Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Özet

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Özet

Metabolik yeniden programlama, monosit / makrofaj aktivasyonunun ve pro- ve anti-inflamatuar durumlar arasındaki polarizasyonun ayırt edici bir özelliğidir. Örneğin, pro-enflamatuar (yani M1 benzeri) monositler / makrofajlar, anaerobik glikolize daha fazla ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyona daha az bağımlı olurken, anti-enflamatuar (M2 benzeri) makrofajlar, mitokondrideki glikoz ve yağ asidi oksidasyonuna daha fazla bağımlı olduğunu gösterir. Burada, vücuttaki iki ana monosit / makrofaj rezervuarı olan dalak ve kemik iliğinden ve ayrıca miyokard enfarktüsünü takiben kalp gibi yaralı dokulardan makrofajların çıkarılması için derinlemesine protokolleri açıklıyoruz.

Makrofajlar veya monositler, fenotiplerinden ödün vermeden hücrelere kolayca bağlanan antikor etiketli mikro boncuklar kullanılarak immünomanyetik sıralama ile ekstrakte edilir. Ekstrakte edilen hücreler daha sonra 96 oyuklu plakalarda kültürlenir, ardından bir metabolik akı analizörü kullanılarak hücre dışı akı analizi yapılır. Hem glikoliz hem de mitokondriyal oksidatif fosforilasyon, az sayıda hücrede (2-3 × 10⁵ hücre kadar az) aynı anda ölçülebilir. Bu yöntem 1 günde kolayca uygulanabilir ve güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar verir. Sonuç olarak, bu yöntemler, yaralanma ve hastalığa karşı bağışıklık ve inflamatuar yanıtlar sırasında metabolik değişiklikler hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olur ve bu da immünometabolik yollar için yeni terapötik hedeflerin geliştirilmesine yol açabilir.

Giriş

İmmünometabolizma, farklı patolojik hastalık ve yaralanma durumlarında bağışıklık hücrelerinde metabolik yeniden programlamanın rolünü inceleyen çiçek açan bir alandır. Makrofajlar, inflamasyon, enfeksiyona yanıt, antijen sunumu ve yara iyileşmesinde kritik rol oynayan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir parçasıdır¹. Makrofajların farklı hastalık durumlarında pro- ve anti-enflamatuar (M1 benzeri ve M2 benzeri) alt kümeler arasında nasıl polarize olduğunu anlamak, devam eden ve yoğun bir araştırma alanıdır. Son çalışmalar, metabolik yeniden programlamayı makrofaj polarizasyonunun altında yatan anahtar bir mekanizma olarak tanımlamıştır. Mevcut paradigma, genel olarak konuşursak, M1 benzeri makrofajların (tipik olarak monosit benzeri olan) pro-inflamatuar fonksiyonları beslemek için glikolize daha fazla dayandığı, M2 benzeri makrofajların ise pro-inflamatuar fonksiyonları bastırmak ve anti-inflamatuar süreçleri beslemek için mitokondriyal oksidatif fosforilasyona daha fazla güvendiğidir². Makrofaj metabolizmasının farklı hastalık durumlarında nasıl değiştiğini anlamak, metabolik yolları hedeflemek için kullanılabilecek potansiyel tedaviler hakkında fikir verebilir.

Örnek olarak, laboratuvarımız miyokard enfarktüsü (MI) sırasında makrofaj metabolik yeniden programlamasının rolünü kapsamlı bir şekilde araştırmıştır3,4,5. Makrofajlar, MI sırasında enflamatuar ve yara iyileşme yanıtında önemli bir rol oynar ve bu nedenle, enfarktüslü kalp, replasman skar dokusu oluşturmak üzere yeniden şekillenirken, M1 benzerinden M2 benzeri fenotiplere doğru polarizasyona uğrar. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, bu polarizasyonun glikoz ve glutamin metabolizmasında ve mitokondriyal fonksiyonda benzersiz değişiklikler ile karakterize olduğunu gösterdik. Kardiyak makrofajların yanı sıra splenik makrofajlar ve kemik iliği monositlerinin çıkarılması için kullanılan yöntemleri açıklıyoruz, bunlar tek bir günde ex vivo metabolik akıyı değerlendirmek için hücre dışı akı analizi ile birleştirilebilir. Açıklanan yöntemlerin, bu önemli konuyu inceleyen laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği artırmak için bağışıklık hücresi metabolik fenotiplerini değerlendirmek için standart bir yaklaşım sunmasını umuyoruz.

Protokol

Aşağıdaki yöntemler, makrofajların çıkarılması ve MI, dalak ve kemik iliğini takiben enfarktüslü kalpten metabolik akının ex vivo analizini yapmak için protokolleri açıklamaktadır (Şekil 1). MI kalp ve dalak için kullanılan ekstraksiyon yöntemi aynıdır. Fareleri içeren tüm protokoller, Mississippi Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol # 1371, Mouton) tarafından onaylandı.

1. Enfarktüslü kalp ve dalaktan makrofajların çıkarılması

NOT: Doku makrofajlarının ekstraksiyonu, önce Ly6G-mikroboncukları ile işaretlenmiş nötrofilleri çıkarmak için negatif bir seçim stratejisi ve daha sonra CD11b-mikroboncukları 3,4,5,6 ile makrofajları elde etmek için pozitif bir seçim stratejisi kullanır. Bu protokolü uygularken hızlı çalışın ve hücreleri soğuk tutun.

1. Fareyi AALAC ve kurumsal yönergelere uygun olarak izofluran doz aşımı ile ötenazi yapın ve ardından kalbin çıkarılması ile değiştirin.
2. Kalbi ve dalağı hızlı bir şekilde çıkarın ve dokuları tartın.
3. Testten önce, EDTA (2 mM) ve% 0.5 sığır serum albüminini (a/h) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözerek PEB tamponunu hazırlayın. Soğuk tutun.
4. Kalbi soğuk Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) yerleştirin. Steril bir neşter ile küçük parçalar halinde kıyın.
5. 600 U / mL kollajenaz tip II ve 60 U / mL DNaz tip I içeren bir sindirim çözeltisi hazırlayın. Dokuyu bir MACS hücre ayrışma tüpünde 10 mL sindirim çözeltisinde karıştırın.
   NOT: Her doku için (oda sıcaklığı) 10 mL kullanacak kadar sindirim solüsyonu yapın.
6. Üreticinin protokolüne göre hücre ayrıştırıcısını kullanarak dokuları inkübe edin. Bu, kıyılmış dokuyu 37 °C'de ~ 1 saat boyunca hafifçe eğirerek inkübe edecek ve bir hücre süspansiyonu oluşturacaktır.
7. Süspansiyonu 15 mL konik tüplere taşıyın ve 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
8. Peleti 1 mL PEB tamponunda yeniden süspanse edin. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için, süspansiyonu 30 μm'lik bir filtreye uygulayın.
9. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için 10 mL 1x kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
10. Süspansiyonu 300 × g boyunca 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
11. Peleti 1 mL PEB içinde yeniden süspanse edin ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın.
12. Süspansiyonu 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
13. Nötrofilleri çıkarmak için, 10⁷ hücre başına 90 μL PEB tamponunu 10 μL anti-Ly6G mikro boncuklarla karıştırarak mikroboncuklar hazırlayın. Hücre peletini mikro boncuk süspansiyonu ile karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
14. Bağlanmamış mikro boncukları yıkamak için 10 mL PEB tamponu ekleyin ve 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
15. Manyetik bir stand üzerinde manyetik sütunlar (MS veya LS) hazırlayın. 0.5-1.0 mL PEB tamponu ekleyerek sütunları ıslatın.
    NOT: Bol miktarda bağışıklık hücresi (yani dalak) olan dokular için, manyetik kolon kolayca tıkanabilir ve akışı durdurabilir. Bu nedenle, dalak için LS sütunlarını kullanmanızı öneririz.
16. Hücre peletini 500 μL PEB tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu manyetik kolona ekleyin ve etiketlenmemiş hücrelerin (yani nötrofil olmayanların) geçmesine izin verin. Kolonu 2x 500 μL PEB tamponu ile yıkayın. Etiketlenmemiş hücreleri (yani makrofajlar ve diğer hücreler) 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
17. Süspansiyonu 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
18. 10⁷ hücre başına 90 μL PEB tamponunu 10 μL anti-CD11b mikro boncuk ile karıştırarak mikro boncuklar hazırlayın. Hücre peletini mikro boncuk süspansiyonu ile karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
19. 1.13-1.15 arasındaki adımları tekrarlayın.
20. Etiketli makrofajlar manyetik kolona bağlanacaktır. Bunları toplamak için manyetik sütunu manyetik standdan ayırın ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpün üzerine yerleştirin.
21. Kolona% 0.1 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1 mL RPMI ortamı ekleyin. Makrofajları tüpe çıkarmak için pistonu kullanın. Bir hematitometre kullanarak makrofajları sayın.
    NOT: Makrofajlar artık tüpün içindedir ve daha sonraki tahliller için kullanıma hazırdır.

2. Kemik iliğinden monositlerin ekstraksiyonu

NOT: Monositlerin kemik iliğinden ekstraksiyonu, lenfositler, doğal öldürücü hücreler, dendritik hücreler, eritroid hücreler ve granülositler (yani nötrofiller) dahil olmak üzere monosit olmayanların immünomanyetik olarak etiketlendiği ve çıkarıldığı negatif bir seçim stratejisi kullanır.

1. Fareyi AALAC ve kurumsal yönergelere uygun olarak izofluran doz aşımı ile ötenazi yapın ve ardından kalbin çıkarılması ile değiştirin.
2. Bacakları fareden çıkarın. Soğuk HBSS'de, kemikler temiz olana kadar kası tibia ve femurdan uzaklaştırın.
3. Kemiğin her iki ucunu da dikkatlice kesin. 27 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, kemik iliğini PEB tamponlu 15 mL'lik konik bir tüpe boşaltın. Süspansiyonu 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
4. 1.8-1.12 adımlarını gerçekleştirin.
5. Toplam^{hücrelerin 5} ila 10 7'×si başına 175 μL PEB tamponu, 25 μL FcR bloke edici reaktif ve 50 μL monosit biyotin-antikor kokteyli ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 5 dakika inkübe edin.
6. 10 mL PEB tamponu ekleyerek yıkayın ve 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
7. Peletleri toplayın ve hücreleri 500 μL PEB tamponu ve 100 μL anti-Biotin mikro boncuklar içinde yeniden süspanse edin. Karanlıkta 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
8. Manyetik bir stand üzerinde manyetik sütunlar (LS) hazırlayın. 1.0 mL PEB tamponu ekleyerek sütunları ıslatın.
9. Hücre süspansiyonunu hemen sütuna uygulayın. Monositleri içeren akışı toplamak için 15 mL'lik bir tüp kullanın. Monosit olmayanlar manyetik kolona bağlanır.
10. Sütunu 2x 1 mL PEB tamponu ile yıkayın. Bir hemasitometre kullanarak monositleri sayın.
11. Monositleri bir sonraki adıma hazırlamak için 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Akı analizi için, hücre peletini 1 mL RPMI +% 0.1 FBS'de yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi için hücreleri soğuk PEB'de tutun ve boyamaya devam edin.

3. Metabolik akı analizi için hücrelerin hazırlanması

1. Sensör kartuşunu nemlendirin (testten bir gün önce)
   1. Sensör kartuşunu paketinden çıkarın. Sensör plakasını (yeşil) kuyulardan çıkarın ve her bir kuyucuğa 200 μL kalibrant sıvısı pipetleyin. Sensörler kalibant sıvısına daldırılacak şekilde sensör plakasını kartuş plakasının üstüne geri yerleştirin.
   2. Kartuşu gece boyunca CO₂ olmayan nemlendirilmiş bir inkübatöre (37 °C) yerleştirin.
2. Hücrelerin kaplanması
   1. Hücreleri en az 1 saat boyunca 200 μL ortamda 96 oyuklu bir kültür plakasında kaplayın. Arka plan ölçümleri için en az bir kuyuyu boş bırakın (boş kuyular için aynı hacimde ortam kullanın).
      NOT: En uygun hücre sayısı deneyden önce belirlenmelidir. Daha fazla ayrıntı için tartışmadaki "Sorun Giderme İpuçları" bölümüne bakın.
   2. Testi gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda, metabolik akı ortamını hazırlayın (yani, glikoz, glutamin, piruvat vb. içermeyen bazal RPMI veya DMEM). Glikoliz stres testi için bazal ortamın 2 mM glutamin ile desteklendiğinden emin olun. Mitokondriyal stres testi için bazal ortamın 2 mM glutamin, 10 mM glikoz ve 1 mM piruvat ile desteklendiğinden emin olun.
   3. Yavaşça pipetleyerek eski ortamı dikkatlice yeni bazal ortamla değiştirin (herhangi bir hücreyi yerinden çıkarmamaya dikkat edin). Hala mevcut olduklarından emin olmak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin.
   4. Hücre plakasını CO₂ olmayan nemlendirilmiş bir inkübatöre (37 ° C) yerleştirin.
3. Akı plakasının yüklenmesi
   1. Hidratlı sensör kartuşunu/akı plakasını inkübatörden alın.
   2. Test bileşiklerini glikoliz veya mitokondriyal stres testi için hazırlayın.
      1. Glikoliz: Glikoliz bazal ortamını kullanarak, glikozu 3 mL'de, oligomisin'i 270 μL'de (100 μM) ve 2-deoksiglukozu 3 mL'de çözerek stok çözeltileri oluşturun. 10 μM'lik çalışan bir oligomisin çözeltisi oluşturun.
      2. Mitokondriyal: Mitokondriyal bazal ortam kullanarak, oligomisin 630 μL'de (100 μM), karbonil siyanür-p-triflometoksifenilhidrazonu (FCCP) 720 μL'de (100 μM) ve rotenon/antimisin A'yı 540 μL'de (50 μM) çözerek stok çözeltileri oluşturun. Oligomisin (0.5-2.5 μM), FCCP (0.125-2.0 μM) ve rotenon / antimisin A (0.5 μM) için çalışma solüsyonları oluşturun.
         NOT: 1.5 μM oligomisin ve 2.0 μM FCCP'nin en iyi sonuçları verdiğini bulduk.
   3. Aşağıdaki hacimleri kullanarak test bileşiklerini bağlantı noktalarına yükleyin: bağlantı noktası A-20 μL, bağlantı noktası B-22 μL, bağlantı noktası C-25 μL, bağlantı noktası D-27 μL. İsteğe bağlı: Glikoliz veya mitokondriyal solunum üzerindeki akut etkileri değerlendirmek için ilacı veya tercih edilen bileşiği port A'ya yükleyin ve bileşikleri port B, C ve D'ye test edin. Ek ilaç veya bileşik kullanmıyorsanız, D portunu boş bırakın.
4. Tahlili çalıştırma
   1. Yazılımı açın ve Mitokondriyal Stres Testi'ni seçin.
      NOT: Bu program, hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ölçüldüğü için glikoliz stres testi için de kullanılabilir.
   2. Kullanılacak kuyuları seçin. Arka planı çıkarmak için en az 1 kuyuda hücre olmadığından emin olun.
   3. Programı çalıştırın. Plakanın kalibre edilmesi için akı plakasını kapak çıkarılmış olarak yükleyin (~20 dk).
   4. Plaka kalibre edildikten sonra, yazılım hücre plakasını yüklemek için bir istem verecektir. Hücre plakasını inkübatörden çıkarın, akı plakasının altını çıkarın ve hücre plakasını tutucuya yerleştirin. Çalıştır'a basın. Testin tamamlanması ~ 2.5 saat sürecektir.
   5. Metabolik akı yazılımı⁷ veya tercih edilen diğer analitik yazılımları kullanarak sonuçları analiz edin.

Sonuçlar

Farklı dokulardan elde edilen tipik hücre sayıları, hayvanın büyüklüğüne, yaşına ve cinsiyetine bağlıdır. Yetişkin bir erkek fare için (ör., 16 haftalık, ~ 30 g), dalak 3.0-4.0 × 10⁶ makrofaj verebilirken, kemik iliği (iki tibia ve iki uyluk kemiği) tipik olarak 1.0-1.5 × 10⁶ monosit verir (Şekil 2A). Enfarktüslü kalp, MI ^4,5,6 sonrası güne bağlı olarak tipik ol...

Tartışmalar

Yöntemimiz, makrofajların kemik iliğinden, dalaktan ve enfarktüslü kalpten hızlı bir şekilde çıkarılmasını detaylandırır ve daha sonra hücre dışı metabolik akı analizi gibi aşağı akış analizlerini gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu iki yöntemin kombinasyonu, farklı hastalık veya yaralanma durumları veya egzersiz gibi metabolik durumlar altında makrofajlardaki metabolik değişiklikleri ölçebilen güçlü bir araçtır. Yöntemimiz kemik iliği ve ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine