脾臓および心臓マクロファージおよび骨髄単球における ex vivo 代謝フラックスの解析

要約

ここでは、骨髄、脾臓、梗塞性心筋からマクロファージを抽出し、その後、生細胞の代謝フラックスを評価する方法を詳しく紹介します。

要約

代謝リプログラミングは、単球/マクロファージの活性化と炎症誘発性状態と抗炎症状態の間の分極の特徴です。例えば、炎症誘発性(すなわち、M1様)単球/マクロファージは、嫌気性解糖への依存度が高く、ミトコンドリアの酸化的リン酸化への依存度が低いのに対し、抗炎症性(M2様)マクロファージは、ミトコンドリアのグルコースおよび脂肪酸酸化への依存度が高いことを示しています。ここでは、体内の2つの主要な単球/マクロファージリザーバーである脾臓と骨髄、および心筋梗塞後の心臓などの損傷組織からマクロファージを抽出するための詳細なプロトコルについて説明します。

マクロファージまたは単球は、抗体タグ付きマイクロビーズを用いた免疫磁気選別により抽出され、表現型を損なうことなく細胞に容易に結合します。次に、抽出した細胞を96ウェルプレートで培養し、続いて代謝フラックスアナライザーを使用した細胞外フラックス分析を行います。解糖系とミトコンドリアの酸化的リン酸化は、少数の細胞(わずか2〜3細胞×10〜⁵ 細胞)で同時に測定できます。この方法は1日で簡単に実行でき、信頼性と再現性のある結果が得られます。最終的に、これらの方法は、損傷や疾患に対する免疫応答および炎症反応中の代謝変化の理解を深めるのに役立ち、免疫代謝経路の新規治療標的の開発につながる可能性があります。

概要

免疫代謝は、さまざまな病理学的疾患や損傷状態における免疫細胞における代謝リプログラミングの役割を研究する開花分野です。マクロファージは、炎症、感染反応、抗原提示、創^傷治癒に重要な役割を果たす自然免疫系の重要な部分です1。マクロファージが、異なる疾患状態において炎症誘発性サブセットと抗炎症性サブセット(M1様およびM2様)サブセットの間でどのように分極するかを理解することは、現在進行中の集中的な研究分野です。最近の研究では、代謝リプログラミングがマクロファージの分極の根底にある重要なメカニズムであることが特定されています。現在のパラダイムでは、大まかに言えば、M1様マクロファージ(通常は単球様)は炎症誘発性機能を促進するために解糖系に依存しているのに対し、M2様マクロファージは炎症誘発性機能を抑制し、抗炎症プロセスを促進するためにミトコンドリアの酸化的リン酸化に依存しているというものです²。マクロファージの代謝がさまざまな病状でどのように変化するかを理解することで、代謝経路を標的とするために使用できる可能性のある治療法についての洞察を得ることができます。

一例として、当研究室では、心筋梗塞(^MI)3,4,5におけるマクロファージ代謝リプログラミングの役割について幅広く研究しています。マクロファージは、心筋梗塞中の炎症反応および創傷治癒反応において重要な役割を果たしており、そのため、梗塞した心臓がリモデリングを受けて補充瘢痕組織を形成するときに、M1様からM2様の表現型への分極を受けます。本明細書に記載の方法を用いて、我々は、この分極がグルコースおよびグルタミン代謝、ならびにミトコンドリア機能の独特な変化によって特徴付けられることを実証した。心筋マクロファージ、脾臓マクロファージ、骨髄単球の抽出方法について説明し、細胞外フラックス分析と組み合わせることで、1日でex vivo代謝フラックスを評価することができます。今回紹介した方法が、免疫細胞の代謝表現型を評価するための標準化されたアプローチを提供し、この重要なトピックを研究するラボ間の再現性を向上させることを願っています。

プロトコル

以下の方法では、マクロファージを抽出し、心筋梗塞後の心筋梗塞、脾臓、および骨髄からの代謝フラックスの ex vivo 分析を行うためのプロトコルについて説明します(図1)。心筋梗塞と脾臓の場合、使用される抽出方法は同じです。マウスを含むすべてのプロトコルは、ミシシッピ大学医療センターの施設内動物管理および使用委員会(プロトコル#1371、ムートン)によって承認されました。

1. 梗塞性心筋と脾臓からのマクロファージの抽出

注:組織マクロファージの抽出は、まずLy6Gマイクロビーズで標識された好中球を除去するためのネガティブ選択戦略を使用し、次にCD11bマイクロビーズ3,4,5,6でマクロファージを得るためのポジティブ選択戦略を使用する。このプロトコールを実施するときは、迅速に作業し、細胞を冷たく保ってください。

1. AALACおよび施設のガイドラインに従って、イソフルランの過剰摂取とそれに続く心臓の除去によりマウスを安楽死させます。
2. 心臓と脾臓をすばやく取り除き、組織の重さを量ります。
3. アッセイに先立ち、EDTA(2 mM)と0.5%ウシ血清アルブミン(w/v)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解してPEB緩衝液を調製します。冷やしてください。
4. 心臓を冷たいハンクのバランス塩溶液(HBSS)に入れます。滅菌メスで細かく刻む。
5. 600 U/mL コラゲナーゼ II 型と 60 U/mL DNase I 型を含む消化溶液を調製し、MACS 細胞解離チューブ内の 10 mL の消化溶液に組織を混合します。
   注:各組織(室温)に10 mLを使用するのに十分な消化液を作ります。
6. 細胞解離器を使用して、製造元のプロトコルに従って組織をインキュベートします。これにより、ミンチ組織を37°Cでインキュベートし、~1時間穏やかに回転させて細胞懸濁液を生成します。
7. 懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
8. ペレットを1 mLのPEBバッファーに再懸濁します。シングルセル懸濁液を生成するには、懸濁液を30μmフィルターに塗布します。
9. 赤血球を溶解するには、1x 1x 赤血球溶解液 10 mL を加えます。暗所4°Cで5〜10分間インキュベートします。
10. 懸濁液を300 × g 、4°Cで10分間遠心分離します。
11. ペレットを1 mLのPEBに再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
12. 懸濁液を300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
13. 好中球を除去するには、10^{7細胞あたり} 90 μLのPEBバッファーと10 μLの抗Ly6Gマイクロビーズを混合してマイクロビーズを調製します。細胞ペレットをマイクロビーズ懸濁液と混合し、4°Cの暗所で10分間インキュベートします。
14. 未結合のマイクロビーズを洗い流すには、10 mLのPEBバッファーを加え、300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
15. 磁気スタンドに磁気カラム(MSまたはLS)を調製します。0.5-1.0 mLのPEBバッファーを加えてカラムを湿らせます。
    注:免疫細胞が豊富な組織(脾臓など)の場合、磁気カラムが詰まりやすく、流れが止まることがあります。したがって、脾臓にはLSカラムを使用することをお勧めします。
16. 細胞ペレットを500 μLのPEBバッファーに再懸濁します。細胞懸濁液を磁気カラムに加え、非標識細胞(すなわち、非好中球)を通過させます。カラムを500 μLのPEBバッファーで2回洗浄します。標識されていない細胞(マクロファージや他の細胞など)を15 mLのコニカルチューブに集めます。
17. 懸濁液を300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
18. 10^{7細胞あたり} 90 μLのPEBバッファーと10 μLの抗CD11bマイクロビーズを混合してマイクロビーズを調製します。細胞ペレットをマイクロビーズ懸濁液と混合し、4°Cの暗所で15分間インキュベートします。
19. 手順1.13〜1.15を繰り返します。
20. 標識されたマクロファージは磁気カラムに結合します。それらを収集するには、磁気カラムを磁気スタンドから取り外し、新しい15 mLコニカルチューブの上に置きます。
21. 0.1% ウシ胎児血清(FBS)を添加した RPMI 培地 1 mL をカラムに加えます。プランジャーを使用して、マクロファージをチューブに抽出します。血球計算盤を使用してマクロファージをカウントします。
    注:マクロファージはチューブ内にあり、さらなるアッセイに使用する準備ができています。

2. 骨髄からの単球の抽出

注:骨髄からの単球の抽出は、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、赤血球、および顆粒球(すなわち、好中球)を含む非単球を免疫磁気的に標識して除去するネガティブセレクション戦略を使用します。

1. AALACおよび施設のガイドラインに従って、イソフルランの過剰摂取とそれに続く心臓の除去によりマウスを安楽死させます。
2. マウスから脚を取り外します。冷たいHBSSでは、骨がきれいになるまで、筋肉を脛骨と大腿骨から離剖します。
3. 骨の両端を慎重に切り取ります。27 G針付きの10 mLシリンジを使用して、骨髄をPEBバッファー付きの15 mLコニカルチューブに洗い流します。懸濁液を300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
4. 手順1.8〜1.12を実行します。
5. 全細胞の5×10⁷ に対して、175 μLのPEBバッファー、25 μLのFcRブロッキング試薬、および50 μLの単球ビオチン抗体カクテルを添加します。暗所4°Cで5分間インキュベートします。
6. PEBバッファー10 mLを加えて洗浄し、300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
7. ペレットを回収し、500 μLのPEBバッファーと100 μLの抗ビオチンマイクロビーズに細胞を再懸濁します。暗所4°Cで10分間インキュベートします。
8. 磁気スタンドに磁気カラム(LS)を準備します。1.0 mLのPEBバッファーを加えてカラムを湿らせます。
9. すぐに細胞懸濁液をカラムに塗布します。15mLのチューブを使用して、単球を含むフロースルーを回収します。非単球は磁気カラムに結合しています。
10. カラムを1 mLのPEBバッファーで2回洗浄します。血球計算盤を使用して単球を数えます。
11. 次のステップのために単球を調製するには、300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 フラックス分析では、細胞ペレットを1 mLのRPMI + 0.1% FBSに再懸濁します。フローサイトメトリーでは、細胞を冷たいPEBに保持し、染色を進めます。

3. 代謝フラックス解析のための細胞の調製

1. センサーカートリッジの水和(アッセイ前日)
   1. センサーカートリッジをパッケージから取り出します。センサープレート(緑色)をウェルから取り外し、200μLのキャリブラント液を各ウェルにピペットで入れます。センサー・プレートをカートリッジ・プレートの上部に戻し、センサーがキャリブラント液に浸るようにします。
   2. カートリッジを非_CO2 加湿インキュベーター(37°C)に一晩置きます。
2. セルのめっき
   1. 96ウェル培養プレートで細胞を200 μLの培地に少なくとも1時間播種します。バックグラウンド測定のために、少なくとも1つのウェルをブランクのままにします(ブランクウェルには同じ量のメディアを使用します)。
      注:最適な細胞数は、実験前に決定する必要があります。詳細については、ディスカッションの「トラブルシューティングのヒント」を参照してください。
   2. アッセイを行う準備ができたら、代謝フラックス培地(すなわち、グルコース、グルタミン、ピルビン酸などを含まない基礎RPMIまたはDMEM)を調製します。解糖ストレス試験では、基礎培地に2 mMグルタミンが補充されていることを確認してください。ミトコンドリア負荷試験では、基礎培地に2 mMグルタミン、10 mMグルコース、および1 mMピルビン酸が補充されていることを確認してください。
   3. ゆっくりとピペッティングして、古い培地を新しい基礎培地と慎重に交換します(細胞が外れないように注意してください)。顕微鏡で細胞をチェックして、細胞がまだ存在することを確認します。
   4. 細胞プレートを非_CO2 加湿インキュベーター(37°C)に入れます。
3. フラックスプレートの装填
   1. インキュベーターから水和センサーカートリッジ/フラックスプレートを取り出します。
   2. 解糖系またはミトコンドリア負荷試験用の試験化合物を調製します。
      1. 解糖系:解糖系基礎培地を用いて、グルコースを3 mL、オリゴマイシンを270 μL(100 μM)、2-デオキシグルコースを3 mLに溶解してストック溶液を調製します。10 μM のオリゴマイシン溶液を調製します。
      2. ミトコンドリア:ミトコンドリア基礎培地を用いて、オリゴマイシンを630 μL(100 μM)、カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)を720 μL(100 μM)、ロテノン/アンチマイシンAを540 μL(50 μM)に溶解してストック溶液を作製します。オリゴマイシン(0.5-2.5 μM)、FCCP(0.125-2.0 μM)、およびロテノン/アンチマイシンA(0.5 μM)のワーキングソリューションを作成します。
         注:1.5 μM オリゴマイシンと 2.0 μM FCCP が最良の結果をもたらすことがわかりました。
   3. ポートA-20 μL、ポートB-22 μL、ポートC-25 μL、ポートD-27 μLの容量を使用して、試験化合物をポートAにロードし、ポートB、C、Dに試験化合物をロードして、解糖系またはミトコンドリア呼吸に対する急性の影響を評価します。追加の薬物または化合物を使用しない場合は、ポートDを空のままにします。
4. アッセイの実行
   1. ソフトウェアを開き、[ ミトコンドリア負荷テスト]を選択します。
      注:このプログラムは、細胞外酸性化率(ECAR)が測定されるため、解糖ストレステストにも使用できます。
   2. 使用するウェルを選択します。背景を差し引くには、少なくとも 1 つのウェルにセルがないことを確認します。
   3. プログラムを実行します。フラックスプレートを取り外した状態でロードし、プレートが校正されるようにします(~20分)。
   4. プレートのキャリブレーションが完了すると、ソフトウェアはセルプレートをロードするように促します。細胞プレートをインキュベーターから取り出し、フラックスプレートの底を取り外し、細胞プレートをホルダーに入れます。実行を押します。アッセイが完了するまでに~2.5時間かかります。
   5. 代謝フラックスソフトウェア⁷ またはその他の任意の分析ソフトウェアを使用して結果を分析します。

結果

さまざまな組織から得られる典型的な細胞数は、動物のサイズ、年齢、性別によって異なります。成体の雄マウス(すなわち、16週齢、~30g)の場合、脾臓は3.0〜4.0×10⁶個のマクロファージを産生するのに対し、骨髄(2つの脛骨と2つの大腿骨)は通常、1.0〜1.5×10⁶個の単球を産生します(図2A)。梗塞性心臓は、MI ^4,5,...

ディスカッション

私たちの方法は、骨髄、脾臓、および梗塞性心臓からのマクロファージの迅速な抽出を詳しく説明しており、その後、細胞外代謝フラックス分析などのダウンストリーム分析を実行するために使用できます。これら2つの方法の組み合わせは、さまざまな疾患や損傷状態、または運動などの代謝状態下でのマクロファージの代謝変化を定量化できる強力なツールです?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine