分析脾和心脏巨噬细胞以及骨髓单核细胞中的 离体 代谢通量

摘要

在这里，我们详细描述了从骨髓、脾脏和梗塞心脏中提取巨噬细胞的方法，并随后评估活细胞中的代谢通量。

摘要

代谢重编程是单核细胞/巨噬细胞活化和促炎状态和抗炎状态之间极化的标志。例如，促炎（即 M1 样）单核细胞/巨噬细胞表现出对厌氧糖酵解的更多依赖，对线粒体氧化磷酸化的依赖较少，而抗炎（M2 样）巨噬细胞对线粒体中葡萄糖和脂肪酸氧化的依赖程度更高。在这里，我们描述了从体内两个主要的单核细胞/巨噬细胞库（脾脏和骨髓）以及心肌梗死后心脏等受伤组织中提取巨噬细胞的深入方案。

使用抗体标记的微珠通过免疫磁性分选提取巨噬细胞或单核细胞，这些微珠很容易与细胞结合而不会影响其表型。然后将提取的细胞在 96 孔板中培养，然后使用代谢通量分析仪进行细胞外通量分析。糖酵解和线粒体氧化磷酸化都可以在少量细胞（少至 2-3 × 10⁵ 个细胞）中同时测量。该方法可在 1 天内轻松完成，并产生可靠且可重复的结果。最终，这些方法有助于增强我们对损伤和疾病的免疫和炎症反应期间代谢变化的理解，这可能导致免疫代谢途径的新型治疗靶点的开发。

引言

免疫代谢是一个蓬勃发展的领域，研究代谢重编程在不同病理疾病和损伤状态下的免疫细胞中的作用。巨噬细胞是先天免疫系统的关键部分，在炎症、感染反应、抗原呈递和伤口愈合中起关键作用¹。了解巨噬细胞在不同疾病状态下的促炎和抗炎（M1 样和 M2 样）亚群之间如何极化是一个持续和深入研究的领域。最近的研究发现代谢重编程是巨噬细胞极化的关键机制。目前的范式是，广义上讲，M1 样巨噬细胞（通常是单核细胞样）更多地依赖糖酵解来促进促炎功能，而 M2 样巨噬细胞更多地依赖线粒体氧化磷酸化来平息促炎功能并促进抗炎过程²。了解巨噬细胞代谢在不同疾病状态下如何改变，可以深入了解可用于靶向代谢途径的潜在疗法。

例如，我们的实验室广泛研究了巨噬细胞代谢重编程在心肌梗死 （MI） 期间的作用^3,4,5。巨噬细胞在 MI 期间的炎症和伤口愈合反应中起关键作用，因此，随着梗死心脏经历重塑以形成替代疤痕组织，巨噬细胞会从 M1 样表型极化为 M2 样表型。使用本文描述的方法，我们已经证明这种极化的特征是葡萄糖和谷氨酰胺代谢以及线粒体功能的独特变化。我们描述了提取心脏巨噬细胞以及脾巨噬细胞和骨髓单核细胞的方法，这些方法可以与细胞外通量分析相结合，以评估一天内的离体代谢通量。我们希望所描述的方法为评估免疫细胞代谢表型提供一种标准化方法，以提高研究这一重要主题的实验室的可重复性。

研究方案

以下方法描述了从 MI、脾脏和骨髓后从梗塞心脏中提取巨噬细胞和进行代谢通量离 体 分析的方案（图 1）。对于 MI 心脏和脾脏，使用的提取方法相同。所有涉及小鼠的方案均已获得密西西比大学医学中心机构动物护理和使用委员会（协议 #1371，Mouton）的批准。

1. 从梗死的心脏和脾脏中提取巨噬细胞

注：组织巨噬细胞的提取使用阴性选择策略首先去除用 Ly6G 微珠标记的中性粒细胞，然后使用阳性选择策略获得带有 CD11b-微珠 3,4,5,6 的巨噬细胞。执行此协议时，请快速工作并保持细胞低温。

1. 根据 AALAC 和机构指南对小鼠实施安乐死，先用异氟醚过量，然后取出心脏。
2. 快速取出心脏和脾脏，称量组织。
3. 在测定之前，通过将 EDTA （2 mM） 和 0.5% 牛血清白蛋白 （w/v） 溶解在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中来制备 PEB 缓冲液。保持低温。
4. 将心脏放入冷的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中。用无菌手术刀切成小块。
5. 制备含有 600 U/mL II 型胶原酶和 60 U/mL I 型 DNase 的消化溶液。在 MACS 细胞解离管中将组织与 10 mL 消化液混合。
   注：制备足够的消化液，每个组织使用 10 mL（室温）。
6. 根据制造商的方案使用细胞解离器孵育组织。这将在 37 °C 下轻轻旋转孵育切碎的组织 ~1 小时以产生细胞悬液。
7. 将悬浮液移至 15 mL 锥形管中，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
8. 将沉淀重悬于 1 mL PEB 缓冲液中。要生成单细胞悬液，请将悬浮液涂在 30 μm 过滤器上。
9. 要裂解红细胞，请加入 10 mL 的 1x 红细胞裂解液。在 4 °C 的黑暗中孵育 5-10 分钟。
10. 将悬浮液在 4 °C 下离心 300 × g 10 分钟。
11. 将沉淀重悬于 1 mL PEB 中，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
12. 将悬浮液在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
13. 为了去除中性粒细胞，通过每 10⁷ 个细胞混合 90 μL PEB 缓冲液和 10 μL 抗 Ly6G 微珠来制备微珠。将细胞沉淀与微珠悬浮液混合，并在 4 °C 的黑暗中孵育 10 分钟。
14. 要洗出未结合的微珠，加入 10 mL PEB 缓冲液，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
15. 在磁力架上准备磁柱（MS 或 LS）。通过添加 0.5-1.0 mL PEB 缓冲液润湿色谱柱。
    注意：对于具有大量免疫细胞（即脾脏）的组织，磁柱很容易堵塞并停止流动。因此，我们建议对脾脏使用 LS 柱。
16. 将细胞沉淀重悬于 500 μL PEB 缓冲液中。将细胞悬液添加到磁柱中，让未标记的细胞（即非嗜中性粒细胞）通过。用 500 μL PEB 缓冲液洗涤色谱柱 2 次。将未标记的细胞（即巨噬细胞和其他细胞）收集在 15 mL 锥形管中。
17. 将悬浮液在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
18. 通过每 10⁷ 个细胞将 90 μL PEB 缓冲液与 10 μL 抗 CD11b 微珠混合来制备微珠。将细胞沉淀与微珠悬浮液混合，并在 4 °C 下避光孵育 15 分钟。
19. 重复步骤 1.13-1.15。
20. 标记的巨噬细胞将与磁柱结合。要收集它们，请从磁力架上拆下磁柱，并将其放在新的 15 mL 锥形管上。
21. 向色谱柱中加入 1 mL 补充有 0.1% 胎牛血清 （FBS） 的 RPMI 培养基。使用柱塞将巨噬细胞提取到试管中。使用血细胞计数器计数巨噬细胞。
    注：巨噬细胞现在在试管中，可直接用于进一步检测。

2. 从骨髓中提取单核细胞

注：从骨髓中提取单核细胞使用阴性选择策略，其中非单核细胞，包括淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、红细胞和粒细胞（即中性粒细胞），被免疫磁性标记并去除。

1. 根据 AALAC 和机构指南对小鼠实施安乐死，先用异氟醚过量，然后取出心脏。
2. 从鼠标上取下支腿。在冷 HBSS 中，从胫骨和股骨上解剖肌肉，直到骨骼干净。
3. 小心地切掉骨头的两端。使用带有 27 G 针头的 10 mL 注射器，将骨髓冲洗到装有 PEB 缓冲液的 15 mL 锥形管中。将悬浮液在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
4. 执行步骤 1.8-1.12。
5. 每 5 × 10⁷ 个总细胞加入 175 μL PEB 缓冲液、25 μL FcR 封闭试剂和 50 μL 单核细胞生物素抗体混合物。在 4 °C 的黑暗中孵育 5 分钟。
6. 加入 10 mL PEB 缓冲液洗涤，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
7. 收集沉淀并将细胞重悬于 500 μL PEB 缓冲液和 100 μL 抗生物素微珠中。在 4 °C 的黑暗中孵育 10 分钟。
8. 在磁力架上准备磁柱 （LS）。通过添加 1.0 mL PEB 缓冲液润湿色谱柱。
9. 立即将细胞悬液涂在色谱柱上。使用 15 mL 试管收集含有单核细胞的流出液。非单核细胞与磁柱结合。
10. 用 1 mL PEB 缓冲液洗涤色谱柱 2 次。使用血细胞计数器计数单核细胞。
11. 为了准备用于下一步的单核细胞，请在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。 对于通量分析，将细胞沉淀重悬于 1 mL RPMI + 0.1% FBS 中。对于流式细胞术，将细胞保存在冷 PEB 中并继续染色。

3. 用于代谢通量分析的细胞的制备

1. 水合传感器探针板（检测前一天）
   1. 从包装中取出传感器盒。从孔中取出传感器板（绿色），将 200 μL 校准液移液到每个孔中。将传感器板放回卡板顶部，使传感器浸没在校准液中。
   2. 将小柱放入非 CO₂ 加湿培养箱 （37 °C） 中过夜。
2. 电镀细胞
   1. 将细胞接种在 96 孔培养板中，在 200 μL 培养基中至少 1 小时。至少将一个孔留空以进行背景测量（对于空白孔，请使用相同体积的培养基）。
      注意：应在实验前确定最佳细胞数。有关更多详细信息，请参阅讨论中的“故障排除提示”。
   2. 准备进行检测时，准备代谢通量培养基（即不含葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸等的基础 RPMI 或 DMEM）。对于糖酵解应激测试，确保基础培养基中补充有 2 mM 谷氨酰胺。对于线粒体应激测试，确保基础培养基中补充有 2 mM 谷氨酰胺、10 mM 葡萄糖和 1 mM 丙酮酸。
   3. 通过缓慢移液，小心地用新的基础培养基替换旧培养基（小心不要移出任何细胞）。在显微镜下检查细胞以确保它们仍然存在。
   4. 将细胞板置于非 CO₂ 加湿培养箱 （37 °C） 中。
3. 加载助焊剂板
   1. 从培养箱中取出水合传感器盒/助焊剂板。
   2. 准备用于糖酵解或线粒体压力测试的测试化合物。
      1. 糖酵解：使用糖酵解基础培养基，通过将葡萄糖溶解在 3 mL 中，将寡霉素溶解在 270 μL （100 μM） 中，将 2-脱氧葡萄糖溶解在 3 mL 中来制备储备液。制备 10 μM 的工作寡霉素溶液。
      2. 线粒体：使用线粒体基础培养基，通过将寡霉素溶解在 630 μL （100 μM） 中、将羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙 （FCCP） 溶解在 720 μL （100 μM） 中，以及将鱼藤酮/抗霉素 A 溶解在 540 μL （50 μM） 中来制备储备液。制备寡霉素 （0.5-2.5 μM）、FCCP （0.125-2.0 μM） 和鱼藤酮/抗霉素 A （0.5 μM） 的工作溶液。
         注：我们发现 1.5 μM 寡霉素和 2.0 μM FCCP 产生最佳结果。
   3. 使用以下体积将测试化合物上样到端口中：端口 A-20 μL、端口 B-22 μL、端口 C-25 μL、端口 D-27 μL。可选：将所选药物或化合物上样到端口 A，并将测试化合物上样到端口 B、C 和 D，以评估对糖酵解或线粒体呼吸的急性影响。如果不使用其他药物或化合物，请将端口 D 留空。
4. 运行检测
   1. 打开软件并选择 Mitochondrial Stress Test。
      注意：该程序也可用于糖酵解负荷测试，因为测量细胞外酸化率 （ECAR）。
   2. 选择将使用的孔。要减去背景，请确保至少 1 个孔中没有细胞。
   3. 运行程序。在取下盖子的情况下加载助焊剂板，以便校准板（~20 分钟）。
   4. 校准板后，软件将提示加载电池板。从培养箱中取出细胞板，取下助焊板底部，将细胞板放入支架中。按 run。该测定需要 ~2.5 小时才能完成。
   5. 使用 Metabolic Flux 软件⁷ 或其他选择的分析软件分析结果。

结果

从不同组织获得的典型细胞数量取决于动物的大小、年龄和性别。对于成年雄性小鼠（即 16 周龄，~30 g），脾脏可能产生 3.0-4.0 × 10⁶ 个巨噬细胞，而骨髓（两个胫骨和两个股骨）通常产生 1.0-1.5 × 10⁶ 个单核细胞（图 2A）。梗塞心脏通常也会产生大量数据，具体取决于 MI ^4,5,6

讨论

我们的方法详细介绍了从骨髓、脾脏和梗死心脏中快速提取巨噬细胞，然后可用于进行下游分析，例如细胞外代谢通量分析。这两种方法的结合是一种强大的工具，可以量化不同疾病或损伤状态下巨噬细胞的代谢变化，或代谢状态（如运动）。虽然我们的方法侧重于骨髓和脾巨噬细胞，但也可以使用其他巨噬细胞储库，例如腹膜室⁸。虽然我们不是第一?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine