Анализ метаболического потока ex vivo в селезеночных и сердечных макрофагах и моноцитах костного мозга

Резюме

Здесь мы подробно описываем методы извлечения макрофагов из костного мозга, селезенки и инфарктного сердца, а также последующей оценки метаболического потока в живых клетках.

Аннотация

Метаболическое перепрограммирование является отличительной чертой активации моноцитов/макрофагов и поляризации между про- и противовоспалительными состояниями. Например, провоспалительные (т.е. М1-подобные) моноциты/макрофаги демонстрируют большую зависимость от анаэробного гликолиза и меньшую зависимость от митохондриального окислительного фосфорилирования, в то время как противовоспалительные (М2-подобные) макрофаги демонстрируют большую зависимость от окисления глюкозы и жирных кислот в митохондриях. В данной статье мы подробно описываем протоколы экстракции макрофагов из двух основных резервуаров моноцитов/макрофагов в организме, селезенки и костного мозга, а также из поврежденных тканей, таких как сердце, после инфаркта миокарда.

Макрофаги или моноциты экстрагируются с помощью иммуномагнитной сортировки с использованием меченых антителами микрогранул, которые легко связываются с клетками без ущерба для их фенотипов. Затем извлеченные клетки культивируют в 96-луночных планшетах с последующим анализом внеклеточного потока с помощью анализатора метаболического потока. Как гликолиз, так и митохондриальное окислительное фосфорилирование могут быть измерены одновременно в небольшом количестве клеток (всего 2-3 × 10-5 клеток). Этот метод может быть легко выполнен за 1 день и дает надежные и воспроизводимые результаты. В конечном счете, эти методы помогают улучшить наше понимание метаболических изменений во время иммунных и воспалительных реакций на травму и заболевание, что может привести к разработке новых терапевтических мишеней для иммунометаболических путей.

Введение

Иммунометаболизм — это процветающая область, которая изучает роль метаболического перепрограммирования в иммунных клетках при различных патологических заболеваниях и состояниях повреждения. Макрофаги являются ключевой частью врожденной иммунной системы, которая играет важнейшую роль в воспалении, ответе на инфекцию, презентации антигена и заживлении ран¹. Понимание того, как макрофаги поляризуются между про- и противовоспалительными (М1-подобными и М2-подобными) субпопуляциями при различных болезненных состояниях, является областью продолжающихся и интенсивных исследований. Недавние исследования определили метаболическое перепрограммирование в качестве ключевого механизма, лежащего в основе поляризации макрофагов. Современная парадигма заключается в том, что, вообще говоря, М1-подобные макрофаги (которые, как правило, являются моноцитарными) больше полагаются на гликолиз для стимулирования провоспалительных функций, в то время как М2-подобные макрофаги больше полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование для подавления провоспалительных функций и стимулирования противовоспалительных процессов^. Понимание того, как метаболизм макрофагов изменяется при различных заболеваниях, может дать представление о потенциальных методах лечения, которые могут быть использованы для нацеливания на метаболические пути.

Например, наша лаборатория широко исследовала роль метаболического перепрограммирования макрофагов во время инфаркта миокарда (ИМ)^3,4,5. Макрофаги играют ключевую роль в воспалительной и ранозаживляющей реакции во время ИМ и, как таковые, претерпевают поляризацию от М1-подобных фенотипов к М2-подобным по мере того, как инфарктированное сердце подвергается ремоделированию с образованием замещающей рубцовой ткани. Используя описанные здесь методы, мы продемонстрировали, что эта поляризация характеризуется уникальными изменениями метаболизма глюкозы и глутамина, а также функции митохондрий. Описаны методы экстракции сердечных макрофагов, а также макрофагов селезенки и моноцитов костного мозга, которые могут быть объединены с анализом внеклеточного потока для оценки метаболического потока ex vivo за один день. Мы надеемся, что описанные методы предложат стандартизированный подход к оценке метаболических фенотипов иммунных клеток для повышения воспроизводимости в лабораториях, изучающих эту важную тему.

протокол

Приведенные ниже методы описывают протоколы экстракции макрофагов и проведения ex vivo анализа метаболического потока из инфарктного сердца после инфаркта миокарда, селезенки и костного мозга (рис. 1). Для ИМ сердца и селезенки используемый метод экстракции идентичен. Все протоколы с участием мышей были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Университета Миссисипи (протокол #1371, Мутон).

1. Экстракция макрофагов из инфарктного сердца и селезенки

Примечание: При экстракции тканевых макрофагов используется стратегия отрицательного отбора для сначала удаления нейтрофилов, которые помечены Ly6G-микрогранулами, а затем стратегия положительного отбора для получения макрофагов с CD11b-микрогранулами 3,4,5,6. Выполняя этот протокол, работайте быстро и держите клетки в холоде.

1. Усыпить мышь в соответствии с AALAC и институциональными рекомендациями путем передозировки изофлурана с последующим удалением сердца.
2. Быстро удалите сердце и селезенку и взвесьте ткани.
3. Перед проведением анализа готовят буфер PEB путем растворения ЭДТА (2 мМ) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (w/v) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Хранить в холоде.
4. Поместите сердце в холодный сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS). Пропустите через мясорубку стерильным скальпелем на мелкие кусочки.
5. Приготовьте раствор для разложения, содержащий 600 Ед/мл коллагеназы типа II и 60 Ед/мл ДНКазы типа I. Смешайте ткань с 10 мл раствора для разложения в пробирке для диссоциации клеток MACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте достаточное количество раствора для пищеварения, чтобы использовать 10 мл на каждую ткань (комнатной температуры).
6. Инкубируйте ткани с помощью клеточного диссоциатора в соответствии с протоколом производителя. При этом измельченная ткань будет инкубирована при 37 °C с мягким вращением в течение ~1 часа для получения клеточной суспензии.
7. Переместите суспензию в конические пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C.
8. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл буфера PEB. Чтобы получить одноклеточную суспензию, нанесите суспензию на фильтр 30 мкм.
9. Чтобы лизировать эритроциты, добавьте 10 мл 1x раствора для лизиса эритроцитов. Выдерживать 5-10 минут в темноте при температуре 4 °C.
10. Центрифугировать суспензию в течение 300 × г в течение 10 мин при 4 °С.
11. Суспендируйте гранулу в 1 мл ПЭБ и подсчитайте клетки с помощью гемацитометра.
12. Центрифугируйте суспензию при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C.
13. Для удаления нейтрофилов готовят микрогранулы, смешивая 90 мкл буфера PEB с 10 мкл микрогранул анти-Ly6G на^10-7 клеток. Смешайте клеточную гранулу с микрогранулированной суспензией и инкубируйте в течение 10 минут в темноте при температуре 4 °C.
14. Чтобы вымыть несвязанные микрогранулы, добавьте 10 мл буфера PEB и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 минут при 4 °C.
15. Подготовьте магнитные колонки (МС или ЛС) на магнитной подставке. Увлажните колонки, добавив 0,5-1,0 мл буфера PEB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для тканей с большим количеством иммунных клеток (например, селезенки) магнитный столб может легко закупориться и перестать течь. Таким образом, мы рекомендуем использовать колонки LS для селезенки.
16. Повторно суспендируйте клеточную таблетку в 500 μл буфера PEB. Добавьте клеточную суспензию к магнитной колонке и пропустите через нее немеченые клетки (т.е. ненейтрофилы). Промойте колонку 2 раза 500 мкл буфера PEB. Соберите немеченные клетки (т.е. макрофаги и другие клетки) в коническую пробирку объемом 15 мл.
17. Центрифугируйте суспензию при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C.
18. Приготовьте микрогранулы, смешав 90 мкл буфера PEB с 10 мкл микрогранул анти-CD11b на 10^{7 клеток} . Смешайте клеточную гранулу с микрогранулированной суспензией и инкубируйте в течение 15 минут в темноте при температуре 4 °C.
19. Повторите шаги 1.13-1.15.
20. Помеченные макрофаги будут привязаны к магнитной колонке. Чтобы собрать их, отсоедините магнитную колонку от магнитной стойки и поместите ее над новой конической трубкой объемом 15 мл.
21. Добавьте в колонку 1 мл среды RPMI с добавлением 0,1% фетальной бычьей сыворотки (FBS). С помощью поршня извлеките макрофаги в пробирку. Подсчитайте макрофаги с помощью гемацитометра.
    Примечание: Теперь макрофаги находятся в пробирке и готовы к использованию для дальнейших анализов.

2. Экстракция моноцитов из костного мозга

Примечание: При экстракции моноцитов из костного мозга используется стратегия отрицательного отбора, при которой немоноциты, включая лимфоциты, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки, эритроидные клетки и гранулоциты (т.е. нейтрофилы), иммуномагнитно мечаются и удаляются.

1. Усыпить мышь в соответствии с AALAC и институциональными рекомендациями путем передозировки изофлурана с последующим удалением сердца.
2. Снимите ножки с мыши. При холодном HBSS рассеките мышцу в сторону от большеберцовой и бедренной костей, пока кости не станут чистыми.
3. Аккуратно отрежьте оба конца косточки. С помощью шприца объемом 10 мл с иглой 27 G промыть костный мозг в коническую трубку объемом 15 мл с буфером PEB. Центрифугируйте суспензию при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C.
4. Выполните шаги 1.8-1.12.
5. Добавьте 175 мкл буфера PEB, 25 мкл реагента-блокатора FcR и 50 мкл коктейля биотин-антител моноцитов на 5 × 10⁷ от общего количества клеток. Выдерживать 5 минут в темноте при температуре 4 °C.
6. Промойте, добавив 10 мл буфера PEB, и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 минут при 4 °C.
7. Соберите гранулу и повторно суспендируйте клетки в 500 мкл буфера PEB и 100 мкл микрогранул антибиотина. Выдерживать 10 минут в темноте при температуре 4 °C.
8. Подготовьте магнитные колонки (ЛС) на магнитной подставке. Увлажните колонки, добавив 1,0 мл буфера PEB.
9. Сразу же нанесите клеточную суспензию на колонку. Используйте пробирку объемом 15 мл для сбора проточного канала, который содержит моноциты. Немоноциты связываются с магнитной колонкой.
10. Промойте колонку 2 раза 1 мл буфера PEB. Подсчитайте моноциты с помощью гемацитометра.
11. Чтобы подготовить моноциты к следующему этапу, центрифугируйте при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C. Для анализа потока ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл RPMI + 0,1% FBS. Для проточной цитометрии держите клетки в холодном PEB и приступайте к окрашиванию.

3. Подготовка клеток к анализу метаболических потоков

1. Гидратация сенсорного картриджа (за день до анализа)
   1. Извлеките картридж датчика из упаковки. Снимите сенсорную пластину (зеленого цвета) с лунок и внесите пипеткой 200 мкл калибровочной жидкости в каждую лунку. Поместите пластину датчика обратно на верхнюю часть пластины картриджа так, чтобы датчики были погружены в жидкость калибра.
   2. Поместите картридж в увлажнённый инкубатор без CO₂ (37 °C) на ночь.
2. Покрытие ячеек
   1. Поместите клетки в 96-луночный культуральный планшет в среду с концентрацией 200 мкл в течение не менее 1 ч. Оставьте хотя бы одну лунку пустой для фоновых измерений (используйте тот же объем среды для глухих лунок).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное количество клеток должно быть определено до начала эксперимента. Для получения более подробной информации см. раздел «Советы по устранению неполадок» в обсуждении.
   2. Когда вы будете готовы к проведению анализа, приготовьте метаболические флюсовые среды (т.е. базальные RPMI или DMEM без глюкозы, глутамина, пирувата и т.д.). Для стресс-теста на гликолиз убедитесь, что в базальную среду добавлено 2 мМ глутамина. Для проведения митохондриального стресс-теста убедитесь, что в базальную среду добавлено 2 мМ глутамина, 10 мМ глюкозы и 1 мМ пирувата.
   3. Осторожно замените старую среду новой базальной средой путем медленного пипетирования (будьте осторожны, чтобы не сместить клетки). Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они все еще присутствуют.
   4. Поместите камеру во влажный инкубатор без содержания_CO2 (37 °C).
3. Загрузка флюсовой пластины
   1. Извлеките из инкубатора картридж с гидратированным датчиком/флюсовую пластину.
   2. Подготовьте исследуемые соединения для гликолиза или митохондриального стресс-теста.
      1. Гликолиз: с помощью гликолиза базальную среду создают исходные растворы путем растворения глюкозы в 3 мл, олигомицина в 270 мкл (100 мкМ) и 2-дезоксиглюкозы в 3 мкл. Создать рабочий раствор олигомицина с концентрацией 10 мкМ.
      2. Митохондриальный: Используя митохондриальную базальную среду, создать исходные растворы путем растворения олигомицина в 630 мкл (100 мкМ), карбонилцианида--трифторметоксифенилгидразона (FCCP) в 720 мкл (100 мкМ) и ротенона/антимицина А в 540 мкл (50 мкМ). Создают рабочие растворы олигомицина (0,5-2,5 мкМ), ФКХП (0,125-2,0 мкМ) и ротенона/антимицина А (0,5 мкМ).
         Примечание: Мы обнаружили, что 1,5 мкМ олигомицин и 2,0 мкМ FCCP дают наилучшие результаты.
   3. Загрузите тестовые соединения в порты с использованием следующих объемов: порт A-20 μL, порт B-22 μL, порт C-25 μL, порт D-27 μL. Дополнительно: загрузите лекарственный препарат или соединение по вашему выбору в порт A, а тестовые соединения в порты B, C и D для оценки острого воздействия на гликолиз или митохондриальное дыхание. Если вы не используете дополнительный препарат или соединение, оставьте порт D пустым.
4. Проведение анализа
   1. Откройте программу и выберите «Митохондриальный стресс-тест».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта программа также может быть использована для стресс-теста гликолиза, так как измеряется скорость внеклеточного закисления (ECAR).
   2. Выберите скважины, которые будут использоваться. Чтобы вычесть фон, следите за тем, чтобы хотя бы в 1 лунке не было ячеек.
   3. Запустите программу. Загрузите флюсовую пластину со снятой крышкой, чтобы пластина была откалибрована (~20 мин).
   4. После калибровки пластины программное обеспечение выдаст запрос на загрузку пластины ячейки. Выньте клеточную пластину из инкубатора, снимите нижнюю часть флюсовой пластины и поместите клеточную пластину в держатель. Нажмите run. Анализ займет ~2,5 часа.
   5. Анализируйте результаты с помощью программного обеспечения для управления метаболическим потоком⁷ или другого аналитического программного обеспечения по вашему выбору.

Результаты

Типичное количество клеток, полученных из различных тканей, зависит от размера, возраста и пола животного. У взрослого самца мыши (т.е. 16 недель, ~30 г) селезенка может давать 3,0-4,0 × 10⁶ макрофагов, в то время как костный мозг (две большеберцовые кости и две бедренные к?...

Обсуждение

Наш метод подробно описывает быстрое извлечение макрофагов из костного мозга, селезенки и инфарктного сердца, которые затем могут быть использованы для выполнения последующих анализов, таких как анализ внеклеточного метаболического потока. Комбинация этих двух мет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine