Análise do fluxo metabólico ex vivo em macrófagos esplênicos e cardíacos e monócitos da medula óssea

Resumo

Aqui, descrevemos em detalhes métodos para extrair macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado e, posteriormente, avaliar o fluxo metabólico em células vivas.

Resumo

A reprogramação metabólica é uma marca registrada da ativação de monócitos/macrófagos e da polarização entre estados pró e anti-inflamatórios. Por exemplo, monócitos/macrófagos pró-inflamatórios (ou seja, semelhantes a M1) exibem mais dependência da glicólise anaeróbica e menos dependência da fosforilação oxidativa mitocondrial, enquanto macrófagos anti-inflamatórios (semelhantes a M2) exibem mais dependência da glicose e da oxidação de ácidos graxos nas mitocôndrias. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para extrair macrófagos dos dois principais reservatórios de monócitos / macrófagos do corpo, o baço e a medula óssea, bem como tecidos lesionados, como o coração, após infarto do miocárdio.

Macrófagos ou monócitos são extraídos por classificação imunomagnética usando microesferas marcadas com anticorpos, que se ligam facilmente às células sem comprometer seus fenótipos. As células extraídas são então cultivadas em placas de 96 poços, seguidas de análise de fluxo extracelular usando um analisador de fluxo metabólico. Tanto a glicólise quanto a fosforilação oxidativa mitocondrial podem ser medidas simultaneamente em um pequeno número de células (apenas 2-3 × 10⁵ células). Este método pode ser facilmente executado em 1 dia e produz resultados confiáveis e repetíveis. Em última análise, esses métodos ajudam a melhorar nossa compreensão das alterações metabólicas durante as respostas imunes e inflamatórias a lesões e doenças, o que pode levar ao desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para vias imunometabólicas.

Introdução

O imunometabolismo é um campo florescente que estuda o papel da reprogramação metabólica nas células imunes em diferentes doenças patológicas e estados de lesão. Os macrófagos são uma parte fundamental do sistema imunológico inato que desempenha papéis críticos na inflamação, resposta à infecção, apresentação de antígenos e cicatrização de feridas¹. Compreender como os macrófagos se polarizam entre subconjuntos pró e anti-inflamatórios (semelhantes a M1 e semelhantes a M2) em diferentes estados de doença é uma área de investigação contínua e intensa. Estudos recentes identificaram a reprogramação metabólica como um mecanismo-chave subjacente à polarização dos macrófagos. O paradigma atual é que, em termos gerais, os macrófagos do tipo M1 (que são tipicamente semelhantes a monócitos) dependem mais da glicólise para alimentar as funções pró-inflamatórias, enquanto os macrófagos do tipo M2 dependem mais da fosforilação oxidativa mitocondrial para reprimir as funções pró-inflamatórias e alimentar os processos anti-inflamatórios². Compreender como o metabolismo dos macrófagos é alterado em diferentes estados de doença pode fornecer informações sobre possíveis terapias que podem ser usadas para direcionar as vias metabólicas.

Como exemplo, nosso laboratório investigou extensivamente o papel da reprogramação metabólica de macrófagos durante o infarto do miocárdio (IM)^3,4,5. Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta inflamatória e de cicatrização de feridas durante o infarto do miocárdio e, como tal, sofrem polarização de fenótipos semelhantes a M1 para M2 à medida que o coração infartado sofre remodelação para formar tecido cicatricial de substituição. Usando os métodos aqui descritos, demonstramos que essa polarização é caracterizada por alterações únicas no metabolismo da glicose e da glutamina e na função mitocondrial. Descrevemos métodos para extração de macrófagos cardíacos, bem como macrófagos esplênicos e monócitos da medula óssea, que podem ser combinados com a análise do fluxo extracelular para avaliar o fluxo metabólico ex vivo em um único dia. Esperamos que os métodos descritos ofereçam uma abordagem padronizada para avaliar os fenótipos metabólicos das células imunes para aumentar a reprodutibilidade entre os laboratórios que estudam este importante tópico.

Protocolo

Os métodos abaixo descrevem protocolos para extração de macrófagos e realização de análise ex vivo do fluxo metabólico do coração infartado após IM, baço e medula óssea (Figura 1). Para o coração e baço do miocárdio, o método de extração usado é idêntico. Todos os protocolos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade do Mississippi (Protocolo # 1371, Mouton).

1. Extração de macrófagos do coração e baço infartados

NOTA: A extração de macrófagos teciduais usa uma estratégia de seleção negativa para remover primeiro os neutrófilos, que são marcados com microesferas de Ly6G e, em seguida, uma estratégia de seleção positiva para obter macrófagos com microesferas de CD11b 3,4,5,6. Ao realizar este protocolo, trabalhe rapidamente e mantenha as células frias.

1. Eutanasiar o camundongo de acordo com a AALAC e as diretrizes institucionais por overdose de isoflurano seguida de remoção do coração.
2. Remova o coração e o baço rapidamente e pese os tecidos.
3. Antes do ensaio, prepare o tampão PEB dissolvendo EDTA (2 mM) e albumina sérica bovina a 0,5% (p / v) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mantenha frio.
4. Coloque o coração na solução salina balanceada de Hank (HBSS) fria. Pique com um bisturi estéril em pedaços pequenos.
5. Preparar uma solução de digestão contendo 600 U/ml de colagenase tipo II e 60 U/ml de DNase tipo I. Misturar o tecido em 10 ml da solução de digestão num tubo de dissociação celular MACS.
   NOTA: Faça o suficiente da solução de digestão para usar 10 mL para cada tecido (temperatura ambiente).
6. Incubar os tecidos usando o dissociador celular de acordo com o protocolo do fabricante. Isso incubará o tecido picado a 37 ° C com rotação suave por ~ 1 h para gerar uma suspensão celular.
7. Mover a suspensão para tubos cónicos de 15 ml e centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
8. Ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão PEB. Para gerar uma suspensão unicelular, aplique a suspensão sobre um filtro de 30 μm.
9. Para lisar os glóbulos vermelhos, adicione 10 mL de 1x solução de lise de glóbulos vermelhos. Incubar durante 5-10 min no escuro a 4 °C.
10. Centrifugar a suspensão durante 300 × g durante 10 min a 4 °C.
11. Ressuspenda o pellet em 1 mL de PEB e conte as células usando um hemacitómetro.
12. Centrifugar a suspensão a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
13. Para remover neutrófilos, prepare microesferas misturando 90 μL de tampão PEB com 10 μL de microesferas anti-Ly6G por 10⁷ células. Misturar o sedimento celular com a suspensão de microesferas e incubar durante 10 minutos no escuro a 4 °C.
14. Para lavar as microesferas não ligadas, adicione 10 ml de tampão PEB e centrifugue a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
15. Prepare colunas magnéticas (MS ou LS) em um suporte magnético. Molhe as colunas adicionando 0,5-1,0 mL de tampão PEB.
    NOTA: Para tecidos com abundância de células imunes (ou seja, baço), a coluna magnética pode facilmente ficar entupida e parar de fluir. Assim, recomendamos o uso de colunas LS para baço.
16. Ressuspenda o pellet celular em 500 μL de tampão PEB. Adicione a suspensão celular à coluna magnética e deixe as células não marcadas (ou seja, não neutrófilos) passarem. Lave a coluna 2x com 500 μL de tampão PEB. Colete as células não marcadas (ou seja, macrófagos e outras células) em um tubo cônico de 15 mL.
17. Centrifugar a suspensão a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
18. Prepare as microesferas misturando 90 μL de tampão PEB com 10 μL de microesferas anti-CD11b por 10⁷ células. Misturar o sedimento celular com a suspensão de microesferas e incubar durante 15 min no escuro a 4 °C.
19. Repita as etapas 1.13-1.15.
20. Os macrófagos marcados serão ligados à coluna magnética. Para coletá-los, retire a coluna magnética do suporte magnético e coloque-a sobre um novo tubo cônico de 15 mL.
21. Adicione 1 mL de meio RPMI suplementado com 0,1% de soro fetal bovino (FBS) à coluna. Use o êmbolo para extrair os macrófagos para o tubo. Contar os macrófagos utilizando um hemacitómetro.
    NOTA: Os macrófagos estão agora no tubo e prontos para uso em ensaios adicionais.

2. Extração de monócitos da medula óssea

NOTA: A extração de monócitos da medula óssea usa uma estratégia de seleção negativa na qual os não monócitos, incluindo linfócitos, células assassinas naturais, células dendríticas, células eritróides e granulócitos (ou seja, neutrófilos), são imunomagneticamente marcados e removidos.

1. Eutanasiar o camundongo de acordo com a AALAC e as diretrizes institucionais por overdose de isoflurano seguida de remoção do coração.
2. Remova as pernas do mouse. No HBSS frio, disseque o músculo da tíbia e do fêmur até que os ossos estejam limpos.
3. Corte cuidadosamente as duas extremidades do osso. Usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 27 G, lave a medula óssea em um tubo cônico de 15 mL com tampão PEB. Centrifugar a suspensão a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
4. Execute as etapas 1.8 a 1.12.
5. Adicione 175 μL de tampão PEB, 25 μL de reagente bloqueador FcR e 50 μL de coquetel de biotina-anticorpo de monócitos por 5 × 10⁷ do total de células. Incubar durante 5 min no escuro a 4 °C.
6. Lave adicionando 10 mL de tampão PEB e centrifugue a 300 × g por 10 min a 4 °C.
7. Colete o pellet e ressuspenda as células em 500 μL de tampão PEB e 100 μL de microesferas anti-biotina. Incubar durante 10 min no escuro a 4 °C.
8. Prepare colunas magnéticas (LS) em um suporte magnético. Molhe as colunas adicionando 1,0 mL de tampão PEB.
9. Aplique imediatamente a suspensão da célula à coluna. Use um tubo de 15 mL para coletar o fluxo, que contém os monócitos. Os não-monócitos estão ligados à coluna magnética.
10. Lave a coluna 2x com 1 mL de tampão PEB. Conte os monócitos usando um hemacitômetro.
11. Para preparar os monócitos para a próxima etapa, centrifugue a 300 × g por 10 min a 4 °C. Para análise de fluxo, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de RPMI + 0,1% FBS. Para citometria de fluxo, mantenha as células em PEB frio e prossiga com a coloração.

3. Preparação de células para análise do fluxo metabólico

1. Hidrate o cartucho do sensor (um dia antes do ensaio)
   1. Remova o cartucho do sensor da embalagem. Remova a placa do sensor (verde) dos poços e pipete 200 μL de fluido calibrante em cada poço. Coloque a placa do sensor de volta na parte superior da placa do cartucho para que os sensores fiquem submersos no fluido calibrante.
   2. Coloque o cartucho em uma incubadora umidificada sem CO₂ (37 °C) durante a noite.
2. Revestimento das células
   1. Plaquear as células em uma placa de cultura de 96 poços em 200 μL de meio por pelo menos 1 h. Deixe pelo menos um poço em branco para medições de fundo (use o mesmo volume de mídia para poços em branco).
      NOTA: O número ideal de células deve ser determinado antes da experimentação. Consulte "Dicas de solução de problemas" na discussão para obter mais detalhes.
   2. Quando estiver pronto para realizar o ensaio, prepare o meio de fluxo metabólico (ou seja, RPMI basal ou DMEM sem glicose, glutamina, piruvato, etc.). Para o teste de estresse de glicólise, certifique-se de que o meio basal seja suplementado com 2 mM de glutamina. Para o teste de estresse mitocondrial, certifique-se de que o meio basal seja suplementado com 2 mM de glutamina, 10 mM de glicose e 1 mM de piruvato.
   3. Substitua cuidadosamente a mídia antiga pela nova mídia basal pipetando lentamente (tome cuidado para não desalojar nenhuma célula). Verifique as células ao microscópio para ter certeza de que ainda estão presentes.
   4. Coloque a placa celular em uma incubadora umidificada sem CO₂ (37 °C).
3. Carregando a placa de fluxo
   1. Recupere o cartucho do sensor hidratado/placa de fluxo da incubadora.
   2. Preparar os compostos de ensaio para o ensaio de glicólise ou de stress mitocondrial.
      1. Glicólise: Usando meio basal de glicólise, crie soluções estoque dissolvendo glicose em 3 mL, oligomicina em 270 μL (100 μM) e 2-desoxiglicose em 3 mL. Crie uma solução de oligomicina funcional de 10 μM.
      2. Mitocondrial: Usando meio basal mitocondrial, crie soluções estoque dissolvendo oligomicina em 630 μL (100 μM), cianeto de carbonila-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) em 720 μL (100 μM) e rotenona/antimicina A em 540 μL (50 μM). Crie soluções de trabalho de oligomicina (0,5-2,5 μM), FCCP (0,125-2,0 μM) e rotenona/antimicina A (0,5 μM).
         NOTA: Descobrimos que 1,5 μM de oligomicina e 2,0 μM de FCCP produzem os melhores resultados.
   3. Carregue os compostos de teste nas portas usando os seguintes volumes: porta A-20 μL, porta B-22 μL, porta C-25 μL, porta D-27 μL. Opcional: Carregue o medicamento ou composto de escolha na porta A e teste os compostos nas portas B, C e D para avaliar os efeitos agudos na glicólise ou na respiração mitocondrial. Se não estiver usando medicamento ou composto adicional, deixe a porta D vazia.
4. Executando o ensaio
   1. Abra o software e selecione Teste de estresse mitocondrial.
      NOTA: Este programa também pode ser usado para teste de estresse de glicólise, pois a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é medida.
   2. Selecione os poços que serão usados. Para subtrair o fundo, certifique-se de que pelo menos 1 poço não tenha células.
   3. Execute o programa. Carregue a placa de fluxo com a tampa removida para que a placa seja calibrada (~20 min).
   4. Depois que a placa for calibrada, o software fornecerá um prompt para carregar a placa da célula. Retire a placa celular da incubadora, remova a parte inferior da placa de fluxo e coloque a placa celular no suporte. Pressione executar. O ensaio levará ~ 2,5 h para ser concluído.
   5. Analise os resultados usando o software de fluxo metabólico⁷ ou outro software analítico de sua escolha.

Resultados

O número típico de células obtidas dos diferentes tecidos depende do tamanho, idade e sexo do animal. Para um camundongo macho adulto (ou seja, 16 semanas de idade, ~ 30 g), o baço pode produzir 3,0-4,0 × 10⁶ macrófagos, enquanto a medula óssea (duas tíbias e dois fêmures) normalmente produz 1,0-1,5 × 10⁶ monócitos (Figura 2A). O coração infartado normalmente produz números altos também, dependendo do dia após o IM

Discussão

Nosso método detalha a extração rápida de macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado, que podem ser usados para realizar análises a jusante, como análise de fluxo metabólico extracelular. A combinação desses dois métodos é uma ferramenta poderosa que pode quantificar alterações metabólicas em macrófagos sob diferentes estados de doença ou lesão, ou estados metabólicos, como exercícios. Enquanto nosso método se concentra na medula óssea e nos macrófago...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine