Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir detailliert Methoden zur Extraktion von Makrophagen aus dem Knochenmark, der Milz und dem infarktierten Herzen und zur anschließenden Bestimmung des metabolischen Flusses in lebenden Zellen.

Zusammenfassung

Die metabolische Reprogrammierung ist ein Kennzeichen der Aktivierung von Monozyten/Makrophagen und der Polarisierung zwischen pro- und antiinflammatorischen Zuständen. Zum Beispiel zeigen proinflammatorische (d.h. M1-ähnliche) Monozyten/Makrophagen eine stärkere Abhängigkeit von anaerober Glykolyse und eine geringere Abhängigkeit von der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung, während entzündungshemmende (M2-ähnliche) Makrophagen eine größere Abhängigkeit von Glukose- und Fettsäureoxidation in den Mitochondrien aufweisen. Im Folgenden beschreiben wir ausführliche Protokolle für die Extraktion von Makrophagen aus den beiden wichtigsten Monozyten-/Makrophagen-Reservoirs im Körper, der Milz und dem Knochenmark, sowie aus verletzten Geweben wie dem Herzen nach einem Myokardinfarkt.

Makrophagen oder Monozyten werden durch immunomagnetische Sortierung unter Verwendung von Antikörper-markierten Mikrokügelchen extrahiert, die leicht an Zellen binden, ohne deren Phänotypen zu beeinträchtigen. Die extrahierten Zellen werden dann in 96-Well-Platten kultiviert, gefolgt von einer extrazellulären Flussanalyse mit einem metabolischen Flussanalysator. Sowohl die Glykolyse als auch die mitochondriale oxidative Phosphorylierung können gleichzeitig in einer kleinen Anzahl von Zellen gemessen werden (nur 2-3 × 10⁵ Zellen). Diese Methode kann problemlos an 1 Tag durchgeführt werden und liefert zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse. Letztendlich tragen diese Methoden dazu bei, unser Verständnis von metabolischen Veränderungen während Immun- und Entzündungsreaktionen auf Verletzungen und Krankheiten zu verbessern, was zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Ziele für immunmetabolische Signalwege führen könnte.

Einleitung

Der Immunstoffwechsel ist ein blühendes Gebiet, das die Rolle der metabolischen Reprogrammierung in Immunzellen bei verschiedenen pathologischen Krankheits- und Verletzungszuständen untersucht. Makrophagen sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems, das eine entscheidende Rolle bei Entzündungen, der Reaktion auf Infektionen, der Antigenpräsentation und der Wundheilung spielt¹. Das Verständnis, wie Makrophagen zwischen pro- und antiinflammatorischen (M1-ähnlichen und M2-ähnlichen) Untergruppen über verschiedene Krankheitszustände hinweg polarisieren, ist ein Bereich fortlaufender und intensiver Untersuchungen. Neuere Studien haben die metabolische Reprogrammierung als einen Schlüsselmechanismus identifiziert, der der Polarisierung von Makrophagen zugrunde liegt. Das derzeitige Paradigma ist, dass M1-ähnliche Makrophagen (die typischerweise monozytenähnlich sind) im Großen und Ganzen mehr auf Glykolyse angewiesen sind, um entzündungsfördernde Funktionen zu fördern, während M2-ähnliche Makrophagen mehr auf mitochondriale oxidative Phosphorylierung angewiesen sind, um entzündungsfördernde Funktionen zu unterdrücken und entzündungshemmende Prozesse zu fördern². Das Verständnis, wie der Makrophagenstoffwechsel in verschiedenen Krankheitszuständen verändert ist, kann Aufschluss über potenzielle Therapien geben, die zur gezielten Ausrichtung von Stoffwechselwegen eingesetzt werden könnten.

Als Beispiel hat unser Labor die Rolle der metabolischen Reprogrammierung von Makrophagen während eines Myokardinfarkts (MI) ausführlich ^{untersucht3,4,5}. Makrophagen spielen eine Schlüsselrolle bei der Entzündungs- und Wundheilungsreaktion während des Myokardinfarkts und durchlaufen als solche eine Polarisierung von M1-ähnlichen zu M2-ähnlichen Phänotypen, wenn das infarzierte Herz umgebaut wird, um Ersatznarbengewebe zu bilden. Unter Verwendung der hier beschriebenen Methoden haben wir gezeigt, dass diese Polarisation durch einzigartige Veränderungen im Glukose- und Glutaminstoffwechsel und in der mitochondrialen Funktion gekennzeichnet ist. Wir beschreiben Methoden zur Extraktion von kardialen Makrophagen sowie Milzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten, die mit der extrazellulären Flussanalyse kombiniert werden können, um den ex vivo metabolischen Fluss an einem einzigen Tag zu bestimmen. Wir hoffen, dass die beschriebenen Methoden einen standardisierten Ansatz zur Bewertung von metabolischen Phänotypen von Immunzellen bieten, um die Reproduzierbarkeit in Laboren, die dieses wichtige Thema untersuchen, zu verbessern.

Protokoll

Die folgenden Methoden beschreiben Protokolle für die Extraktion von Makrophagen und die Durchführung einer Ex-vivo-Analyse des metabolischen Flusses aus dem infarktierten Herzen nach MI, der Milz und dem Knochenmark (Abbildung 1). Für den Myokardinfarkt Herz und Milz ist die verwendete Extraktionsmethode identisch. Alle Protokolle, an denen Mäuse beteiligt waren, wurden vom University of Mississippi Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (Protokoll #1371, Mouton).

1. Extraktion von Makrophagen aus dem infarktierten Herzen und der Milz

HINWEIS: Bei der Extraktion von Gewebemakrophagen wird eine negative Selektionsstrategie verwendet, um zunächst Neutrophile zu entfernen, die mit Ly6G-Mikrokügelchen markiert sind, und dann eine positive Selektionsstrategie, um Makrophagen mit CD11b-Mikrokügelchen 3,4,5,6 zu erhalten. Wenn Sie dieses Protokoll durchführen, arbeiten Sie schnell und halten Sie die Zellen kalt.

1. Euthanasieren Sie die Maus in Übereinstimmung mit AALAC und den institutionellen Richtlinien durch Isofluran-Überdosierung, gefolgt von der Entfernung des Herzens.
2. Entnehmen Sie schnell das Herz und die Milz und wiegen Sie das Taschentuch.
3. Vor dem Assay ist der PEB-Puffer durch Auflösen von EDTA (2 mM) und 0,5 % Rinderserumalbumin (w/v) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) herzustellen. Kalt halten.
4. Legen Sie das Herz in kalte Hank's ausgewogene Salzlösung (HBSS). Mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke hacken.
5. Bereiten Sie eine Aufschlusslösung vor, die 600 U/ml Kollagenase Typ II und 60 U/ml DNase Typ I enthält. Mischen Sie das Gewebe in 10 ml der Aufschlusslösung in einem MACS-Zelldissoziationsröhrchen.
   HINWEIS: Machen Sie genug von der Verdauungslösung, um 10 ml für jedes Gewebe (Raumtemperatur) zu verwenden.
6. Inkubieren Sie das Gewebe mit dem Zelldissoziator gemäß dem Protokoll des Herstellers. Dadurch wird das zerkleinerte Gewebe bei 37 °C unter sanftem Schleudern für ~1 h inkubiert, um eine Zellsuspension zu erzeugen.
7. Die Suspension in konische 15-ml-Röhrchen geben und 10 Minuten lang bei 4 °C bei 300 × g zentrifugieren.
8. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL PEB-Puffer. Um eine einzellige Suspension zu erzeugen, tragen Sie die Suspension auf einen 30-μm-Filter auf.
9. Um rote Blutkörperchen zu lysieren, fügen Sie 10 ml 1x Lyselösung für rote Blutkörperchen hinzu. 5-10 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
10. Die Suspension wird 10 min lang 300 × g bei 4 °C zentrifugiert.
11. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml PEB und zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer.
12. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
13. Um Neutrophile zu entfernen, bereiten Sie Mikrokügelchen vor, indem Sie 90 μl PEB-Puffer mit 10 μl Anti-Ly6G-Mikrokügelchen pro 10⁷ Zellen mischen. Mischen Sie das Zellpellet mit der Mikrokügelchensuspension und inkubieren Sie es 10 min im Dunkeln bei 4 °C.
14. Um ungebundene Mikrokügelchen auszuwaschen, fügen Sie 10 mL PEB-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 10 min bei 4 °C.
15. Bereiten Sie magnetische Säulen (MS oder LS) auf einem Magnetständer vor. Befeuchten Sie die Säulen mit 0,5-1,0 mL PEB-Puffer.
    HINWEIS: Bei Geweben mit einer Fülle von Immunzellen (z. B. Milz) kann die magnetische Säule leicht verstopfen und nicht mehr fließen. Daher empfehlen wir die Verwendung von LS-Säulen für die Milz.
16. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl PEB-Puffer. Geben Sie die Zellsuspension in die magnetische Säule und lassen Sie die unmarkierten Zellen (d.h. Nicht-Neutrophile) durchlaufen. Waschen Sie die Säule 2x mit 500 μL PEB-Puffer. Sammeln Sie die unmarkierten Zellen (d. h. Makrophagen und andere Zellen) in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
17. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
18. Bereiten Sie Mikrokügelchen vor, indem Sie 90 μl PEB-Puffer mit 10 μl Anti-CD11b-Mikrokügelchen pro 10⁷ Zellen mischen. Mischen Sie das Zellpellet mit der Mikrokügelchensuspension und inkubieren Sie es 15 min im Dunkeln bei 4 °C.
19. Wiederholen Sie die Schritte 1.13-1.15.
20. Die markierten Makrophagen werden an die magnetische Säule gebunden. Um sie zu sammeln, nehmen Sie die Magnetsäule vom Magnetständer ab und legen Sie sie auf ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
21. Geben Sie 1 ml RPMI-Medium, ergänzt mit 0,1 % fötalem Rinderserum (FBS), in die Säule. Verwenden Sie den Kolben, um die Makrophagen in das Röhrchen zu extrahieren. Zählen Sie die Makrophagen mit einem Hämazytometer.
    HINWEIS: Die Makrophagen befinden sich nun im Röhrchen und können für weitere Assays verwendet werden.

2. Extraktion von Monozyten aus dem Knochenmark

HINWEIS: Bei der Extraktion von Monozyten aus dem Knochenmark wird eine negative Selektionsstrategie verwendet, bei der Nicht-Monozyten, einschließlich Lymphozyten, natürliche Killerzellen, dendritische Zellen, erythroide Zellen und Granulozyten (d. h. Neutrophile), immunomagnetisch markiert und entfernt werden.

1. Euthanasieren Sie die Maus in Übereinstimmung mit AALAC und den institutionellen Richtlinien durch Isofluran-Überdosierung, gefolgt von der Entfernung des Herzens.
2. Entfernen Sie die Beine von der Maus. Bei kaltem HBSS präparieren Sie den Muskel von der Tibia und dem Oberschenkelknochen weg, bis die Knochen sauber sind.
3. Schneide vorsichtig beide Enden des Knochens ab. Spülen Sie das Knochenmark mit einer 10-ml-Spritze und einer 27-g-Nadel in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit PEB-Puffer aus. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
4. Führen Sie die Schritte 1.8-1.12 aus.
5. 175 μl PEB-Puffer, 25 μl FcR-Blockierungsreagenz und 50 μl Monozyten-Biotin-Antikörper-Cocktail pro 5 × 10⁷ Zellen insgesamt hinzufügen. 5 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
6. Waschen Sie mit 10 ml PEB-Puffer und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 4 °C bei 300 × g .
7. Sammeln Sie das Pellet und suspendieren Sie die Zellen in 500 μl PEB-Puffer und 100 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen. 10 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
8. Bereiten Sie magnetische Säulen (LS) auf einem Magnetständer vor. Befeuchten Sie die Säulen mit 1,0 mL PEB-Puffer.
9. Tragen Sie die Zellsuspension sofort auf die Säule auf. Verwenden Sie ein 15-ml-Röhrchen, um den Durchfluss zu sammeln, der die Monozyten enthält. Die Nicht-Monozyten sind an die magnetische Säule gebunden.
10. Waschen Sie die Säule 2x mit 1 mL PEB-Puffer. Zählen Sie die Monozyten mit einem Hämazytometer.
11. Um die Monozyten für den nächsten Schritt vorzubereiten, zentrifugieren Sie bei 300 × g für 10 min bei 4 °C. Für die Flussmittelanalyse resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml RPMI + 0,1 % FBS. Halten Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie in kaltem PEB und fahren Sie mit der Färbung fort.

3. Vorbereitung der Zellen für die Analyse des metabolischen Flusses

1. Hydratisieren Sie die Sensorkartusche (am Tag vor dem Assay)
   1. Nehmen Sie die Sensorkassette aus der Verpackung. Entfernen Sie die Sensorplatte (grün) aus den Vertiefungen und pipettieren Sie 200 μl Kalibrierungsflüssigkeit in jede Vertiefung. Setzen Sie die Sensorplatte wieder auf die Oberseite der Patronenplatte, so dass die Sensoren in die Kalibrierflüssigkeit eingetaucht sind.
   2. Stellen Sie die Kartusche über Nacht in einen nicht_{CO 2} -befeuchteten Inkubator (37 °C).
2. Plattieren der Zellen
   1. Plattieren Sie die Zellen in einer 96-Well-Kulturplatte in 200 μl Medium für mindestens 1 h. Lassen Sie mindestens eine Vertiefung für Hintergrundmessungen leer (verwenden Sie das gleiche Medienvolumen für leere Vertiefungen).
      HINWEIS: Die optimale Zellzahl sollte vor dem Experimentieren bestimmt werden. Weitere Informationen finden Sie unter "Tipps zur Fehlerbehebung" in der Diskussion.
   2. Wenn Sie bereit sind, den Assay durchzuführen, bereiten Sie das metabolische Flussmedium vor (d. h. basales RPMI oder DMEM ohne Glukose, Glutamin, Pyruvat usw.). Stellen Sie für den Glykolyse-Stresstest sicher, dass das Basalmedium mit 2 mM Glutamin ergänzt wird. Stellen Sie für den mitochondrialen Stresstest sicher, dass das Basalmedium mit 2 mM Glutamin, 10 mM Glukose und 1 mM Pyruvat ergänzt wird.
   3. Ersetzen Sie das alte Medium vorsichtig durch langsames Pipettieren durch neues Basalmedium (achten Sie darauf, keine Zellen zu entfernen). Überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie noch vorhanden sind.
   4. Legen Sie die Zellplatte in einen nicht CO₂ -befeuchteten Inkubator (37 °C).
3. Bestückung der Flussmittelplatte
   1. Nehmen Sie die hydratisierte Sensorpatrone/Flussmittelplatte aus dem Inkubator.
   2. Bereiten Sie die Testverbindungen entweder für die Glykolyse oder den mitochondrialen Stresstest vor.
      1. Glykolyse: Stellen Sie unter Verwendung von Glykolyse-Basalmedien Stammlösungen her, indem Sie Glukose in 3 ml, Oligomycin in 270 μl (100 μM) und 2-Desoxyglucose in 3 ml auflösen. Stellen Sie eine funktionierende Oligomycin-Lösung von 10 μM her.
      2. Mitochondrial: Unter Verwendung mitochondrialer Basalmedien stellen Sie Stammlösungen her, indem Sie Oligomycin in 630 μl (100 μM), Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) in 720 μl (100 μM) und Rotenon/Antimycin A in 540 μl (50 μM) auflösen. Erstellen Sie Arbeitslösungen aus Oligomycin (0,5-2,5 μM), FCCP (0,125-2,0 μM) und Rotenon/Antimycin A (0,5 μM).
         HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass 1,5 μM Oligomycin und 2,0 μM FCCP die besten Ergebnisse liefern.
   3. Laden Sie Testverbindungen in Ports mit den folgenden Volumina: Port A-20 μL, Port B-22 μL, Port C-25 μL, Port D-27 μL. Optional: Laden Sie das Medikament oder die Verbindung Ihrer Wahl in Port A und testen Sie Verbindungen in Port B, C und D, um akute Auswirkungen auf die Glykolyse oder die mitochondriale Atmung zu beurteilen. Wenn Sie kein zusätzliches Medikament oder Wirkstoff verwenden, lassen Sie Anschluss D leer.
4. Ausführen des Assays
   1. Öffnen Sie die Software und wählen Sie Mitochondrialer Belastungstest.
      HINWEIS: Dieses Programm kann auch für Glykolyse-Stresstests verwendet werden, da die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) gemessen wird.
   2. Wählen Sie die Vertiefungen aus, die verwendet werden sollen. Um den Hintergrund zu subtrahieren, stellen Sie sicher, dass mindestens 1 Vertiefung keine Zellen enthält.
   3. Führen Sie das Programm aus. Laden Sie die Flussmittelplatte mit abgenommenem Deckel, so dass die Platte kalibriert ist (~20 min).
   4. Nachdem die Platte kalibriert wurde, fordert die Software Sie auf, die Zellenplatte zu laden. Nehmen Sie die Zellplatte aus dem Inkubator, entfernen Sie die Unterseite der Flussmittelplatte und setzen Sie die Zellplatte in die Halterung ein. Drücken Sie auf Ausführen. Die Analyse wird ~2,5 Stunden in Anspruch nehmen.
   5. Analysieren Sie die Ergebnisse mit der Stoffwechselfluss-Software⁷ oder einer anderen Analysesoftware Ihrer Wahl.

Ergebnisse

Typische Zellzahlen, die aus den verschiedenen Geweben gewonnen werden, hängen von der Größe, dem Alter und dem Geschlecht des Tieres ab. Bei einer adulten männlichen Maus (d. h. 16 Wochen alt, ~30 g) kann die Milz 3,0-4,0 × 10⁶ Makrophagen liefern, während das Knochenmark (zwei Tibien und zwei Femure) typischerweise 1,0-1,5 × 10⁶ Monozyten liefert (Abbildung 2A). Das infarzierte Herz liefert in der Regel ebenfalls hohe Zahlen, a...

Diskussion

Unsere Methode beschreibt die schnelle Extraktion von Makrophagen aus Knochenmark, Milz und dem infarktierten Herzen, die dann zur Durchführung nachgelagerter Analysen wie der extrazellulären Stoffwechselflussanalyse verwendet werden können. Die Kombination dieser beiden Methoden ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um metabolische Veränderungen in Makrophagen unter verschiedenen Krankheits- oder Verletzungszuständen oder Stoffwechselzuständen wie Bewegung zu quantifizieren. Währen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine