 μM).
         REMARQUE : Nous avons constaté que l’oligomycine de 1,5 μM et le FCCP de 2,0 μM produisent les meilleurs résultats.
   3. Chargez les composés dans les orifices en utilisant les volumes suivants : orifice A-20 μL, orifice B-22 μL, orifice C-25 μL, orifice D-27 μL. Facultatif : Chargez le médicament ou le composé de votre choix dans l’orifice A et testez les composés dans les orifices B, C et D pour évaluer les effets aigus sur la glycolyse ou la respiration mitochondriale. Si vous n’utilisez pas de médicament ou de composé supplémentaire, laissez le port D vide.
4. Exécution du test
   1. Ouvrez le logiciel et sélectionnez Test d’effort mitochondrial.
      REMARQUE : Ce programme peut également être utilisé pour le test de stress de glycolyse, car le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) est mesuré.
   2. Sélectionnez les puits qui seront utilisés. Pour soustraire l’arrière-plan, assurez-vous qu’au moins 1 puits n’a pas de cellules.
   3. Exécutez le programme. Chargez la plaque de flux avec le couvercle retiré afin que la plaque soit calibrée (~20 min).
   4. Une fois la plaque calibrée, le logiciel vous demandera de charger la plaque cellulaire. Sortez la plaque cellulaire de l’incubateur, retirez le bas de la plaque de flux et placez la plaque cellulaire dans le support. Appuyez sur exécuter. Le test prendra ~2,5 h.
   5. Analysez les résultats à l’aide d’un logiciel de flux métabolique⁷ ou d’un autre logiciel analytique de votre choix.

Résultats

Le nombre de cellules typiques obtenu à partir des différents tissus dépend de la taille, de l’âge et du sexe de l’animal. Pour une souris mâle adulte (c.-à-d. âgée de 16 semaines, ~30 g), la rate peut produire 3,0 à 4,0 × 10⁶ macrophages, tandis que la moelle osseuse (deux tibias et deux fémurs) produit généralement 1,0 à 1,5 × 10⁶ monocytes (figure 2A). Le cœur infarctus donne généralement des chiffres élevés, ...

Discussion

Notre méthode détaille l’extraction rapide des macrophages de la moelle osseuse, de la rate et du cœur infarctus, qui peuvent ensuite être utilisés pour effectuer des analyses en aval telles que l’analyse des flux métaboliques extracellulaires. La combinaison de ces deux méthodes est un outil puissant qui permet de quantifier les changements métaboliques dans les macrophages sous différents états de maladie ou de blessure, ou dans des états métaboliques tels que l’exerc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine