ניתוח שטף מטבולי ex vivo במקרופאגים של הטחול והלב, ומונוציטים של מח העצם

Summary

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטות לחילוץ מקרופאגים ממח העצם, הטחול והלב האוטם, ולאחר מכן הערכת שטף מטבולי בתאים חיים.

Abstract

תכנות מחדש מטבולי הוא סימן היכר של הפעלת מונוציטים/מקרופאגים וקיטוב בין מצבים פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתיים. לדוגמה, מונוציטים/מקרופאגים פרו-דלקתיים (כלומר, דמויי M1) מציגים הסתמכות רבה יותר על גליקוליזה אנאירובית ופחות הסתמכות על זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי, בעוד שמקרופאגים אנטי דלקתיים (דמויי M2) מציגים הסתמכות רבה יותר על חמצון גלוקוז וחומצות שומן במיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מעמיקים לחילוץ מקרופאגים משני מאגרי המונוציטים/מקרופאגים העיקריים בגוף, הטחול ומח העצם, כמו גם רקמות פגועות כמו הלב בעקבות אוטם שריר הלב.

מקרופאגים או מונוציטים מופקים על ידי מיון אימונומגנטי באמצעות מיקרו-חרוזים מתויגים על ידי נוגדנים, הנקשרים בקלות לתאים מבלי לפגוע בפנוטיפים שלהם. לאחר מכן מתרבתים התאים המופקים בצלחות של 96 בארות, ולאחר מכן ניתוח שטף חוץ-תאי באמצעות מנתח שטף מטבולי. ניתן למדוד בו זמנית גם גליקוליזה וגם זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי במספר קטן של תאים (עד 2-3 × 10⁵ תאים). ניתן לבצע שיטה זו בקלות תוך יום אחד ומניבה תוצאות אמינות וחוזרות על עצמן. בסופו של דבר, שיטות אלו עוזרות לשפר את ההבנה שלנו לגבי שינויים מטבוליים במהלך תגובות חיסוניות ודלקתיות לפציעות ומחלות, מה שיכול להוביל לפיתוח מטרות טיפוליות חדשות למסלולים אימונומטבוליים.

Introduction

אימונומטבוליזם הוא תחום פורח החוקר את תפקידו של תכנות מחדש מטבולי בתאי חיסון במצבי מחלות ופציעה פתולוגיים שונים. מקרופאגים הם חלק מרכזי במערכת החיסון המולדת הממלאים תפקידים קריטיים בדלקת, תגובה לזיהום, הצגת אנטיגן וריפוי פצעים¹. הבנת האופן שבו מקרופאגים מקטבים בין תת-קבוצות פרו-דלקתיות ואנטי-דלקתיות (דמויות M1 ודמויות M2) במצבי מחלה שונים היא תחום של מחקר מתמשך ואינטנסיבי. מחקרים אחרונים זיהו תכנות מחדש מטבולי כמנגנון מרכזי העומד בבסיס קיטוב המקרופאגים. הפרדיגמה הנוכחית היא שבאופן כללי, מקרופאגים דמויי M1 (שהם בדרך כלל דמויי מונוציטים) מסתמכים יותר על גליקוליזה כדי לתדלק פונקציות פרו-דלקתיות, בעוד שמקרופאגים דמויי M2 מסתמכים יותר על זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי כדי לדכא תפקודים פרו-דלקתיים ולתדלק תהליכים אנטי דלקתיים². הבנת האופן שבו חילוף החומרים של מקרופאגים משתנה במצבי מחלה שונים יכולה לספק תובנה לגבי טיפולים פוטנציאליים שניתן להשתמש בהם כדי למקד מסלולים מטבוליים.

כדוגמה, המעבדה שלנו חקרה בהרחבה את התפקיד של תכנות מחדש מטבולי של מקרופאגים במהלך אוטם שריר הלב (MI)^3,4,5. מקרופאגים ממלאים תפקיד מפתח בתגובה הדלקתית וריפוי הפצעים במהלך MI וככאלה, עוברים קיטוב מפנוטיפים דמויי M1 לכיוון M2 כאשר הלב האוטם עובר שיפוץ ליצירת רקמת צלקת חלופית. באמצעות השיטות המתוארות כאן, הראינו כי קיטוב זה מאופיין בשינויים ייחודיים בחילוף החומרים של גלוקוז וגלוטמין ובתפקוד המיטוכונדריה. אנו מתארים שיטות למיצוי מקרופאגים לבביים, כמו גם מקרופאגים טחוליים ומונוציטים של מח עצם, שניתן לשלב עם ניתוח שטף חוץ-תאי כדי להעריך שטף מטבולי מחוץ לגוף ביום אחד. אנו מקווים שהשיטות המתוארות מציעות גישה סטנדרטית להערכת פנוטיפים מטבוליים של תאי חיסון כדי לשפר את יכולת השחזור במעבדות החוקרות נושא חשוב זה.

Protocol

השיטות שלהלן מתארות פרוטוקולים למיצוי מקרופאגים וביצוע ניתוח ex vivo של שטף מטבולי מהלב האוטם בעקבות MI, הטחול ומח העצם (איור 1). עבור הלב והטחול MI, שיטת המיצוי המשמשת זהה. כל הפרוטוקולים הקשורים לעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי (פרוטוקול #1371, מוטון).

1. מיצוי מקרופאגים מהאוטם הלב והטחול

הערה: מיצוי מקרופאגים ברקמות משתמש באסטרטגיית ברירה שלילית כדי להסיר תחילה נויטרופילים, המסומנים במיקרו-חרוזי Ly6G, ולאחר מכן אסטרטגיית ברירה חיובית להשגת מקרופאגים עם מיקרו-חרוזי CD11b 3,4,5,6. בעת ביצוע פרוטוקול זה, עבדו במהירות ושמרו על התאים קרים.

1. המתת חסד של העכבר בהתאם ל-AALAC ולהנחיות מוסדיות על ידי מנת יתר של איזופלורן ואחריה הסרת הלב.
2. הסר את הלב והטחול במהירות ושקל את הרקמות.
3. לפני הבדיקה, הכן מאגר PEB על ידי המסת EDTA (2 מ"מ) ו-0.5% אלבומין בסרום בקר (w/v) בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS). שמור על קור.
4. הניחו את הלב בתמיסת המלח המאוזנת הקרה של האנק (HBSS). טוחנים בעזרת אזמל סטרילי לחתיכות קטנות.
5. הכן תמיסת עיכול המכילה 600 U/mL קולגנאז מסוג II ו-60 U/mL DNase מסוג I. מערבבים את הרקמה ב-10 מ"ל מתמיסת העיכול בצינור דיסוציאציה של תאי MACS.
   הערה: הכינו מספיק מתמיסת העיכול כדי להשתמש ב-10 מ"ל לכל רקמה (טמפרטורת החדר).
6. דגירה על הרקמות באמצעות דיסוציאטור התאים על פי פרוטוקול היצרן. זה ידגר את הרקמה הטחונה ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין למשך ~ שעה כדי ליצור תרחיף תאים.
7. העבר את המתלה לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
8. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מאגר PEB. כדי ליצור מתלה חד-תא, החל את המתלה על מסנן של 30 מיקרומטר.
9. כדי ליז כדוריות דם אדומות, הוסף 10 מ"ל של תמיסת ליזה של תאי דם אדומים 1x. יש לדגור במשך 5-10 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
10. צנטריפוגה המתלה ל-300 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
11. השעו מחדש את הגלולה ב -1 מ"ל PEB וספרו את התאים באמצעות המציטומטר.
12. צנטריפוגה את המתלה ב-300 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
13. להסרת נויטרופילים, הכינו מיקרו-חרוזים על ידי ערבוב של 90 מיקרוליטר של מאגר PEB עם 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד Ly6G לכל 10⁷ תאים. מערבבים את כדור התא עם תרחיף המיקרו-חרוזים ודוגרים במשך 10 דקות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס.
14. כדי לשטוף מיקרו-חרוזים לא קשורים, הוסף 10 מ"ל של מאגר PEB וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
15. הכן עמודים מגנטיים (MS או LS) על מעמד מגנטי. הרטיבו את העמודות על ידי הוספת 0.5-1.0 מ"ל של מאגר PEB.
    הערה: עבור רקמות עם שפע של תאים חיסוניים (כלומר, טחול), העמוד המגנטי יכול בקלות להיסתם ולהפסיק לזרום. לפיכך, אנו ממליצים להשתמש בעמודות LS לטחול.
16. השעו מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של מאגר PEB. הוסף את תרחיף התא לעמודה המגנטית ותן לתאים הלא מסומנים (כלומר, לא נויטרופילים) לרוץ דרכם. שטפו את העמודה פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מאגר PEB. אסוף את התאים הלא מסומנים (כלומר, מקרופאגים ותאים אחרים) בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
17. צנטריפוגה את המתלה ב-300 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
18. הכן מיקרו-חרוזים על ידי ערבוב של 90 מיקרוליטר של מאגר PEB עם 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד CD11b לכל 10⁷ תאים. מערבבים את כדור התא עם תרחיף המיקרו-חרוזים ודוגרים למשך 15 דקות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס.
19. חזור על שלבים 1.13-1.15.
20. המקרופאגים המסומנים יהיו קשורים לעמודה המגנטית. כדי לאסוף אותם, נתק את העמוד המגנטי מהמעמד המגנטי והנח אותו מעל צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל.
21. הוסף 1 מ"ל של מדיית RPMI בתוספת 0.1% סרום בקר עוברי (FBS) לעמודה. השתמש בבוכנה כדי לחלץ את המקרופאגים לתוך הצינור. ספרו את המקרופאגים באמצעות המציטומטר.
    הערה: המקרופאגים נמצאים כעת בצינור ומוכנים לשימוש לבדיקות נוספות.

2. מיצוי מונוציטים ממח העצם

הערה: מיצוי מונוציטים ממח העצם משתמש באסטרטגיית ברירה שלילית שבה לא-מונוציטים, כולל לימפוציטים, תאי הרג טבעיים, תאים דנדריטים, תאים אריתרואידים וגרנולוציטים (כלומר, נויטרופילים), מסומנים ומוסרים אימונומגנטית.

1. המתת חסד של העכבר בהתאם ל-AALAC ולהנחיות מוסדיות על ידי מנת יתר של איזופלורן ואחריה הסרת הלב.
2. הסר את הרגליים מהעכבר. ב-HBSS קר, נתחו את השריר הרחק מעצם השוק ועצם הירך עד שהעצמות נקיות.
3. חותכים בזהירות את שני קצוות העצם. בעזרת מזרק של 10 מ"ל עם מחט של 27 גרם, שטפו את מח העצם לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל עם מאגר PEB. צנטריפוגה את המתלה ב-300 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
4. בצע את שלבים 1.8-1.12.
5. הוסף 175 מיקרוליטר של מאגר PEB, 25 מיקרוליטר של מגיב חוסם FcR ו-50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים ביוטין מונוציטים לכל 5 × 10⁷ מכלל התאים. יש לדגור במשך 5 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. יש לשטוף על ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר PEB וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
7. אסוף את הגלולה והשהה מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר PEB ו-100 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין. יש לדגור במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
8. הכן עמודים מגנטיים (LS) על מעמד מגנטי. הרטיבו את העמודות על ידי הוספת 1.0 מ"ל של מאגר PEB.
9. החל מיד את מתלה התא על העמודה. השתמש בצינור של 15 מ"ל כדי לאסוף את הזרימה, המכילה את המונוציטים. הלא-מונוציטים קשורים לעמודה המגנטית.
10. שטפו את העמודה פעמיים עם 1 מ"ל של מאגר PEB. ספרו את המונוציטים באמצעות המציטומטר.
11. להכנת המונוציטים לשלב הבא, צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לניתוח שטף, השעו מחדש את גלולת התא ב -1 מ"ל של RPMI + 0.1% FBS. עבור ציטומטריית זרימה, שמור את התאים ב- PEB קר והמשך בצביעה.

3. הכנת תאים לניתוח שטף מטבולי

1. לחות את מחסנית החיישן (יום לפני הבדיקה)
   1. הסר את מחסנית החיישן מהאריזה שלה. הסר את לוחית החיישן (ירוקה) מהבארות ופיפטה 200 מיקרוליטר של נוזל קליברנט לכל באר. הנח את לוחית החיישן בחזרה על החלק העליון של לוחית המחסנית כך שהחיישנים יהיו שקועים בנוזל הקליברנט.
   2. הנח את המחסנית בחממה לחה שאינה CO₂ (37 מעלות צלזיוס) למשך הלילה.
2. ציפוי התאים
   1. צלחת את התאים בצלחת תרבית של 96 בארות ב-200 מיקרוליטר מדיה למשך שעה לפחות. השאר לפחות באר אחת ריקה למדידות ברקע (השתמש באותו נפח מדיה עבור בארות ריקות).
      הערה: יש לקבוע את מספר התאים האופטימלי לפני הניסוי. ראה "טיפים לפתרון בעיות" בדיון לפרטים נוספים.
   2. כאשר מוכנים לבצע את הבדיקה, הכינו את אמצעי השטף המטבולי (כלומר, RPMI בסיסי או DMEM ללא גלוקוז, גלוטמין, פירובט וכו'). לבדיקת המאמץ של גליקוליזה, ודא שהמדיה הבסיסית מקבלת תוספת של 2 מ"מ גלוטמין. לבדיקת המאמץ המיטוכונדריאלי, ודא שהמדיה הבסיסית משלימה 2 מ"מ גלוטמין, 10 מ"מ גלוקוז ו-1 מ"מ פירובאט.
   3. החלף בזהירות את המדיה הישנה במדיה בזאלית חדשה על ידי פיפטינג איטי (היזהר לא לעקור תאים). בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם עדיין קיימים.
   4. הנח את לוחית התא בחממה לחה שאינה CO₂ (37 מעלות צלזיוס).
3. טוען את צלחת השטף
   1. אחזר את מחסנית החיישן המיובשת/לוחית השטף מהחממה.
   2. הכן את תרכובות הבדיקה לגליקוליזה או לבדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי.
      1. גליקוליזה: באמצעות מדיה בזאלית של גליקוליזה, צור תמיסות מלאי על ידי המסת גלוקוז ב-3 מ"ל, אוליגומיצין ב-270 מיקרוליטר (100 מיקרומטר) ו-2-דאוקסיגלוקוז ב-3 מ"ל. צור תמיסת אוליגומיצין עובדת של 10 מיקרומטר.
      2. מיטוכונדריה: באמצעות מדיה בסיסית מיטוכונדריאלית, צור תמיסות מלאי על ידי המסת אוליגומיצין ב-630 מיקרוליטר (100 מיקרומטר), קרבוניל ציאניד-p-טריפלואורומטוקסיפנילהידרזון (FCCP) ב-720 מיקרוליטר (100 מיקרומטר), ורוטנון/אנטימיצין A ב-540 מיקרוליטר (50 מיקרומטר). צור פתרונות עבודה של אוליגומיצין (0.5-2.5 מיקרומטר), FCCP (0.125-2.0 מיקרומטר) ורוטנון/אנטימיצין A (0.5 מיקרומטר).
         הערה: מצאנו ש-1.5 מיקרומטר אוליגומיצין ו-2.0 מיקרומטר FCCP מניבים את התוצאות הטובות ביותר.
   3. טען תרכובות בדיקה ליציאות באמצעות הנפחים הבאים: יציאה A-20 μL, יציאה B-22 μL, יציאה C-25 μL, יציאה D-27 μL. אופציונלי: טען תרופה או תרכובת לבחירתך ליציאה A, ובדוק תרכובות ליציאה B, C ו-D כדי להעריך השפעות חריפות על גליקוליזה או נשימה מיטוכונדריאלית. אם אינך משתמש בתרופה או בתרכובת נוספת, השאר את יציאה D ריקה.
4. הפעלת הבדיקה
   1. פתח את התוכנה ובחר מבחן מאמץ מיטוכונדריאלי.
      הערה: ניתן להשתמש בתוכנית זו גם לבדיקת מאמץ גליקוליזה, שכן נמדד קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR).
   2. בחר את הבארות שישמשו אותן. כדי להחסיר את הרקע, ודא שלפחות באר אחת אינה מכילה תאים.
   3. הפעל את התוכנית. טען את לוחית השטף כשהמכסה מוסר כך שהצלחת מכוילת (~20 דקות).
   4. לאחר כיול הצלחת, התוכנה תיתן הנחיה לטעון את לוחית התא. הוצא את לוחית התא מהחממה, הסר את החלק התחתון של לוחית השטף והנח את לוחית התא במחזיק. לחץ על הפעלה. השלמת הבדיקה תימשך ~2.5 שעות.
   5. נתח את התוצאות באמצעות תוכנת שטף מטבולי⁷ או תוכנה אנליטית אחרת לבחירתך.

תוצאות

מספרי תאים טיפוסיים המתקבלים מהרקמות השונות תלויים בגודל, בגיל ובמין של החיה. עבור עכבר זכר בוגר (כלומר, בן 16 שבועות, ~30 גרם), הטחול עשוי להניב 3.0-4.0 ×-10⁶ מקרופאגים, בעוד שמח העצם (שני טיביות ושני עצם הירך) מניב בדרך כלל 1.0-1.5 ×-10⁶ מונוציטים (איור 2A). הל...

Discussion

השיטה שלנו מפרטת את המיצוי המהיר של מקרופאגים ממח העצם, הטחול והלב האוטם, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם לביצוע ניתוחים במורד הזרם כגון ניתוח שטף מטבולי חוץ-תאי. השילוב של שתי השיטות הללו הוא כלי רב עוצמה שיכול לכמת שינויים מטבוליים במקרופאגים במצבי מחלה או פציעה שונים, או ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine